人cDNA第一链合成M-MLV酶联免疫分析
M-MLV逆转录酶 说明书
单体的分子量约为73kD，具有RNase H活性，无RNase的污染，可用于5kb以下第一链cDNA的合成。
产品来源：重组E.coli菌株,含有从莫洛尼氏鼠中克隆的莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MLV，Moloney
Murine Leukemia Virus）逆转录酶基因。
活性定义： 以poly(rA)为模板、oligo (dT) 为引物，在37°C条件下，10分钟内催化掺入1nmol的dTTP
3. 离心数秒使反应液聚集于PCR管底部。
4. 继续向上述反应液中加入以下试剂：
5×RT Buffer
4ul *注：也可以使用相对便宜的化学类试剂RNasafe（TIANGEN）
0.1 M DTT RNasin(40U/ul)*
2ul 代替RNasin，效果相同；由于RNasafe只在高温下起作用，需 1ul 在第一步中70℃保温之前加入，本体系中加入1ul即可。
产品纯度：200U的本酶和1ug的16S，23S rRNA在37℃下反应1小时，RNA的电泳条带不发生变化。 反应缓冲液：[5×RT Buffer] 250 mM Tris-HCl（PH 8.3），15 mM MgCl2，375 mM KCl. 反应条件：
z cDNA第一链的合成（反转录反应）：
1. 在无RNAase污染的PCR管中加入以下试剂，全量12ul：
Beijing Protein Institute (BPI) B-8 Airport Industrial Zone, Beijing, China, 101300
Tel: 86-10-80493132, Fax: 86-10-80485460
Oligo (dT)12-18(1ug/ul) 或随机引物（50-250ng）
cDNA第一链合成试剂盒
cDNA 第一链合成试剂盒操作方法1、逆转录反应（ 1）在无菌薄壁管中加入以下成份：Total RNA 0.5-1.0 μg(dN) 9 or oligo(dT) 18 100pmol（ 2）混匀后， 70℃变性 5min，将薄壁管迅速置于冰上冷却，然后依次加入以下成份：5×M-MLV Buffer 4μldNTPs（ 10mM each）RNasin 1μl 10U100mM DTTM-MLV Reverse Transcriptase 2μl 100UDEPC-treated water up to 20 μl（ 3）混匀后短暂离心，使用oligo(dT) 18 引物时在42℃，使用随机引物(dN) 9 时在37℃下温育 1 小时。
（4） 94 ℃ 5min 终止反应后，冰上冷却。
（5）合成的 cDNA第一链可直接用于 PCR扩增或进行其它下游操作。
2、 PCR扩增（ 1）在 PCR薄壁管中加入以下试剂Synthesized cDNA 2-5 μl10×PCR Buffer 2μlUpper primer 10pmolLower primer 10pmoldNTPs（10mM each）0.5 μlTaq DNA Polymerase 1.5UddH2O up to 20 μl（ 2）混匀后短暂离心，然后进行PCR扩增。
94℃预变性 2.5min 。
进入下列30~40 个循环（此扩增条件仅供参考）：94℃30s， 60℃ 45s ，72℃ 1min ~3min。
最后 72℃延伸 7min。
注意事项1、确保 RNA完整性及纯度。
RNA质量是决定合成cDNA第一链成功的关键因素，其纯度及完整性可由 OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检测。
较纯的 RNA 样品 OD260/OD280比值通常为 1.8-2.0 ，若该比值偏低，应进一步纯化。
真核生物RNA样品电泳图谱 28s 和 18s 的比值约为 2:1 ，否则，表明有 RNA降解。
cdna第一链合成所需要的引物
cdna第一链合成所需要的引物CDNA合成是一种在实验室中合成DNA的技术。
在合成CDNA的过程中，引物起着关键的作用。
引物是一种短链DNA或RNA序列，其序列与目标RNA 的反义序列互补。
通过引物的互补配对，CDNA链可以在反转录过程中产生。
在合成CDNA第一链时，需要使用两种引物，即逆转录引物和OLIGO（dT）引物。
逆转录引物是在典型的CDNA合成反应中使用的第一个引物，它通常由RNA 依赖的DNA聚合酶（例如M-MLV逆转录酶）合成。
逆转录引物的设计应囊括目标RNA的起始位点，以确保所有目标RNA分子都能够转录成CDNA。
OLIGO（dT）引物是用于合成mRNA的CDNA的第二个引物。
