酶联免疫方法的原理及详细操作步骤
酶联免疫法的原理及其应用
酶联免疫法的原理及其应用1. 引言酶联免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术。
它利用酶标记的抗体或抗原与目标分子结合，并通过酶的催化作用产生可检测的信号。
本文将介绍酶联免疫法的原理及其在生物医学领域中的应用。
2. 原理酶联免疫法的原理基于免疫学和酶学的知识，其步骤如下：2.1 免疫吸附首先，将待测的抗原或抗体溶液加入到含有特异性抗体或抗原的固相载体上，通过免疫吸附反应使其结合。
2.2 洗涤洗涤的目的是去除非特异性的蛋白质，减少假阳性反应。
洗涤的过程需要严格控制条件，确保洗涤液与固相载体上的抗体或抗原结合的目标物质不发生非特异性结合或杂交。
2.3 酶标记将与待检测物相结合的酶标记抗体或抗原加入到固相载体上，形成夹心结构。
酶标记通常选择较常用的酶，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。
酶标记的抗体或抗原与固相载体上的目标物结合后，通过酶的催化作用将酶底物转化为可检测的产物。
2.4 显示通过加入底物使催化酶产生可检测的信号。
底物的选择与酶标记的种类有关，例如，如果选择辣根过氧化物酶（HRP）作为酶标记，则可以使用TMB（3,3’,5,5’-四甲基联苯胺）作为底物，形成可见的蓝色反应产物。
2.5 信号检测根据底物反应产物的颜色变化或发光信号的强度，使用光谱仪、读板仪或其他相关仪器检测信号。
3. 应用酶联免疫法广泛应用于生物医学研究和临床诊断中，包括以下几个方面：3.1 生物学研究酶联免疫法可以用于检测蛋白质、抗体、细胞因子等生物大分子的定量和定性分析。
在分子生物学研究中，酶联免疫法被广泛应用于检测基因表达水平、蛋白质相互作用、细胞信号通路等研究。
3.2 临床诊断酶联免疫法在临床诊断中具有高灵敏度和高特异性的优势。
例如，ELISA可以被用来检测某些病毒、细菌或其他病原体，如HIV、乙型肝炎病毒、结核菌等的感染。
酶联免疫吸附试验 elisa原理
酶联免疫吸附试验 elisa原理酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见的实验室技术，用于检测生物分子如蛋白质、抗体、荷尔蒙和病毒等。
ELISA技术基于抗原和抗体的特异性结合，通过酶标记物和底物的反应来检测分子的存在或浓度。
ELISA技术的原理可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA 和夹心ELISA等几种。
其中，间接ELISA是最常见的类型，下面将详细介绍其原理和步骤。
一、间接ELISA的原理间接ELISA利用抗体与抗原的特异性结合来检测分子的存在或浓度。
该方法需要用到两种抗体：第一种是特异性抗体，用于检测目标分子；第二种是酶标记抗体，用于检测第一种抗体的结合情况。
具体步骤如下：1. 将抗原溶液加入微孔板中，并在室温下孵育一定时间，使抗原吸附于微孔板表面。
2. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的抗原和杂质。
3. 加入一定浓度的非特异性蛋白质，如牛血清蛋白或奶粉，以防止非特异性结合。
4. 加入一定浓度的特异性抗体，使其与抗原结合。
5. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的抗体和杂质。
6. 加入一定浓度的酶标记抗体，使其与第一种抗体结合。
7. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的酶标记抗体和杂质。
8. 加入底物，使酶标记抗体产生颜色反应。
9. 测量吸光度，来确定目标分子的存在或浓度。
二、间接ELISA的优缺点间接ELISA具有以下优点：1. 可以检测极低浓度的分子，如病毒和荷尔蒙。
2. 可以同时检测多个样本。
3. 可以检测多种类型的生物分子，如蛋白质、抗体、荷尔蒙和病毒等。
4. 可以使用多种酶标记抗体，如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）和过氧化物酶（POD）等。
5. 可以使用多种检测方法，如发光、荧光和色谱法等。
间接ELISA的缺点包括：1. 检测过程需要多个步骤，比较繁琐。
2. 需要特异性抗体和酶标记抗体，成本较高。
3. 受到非特异性结合的影响，可能会出现假阳性结果。
三、间接ELISA的应用间接ELISA广泛应用于医学、生物学、生物工程和食品安全等领域。
酶联免疫法的原理
酶联免疫法的原理
酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测和定量测定特定物质（如蛋白质、抗原或抗体）在样本中的存在量。
酶联免疫法的基本原理是利用特异性抗体与待检测物质结合，将其固定在固相载体上，然后使用与特异性抗体结合的酶作为标记物，通过酶催化反应来检测待测物质的存在。
具体操作步骤如下：
1. 首先，在固相载体（例如酶标板）上涂覆抗原或抗体，形成固定的抗原或抗体层，这些抗原或抗体与待测物质具有特异性结合能力。
2. 然后，加入待测样本，待测物质（如抗原或抗体）会与固定在载体上的抗原或抗体结合形成复合物。
3. 接着，加入特异性抗体，该抗体与待测物质的其他位点结合，从而形成“夹心”式复合物（抗原-待测物质-特异性抗体）。
4. 洗涤步骤用于去除未结合的物质，避免干扰。
5. 加入与特异性抗体结合的酶标记抗体，通常是将酶与特异性抗体结合，从而形成酶标记复合物。
6. 再次洗涤步骤用于去除未结合的酶标记抗体。
7. 最后，加入酶底物，该底物在酶的催化作用下发生化学反应，产生发光、发色或发生其他可测量的信号。
8. 通过测量底物反应产物的信号强度，可以确定待测物质的存在量。
酶联免疫法具有灵敏度高、特异性好、批量检测能力强等优点，被广泛应用于医学诊断、生物技术研究以及食品安全等领域。
酶联免疫吸附的原理和步骤
酶联免疫吸附（ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，广泛应用于医学、生物学、生物化学、环境监测等领域。