它是一种具有多个连续脱氧胸腺嘧啶（dT）的短链DNA序列。
这种引物通过与目标mRNA 的多聚腺嘌呤尾部互补，从而将其用作合成CDNA的起始点。
在实际实验中，通常会使用反转录引物和OlIGO（dT）引物的混合物来合成CDNA的第一链。
这是因为许多mRNA分子的5'端没有腺嘌呤残基，所以OLIGO（dT）引物无法与它们互补。
因此，在使用OLIGO（dT）引物无法反转录mRNA分子的情况下，反转录引物可以用于产生CDNA的第一链。
此外，在CDNA合成的过程中，还需要引物包含其他特定序列，以便于在后续实验中对CDNA进行扩增、检测等操作。
例如，引物的末端通常含有限制酶切位点，以便将CDNA放入载体中。
此外，引物还可以带有一组序列标签，如荧光标签或亲和标签，以便实现CDNA的可视化或纯化。
总结起来，合成CDNA第一链所需的引物包括逆转录引物和OLIGO（dT）引物，它们的序列应与目标RNA互补。
合成CDNA的引物设计应考虑目标RNA的特点，并可能包含特定的序列标签或限制酶切位点。
引物的选择及其设计对于成功合成CDNA的第一链至关重要，因此需要进行仔细的序列分析和合成策略的考虑。
上海英骏生物技术 M-MLV逆转录酶说明书
M-MLV逆转录酶说明书【货号】【规格】C28025-01110,000 单位C28025-014 50,000 单位C28025-021 200,000 单位浓度：200U/µl 保存于-20℃（勿除霜）【描述】莫洛尼氏鼠白血病毒逆转录酶（M-MLV RT）能以单链RNA或DNA为模板，在引物的引发下合成与模板互补的DNA链。
本逆转录酶是M-MLV的部分pol基因在大肠杆菌中的表达产物（1-3）。
使用M-MLV RT 可以合成长达7kb的第一链cDNA。
【组分】M-MLV逆转录酶5×第一链合成缓冲液[250mM Tris-HCl（pH8.3，室温），375 mM KCl，15mM MgCl2]0.1M DTT【保存缓冲液】20mM Tris-HCl（pH7.5），100mM NaCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.01%（v/v）NP-40，50%（v/v）甘油【保存条件】将所有的组分保存于-20℃冰箱（勿除霜）。
【额外的组分】仅在使用前将5×第一链合成缓冲液和0.1M DTT在室温解冻，用完后迅速重新冰冻。
RNaseOUT™重组核酸酶抑制剂（40单位/μl）可从Invitrogen单独订购（货号：10777-019）。
【使用M-MLV逆转录酶进行第一链cDNA的合成】建立20μl 的反应体系可以用于逆转录1ng～5μg总RNA或1～500ng mRNA1．将以下组分加入无核酸酶的微量离心管中1μl oligo(dT)12-18(500μg/ml)，或50–250ng随机引物或2pmole基因特异性引物1ng-5μg总RNA或1ng-500ng mRNA1μl 10mM dNTP混合物（dATP，dGTP，dCTP和dTTP均为10mM，pH中性）加入灭菌蒸馏水至12μl2．混合物在65℃加热5分钟后，迅速置于冰上冷却。
短暂离心后，加入以下组分：4μl 5×第一链合成缓冲液2μl 0.1M DTT1μl RNaseOUT™核酸酶抑制剂（40单位/μl）（注意：如果起始RNA的量小于50ng，则必须加入RNaseOUT™）3．在离心管中轻轻将各种成分混合，并在37℃下孵育2分钟。
酶联免疫反应的原理
酶联免疫反应的原理
酶联免疫反应（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）
是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析目标物（例如蛋白质、抗原或抗体）在样本中的存在和浓度。
酶联免疫反应的原理基于特定抗原与其对应的抗体的高度特异性结合。
典型的酶联免疫反应包括以下步骤：
1. 固定：首先，在固相（例如试管、酶标板等）表面上，直接或间接地固定特定抗原或抗体。
直接固定指将抗原或抗体直接吸附在固相上，而间接固定则需要先加入一种可与抗原或抗体结合的二抗。
2. 绑定：样本中的目标物与固定的抗体或抗原结合形成复合物。
如果样本中含有目标物，则目标物将与固定的抗体结合；如果样本中含有抗体，则抗体将与固定的抗原结合。
3. 洗涤：通过洗涤步骤去除未结合的物质，以减少非特异性背景信号。
4. 信号发生：添加与目标物结合的检测抗体。
检测抗体通常会与目标物不同的部位结合。
这个检测抗体可以是已标记的抗体，其标记物可以是酶（例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）等，也可以是免疫荧光、生物素/亲和素等。