它主要是通过酶标记抗体或抗原与待检测样品中的特定分子发生特异性反应，利用酶的催化作用来检测目标物质的存在量和浓度。
一、酶联免疫吸附的原理酶联免疫吸附的原理是基于免疫学和酶学的原理。
它利用抗体和抗原之间的特异性结合关系来检测待测物质的存在和浓度。
ELISA的原理主要分为两种类型：直接ELISA和间接ELIS A。
直接ELISA是将酶标记的抗体或抗原直接与待检测物质结合，然后用底物检测酶的活性，从而测定待检测物质的存在和浓度。
间接ELISA是将待检测物质与特异性抗体结合，再加入酶标记的二抗与第一抗体结合，最后用底物检测酶的活性，从而测定待检测物质的存在和浓度。
二、酶联免疫吸附的步骤酶联免疫吸附的步骤主要分为以下几个方面：1.涂层：将抗体或抗原涂在微孔板上，使其与微孔板表面结合。
2.阻断：用蛋白质或其他物质阻止非特异性结合。
3.样品加入：加入待测样品，使其与涂层的抗体或抗原发生特异性结合。
4.洗涤：用缓冲液洗去未结合的物质。
5.酶标记的抗体或抗原加入：加入酶标记的抗体或抗原，使其与待测物质结合。
6.洗涤：用缓冲液洗去未结合的物质。
7.底物加入：加入底物，使其与酶发生反应，产生可测量的信号。
8.停止反应：加入停止反应剂，停止底物的反应。
9.测量：用酶标仪或光度计测量信号的强度，从而计算出待测物质的存在量和浓度。
三、酶联免疫吸附的实际应用酶联免疫吸附在医学、生物学、生物化学、环境监测等领域都有广泛的应用。
1.医学应用：酶联免疫吸附可以检测血清中的病原体抗体，如乙肝病毒、艾滋病毒等；检测血清中的肿瘤标志物，如癌胚抗原、前列腺特异性抗原等；检测血液中的药物浓度，如抗生素、抗癌药物等。
2.生物学应用：酶联免疫吸附可以检测细胞因子、酶、蛋白质等生物分子的存在和浓度，用于研究生物学过程和疾病机制。
3.环境监测应用：酶联免疫吸附可以检测水、土壤、空气中的污染物，如重金属、有机物、农药等，用于环境监测和污染物的快速检测。
酶联免疫捕获法
酶联免疫捕获法是一种用于检测环境中病毒或细菌的方法，其基本原理是利用酶标记技术，将目标物质与特异性抗体结合，并通过酶催化底物显色反应，对显色的深浅进行测定和分析。
这种方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、分析时间短等优点。
具体操作过程如下：首先，将酶标记物和特异性抗体结合，形成复合物。
然后，加入捕获抗体，将复合物捕获，形成免疫复合物。
接下来，加入洗涤液清洗免疫复合物，去除未结合的物质。
最后，加入底物显色剂，在特定的波长下测定光密度值，即可判断出目标物质的存在与否。
这种方法可以用于检测多种病毒和细菌，如流感病毒、新型冠状病毒等。
通过改变酶标记物和特异性抗体的组合，还可以检测不同种类的物质。
此外，酶联免疫捕获法的灵敏度较高，能够检测到低浓度的目标物质。
同时，这种方法具有较高的特异性，能够避免干扰物质的干扰。
在应用过程中，酶联免疫捕获法也存在一定的局限性。
首先，这种方法不能用于现场检测，需要一定的时间和实验室条件。
其次，酶标记物的稳定性会影响检测结果，需要妥善保存和管理。
最后，这种方法需要一定的专业知识和技能，才能正确使用和解读结果。
总之，酶联免疫捕获法是一种具有广泛应用前景的方法，适用于多种病毒和细菌的检测。
虽然存在一定的局限性，但其特异性强、灵敏度高、操作简便、分析时间短的优点使其在疾病预防控制和公共卫生领域中具有重要作用。
在未来的发展中，随着技术的不断进步和应用领域的扩展，酶联免疫捕获法有望在更多领域得到应用。
酶联免疫反应的原理和步骤
酶联免疫反应的原理和步骤一、酶联免疫反应的原理酶联免疫反应是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析抗原或抗体的存在和浓度。
其原理基于抗原与抗体之间的特异性结合反应，通过将酶标记的二抗与特异性抗体结合形成免疫复合物，再利用酶的催化作用产生可定量检测的产物，从而实现对抗原或抗体的检测和定量。
酶联免疫反应的原理可以简单概括为以下几个步骤：1. 免疫吸附：将待测物（抗原或抗体）吸附在固相载体（如酶标板、磁珠等）上，使其与固相载体结合。
2. 阻断：为了防止非特异性结合，需要在免疫吸附之前或之后对固相载体进行阻断处理，通常使用牛血清蛋白（BSA）或牛血清白蛋白（BSA）来阻断非特异性结合位点。
3. 特异性结合：加入特异性抗体与待测物进行结合反应，形成抗原-抗体复合物。
4. 二抗结合：加入酶标记的二抗，该二抗与特异性抗体结合，形成二抗-抗原-抗体复合物。
5. 底物反应：加入底物，该底物受酶的催化作用产生可定量测量的产物。
常用的底物有TMB（三甲基苯胺）、ABTS（2,2'-联氨基丙烷磺酸）等。
6. 反应终止：加入适当的反应终止液，停止底物反应过程。
7. 测量：通过光度计或荧光计测量产物的光吸收或荧光强度，以反映抗原或抗体的浓度。
二、酶联免疫反应的步骤酶联免疫反应通常包括以下几个步骤：1. 表面处理：将固相载体（如酶标板）表面进行处理，以增强待测物的吸附能力和特异性结合。
常用的方法有物理吸附、化学共价结合、亲和结合等。
2. 阻断处理：为了防止非特异性结合，需要对固相载体进行阻断处理，通常使用牛血清蛋白（BSA）或牛血清白蛋白（BSA）来阻断非特异性结合位点。
3. 特异性结合：加入待测物（抗原或抗体），与固相载体上的特异性抗体进行结合反应，形成抗原-抗体复合物。
4. 二抗结合：加入酶标记的二抗，该二抗与特异性抗体结合，形成二抗-抗原-抗体复合物。
5. 底物反应：加入底物，该底物受酶的催化作用产生可定量测量的产物。
elisa酶联免疫原理
elisa酶联免疫原理ELISA是一种高效、灵敏和特异性酶联免疫测定技术，用于检测生物样品中的抗原或抗体。
接下来，本文将详细讲解ELISA酶联免疫原理，并介绍其应用和优势。
一、酶联免疫原理ELISA酶联免疫的原理是通过抗原与特异性抗体的免疫反应，实现生物样品中化学物质的检测。
整个ELISA酶联免疫过程包括以下步骤：样品制备：首先，需要将待检测的生物样品进行制备处理，目的是提取生物样品中的抗原或抗体。
涂层：在免疫板的孔中加入特异性抗体，然后将免疫板放入孔中，允许特异性抗体与免疫板结合。
这样，免疫板就成为了涂层。
检测物添加：将待检生物样品加入免疫板孔内，使免疫原与特异性抗体结合。
缓冲液清洗：使用缓冲液清洗免疫板孔，以去除生物样品中未与特异性抗体结合的免疫原。
检测抗体添加：将酶偶联的特异性抗体加入免疫板孔，允许特异性抗体与已结合的生物样品中的免疫原结合。
底物添加：通过底物的添加，允许酶催化产生颜色或荧光等信号，使我们能够判断免疫原的存在或数目。
二、ELISA的应用由于ELISA酶联免疫技术对于抗原抗体的检测十分敏感和特异，因此应用广泛。
以下是一些常见的ELISA应用领域：1. 临床使用：ELISA酶联免疫技术在临床实验室中广泛应用，用于检测各种疾病和疫苗的抗体反应。
例如，ELISA酶联免疫技术可以用于艾滋病、乙肝、流感等病毒性疾病的抗体检测。
2. 生物学研究：ELISA酶联免疫技术不仅用于检测天然免疫反应，还可用于检测特异性免疫应答，如细胞因子、趋化因子等蛋白的检测。
3. 农业生产：用于畜牧业上的ELISA检测技术，如检测动物血清中病原体抗体的含量，以确定所检测动物感染疫病的情况。
4. 食品工业：ELISA酶联免疫技术还可以用于检测食品中潜在的过敏原和食物中的化学残留物。
三、ELISA的优势1. 灵敏度高：ELISA检测技术对于检测非常少量的特异性抗体具有高度灵敏度。
基于这一特性，ELISA常常用于疫苗接种后，检测患者抗体反应是否良好。
酶联免疫吸附实验ppt课件
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第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
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工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
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不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用， 包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包 被法。
亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方 法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。 脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加 入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然 干固在固相表面。
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3. ELISA的试剂(A、B、C三部分 )
ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液
优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少 ，仅为直接包被的1/10乃至于/100。
（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；
（3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。
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2.2.1 双抗体夹心法测抗原
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、 AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和 制备酶结合物而建立此法。
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2.2.4 竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用 此法检测特异性抗体。
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2.2.5 竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双 抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和 一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合 在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等 ELISA测定多用此法。
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ELISA的试剂准备A
固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附 其上后仍保留原来的免疫学活性。
聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高 。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间 、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。
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1.4 免疫测定在临床检验中的应用
由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血 清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因 此免疫测定的应用范围极广。
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2 ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必 要的试剂：