5. 洗涤：再次通过洗涤步骤去除未结合的检测抗体。
6. 信号测定：将适合于检测的底物（例如染色底物、荧光底物或发光底物）添加到反应体系中，底物在酶的作用下产生可测量的信号。
酶标板读板仪等设备可测量这种信号的强度。
通过测量光学信号的强度，可以确定目标物在样本中的存在和浓度。
由于酶标记的检测抗体产生的信号可被放大，酶联免疫反应具有高灵敏度和特异性，被广泛用于医学诊断、生物学研究以及药物研发等领域。
RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法
RNA得提取与c DNA合成原理与实验方法第一节、概述从貞•核生物得组织或细胞中提取mRN A,通过酶促反应逆转录合成c DNA得第一链与第二链，将双链c DNA与载体连接，然后转化扩增，即可获得cDNA文库,构建得c DNA文库可用于真核生物基因得结构、表达与调控得分析：比较cDNA与相应基因组DNA序列差异可确立内含子存在与了解转录后加工等一系列问题。
总之cDNA得合成与克隆已成为当今真核分子生物学得基本手段。
自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来，已发展了许多种提高cDNA合成效率得方法，并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。
cDNA合成及克隆得基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链，聚合酶合成cDNA第二链，加入合成接头以及将双链DNA 克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。
一、RNA制备模板m RNA得质量直接影响到cDNA合成得效率。
由于mRNA分子得结构特点，容易受RNA酶得攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳左且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶得污染，并设法抑制其活性，这就是本实验成败得关键。
所有得组织中均存在RNA酶.人得皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换(使用一次性手套)。
所用得玻璃器皿需巻于干燥烘箱中2 0 0°C烘烤2小时以上。
凡就是不能用高温烘烤得材料如塑料容器等皆可用0、1 %得焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，再用蒸憎水冲净。
DEPC就是RNA酶得化学修饰剂，它U RNA酶得活性基团纟110酸得咪哇环反应而抑制酶活性。
DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。
试验所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至0、1 %浓度,然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或髙压火菌以消除残存得D EPC.否则DEPC也能与腺噪吟作用而破坏mRN A 活性。
但DEPC能与胺与兢基反应，因而含Tris与DTT得试剂不能用DEPC处理。
RACE技术的原理和操作
RACE技术的原理和操作RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术是一种用于扩增cDNA末端序列的方法，广泛应用于克隆和鉴定未知基因的研究中。
下面将详细介绍RACE技术的原理和操作步骤。
一、原理：RACE技术是通过逆转录反应将RNA转录成cDNA，然后利用特殊的引物设计，通过聚合酶链式反应（PCR）进行扩增，最终得到所需的cDNA末端序列。
RACE技术主要包括5'-RACE和3'-RACE两个步骤。
5'-RACE：用于扩增未知序列的5'端操作步骤：1.提取总RNA，并进行逆转录反应，得到第一链cDNA。
2.利用聚dT载体和逆转录酶进行第二链合成。
3.利用内源引物（如具有较高表达的基因的已知序列）和外源引物A 进行PCR扩增。
4. 应用Nested PCR进行第二轮扩增，内嵌引物（nested primer）会在前一轮PCR反应的基础上扩增更长的特异性产物。
5.得到扩增的特异性产物后，纯化PCR产物并进行测序分析，获得5'端的未知序列。
3'-RACE：用于扩增未知序列的3'端操作步骤：1.提取总RNA，并进行反转录反应。
2.利用特异性引物（如基因的已知3'端序列）和逆转录酶进行第一轮PCR扩增。