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1.1.2 特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构 和空间构型互补关系，具有高度的特异性。
测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
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1.1.3 最适比例
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1.1.4 敏感性
化学比色法的敏感度为mg/ml水平 酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿 标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平 例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。
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酶免疫测定类型
酶免疫组化
酶免疫技术
均相酶免疫测定
酶免疫测定
固相酶免疫测定 非均相酶免疫测定
液相酶免疫测定
这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（ Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA。
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1.1 抗原抗体反应
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2.2.2 双抗原夹心法测抗体
用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释， 可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗 HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原 结构的不同，寻找合适的标记方法。
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2.2.3 间接法测抗体
传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗 体建立检测相应抗体的方法。
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3.1.2 包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子 结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是 非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质 较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附包被法测抗体
IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血 清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的 IgM）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。
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2.2.7 ABS-ELISA法
①：固相支持物； ②：样品； ③：特异性IgG； ④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）； ⑤：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）； ⑥：DAB显色液； ⑦：显色；
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酶联反应知识简 介
03/11/15
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1. ELISA的原理 2. ELISA的类型 3. 试剂准备：免疫吸附剂
结合物 酶底物的准备 4. 对照设定 5. 标本的采取和保存 6. 结果判断
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1. ELISA的原理
ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA） 。基础:抗原或抗体的 固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成 为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性 或定量分析。
1.1.1 可逆性
抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应 式为：
Ag+Ab→Ag·Ab
抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／ [Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点 与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解 离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。