3. 利用Nested PCR进行第二轮扩增，内嵌引物（nested primer）会在前一轮PCR反应的基础上扩增更长的特异性产物。
4.纯化PCR产物并进行测序分析，获得3'端的未知序列。
二、操作：1. 提取总RNA：一般使用RNAiso Plus试剂或类似试剂从细胞或组织中提取总RNA。
2. 逆转录反应：利用逆转录酶将RNA转录成cDNA。
逆转录酶一般有M-MLV逆转录酶和SuperScript III等。
3.第一链合成：利用聚克隆酶将逆转录的cDNA合成第一链，即得到第一链cDNA。
4.第二链合成：利用特殊的引物和逆转录酶将第一链cDNA合成第二链。
酶联免疫反应的原理和步骤
酶联免疫反应的原理和步骤酶联免疫反应是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样品中的抗原或抗体。
它基于抗原与抗体之间的特异性结合，通过酶的催化作用使其产生可测量的信号。
本文将介绍酶联免疫反应的原理和步骤。
一、原理酶联免疫反应的原理基于抗原与抗体之间的特异性结合。
抗原是一种能够引起免疫系统产生抗体反应的物质，抗体则是由免疫系统产生的一种蛋白质分子。
在酶联免疫反应中，一种特定的抗体被固定在固相（如微孔板）上，待测样品中的抗原与固相上的抗体结合形成抗原-抗体复合物。
然后，另一种与抗体结合的酶标记抗体被加入，与抗原-抗体复合物结合。
最后，通过添加底物使酶催化产生可测量的信号，从而确定待测样品中的抗原或抗体的数量。
二、步骤1. 准备试剂和设备：包括微孔板、抗体、酶标记抗体、底物、洗涤缓冲液等。
确保试剂和设备的质量和保存条件符合要求。
2. 固相吸附：将特定的抗体溶液加入微孔板孔中，使其在孔壁上吸附。
然后，将孔壁上的未结合抗体洗涤掉，以减少非特异性结合。
3. 样品孔加样：将待测样品加入微孔板中，与固相上的抗体发生特异性结合。
对于检测抗体，待测样品即为抗原；对于检测抗原，待测样品即为抗体。
4. 酶标记抗体加样：将与酶标记抗体结合的抗体加入微孔板中，与抗原-抗体复合物结合。
这种酶标记抗体通常与较早加入的抗体具有不同的特异性。
5. 洗涤：将微孔板中的未结合抗体和其他杂质洗涤掉，以减少非特异性结合。
洗涤缓冲液的成分和洗涤次数应根据实验要求进行调整。
6. 底物加样：将含有底物的溶液加入微孔板中，酶催化底物产生可测量的信号。
底物的选择应根据酶的特性和实验要求进行。
7. 反应停止：通过加入反应停止剂，终止酶催化反应。
反应停止剂的选择应根据底物和酶的特性进行。
8. 信号检测：使用光谱仪、荧光仪或比色计等仪器检测底物催化产生的信号。
信号的强度与待测样品中目标物质的浓度成正比。
9. 数据分析：根据信号的强度和标准曲线，计算出待测样品中目标物质的浓度。
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人cDNA第一链合成(M-MLV)酶联免疫分析
试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T
20pg/ml-480pg/ml
使用目的：
本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中cDNA第一链合成(M-MLV)含量。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人cDNA第一链合成(M-MLV)水平。
用纯化的人cDNA第一链合成(M-MLV)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入cDNA第一链合成(M-MLV)，再与HRP标记的cDNA第一链合成(M-MLV)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的cDNA第一链合成(M-MLV)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人cDNA第一链合成(M-MLV)浓度。
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀
释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
10分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止
液后15分钟以内进行。
操作程序总结：
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
保存条件及有效期
1．试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月。