甘薯盐胁迫诱导IbDEAD1基因的克隆、生物信息学及表达分析

甘薯盐胁迫诱导IbDEAD1基因的克隆、生物信息学及表达分析朱明库;孟小庆;蔡敬;李格;李宗芸【摘要】DEAD-box解旋酶是植物中最大的解旋酶家族,不仅在几乎所有涉及DNA/RNA代谢的细胞过程中发挥关键作用,而且还广泛参与植物生长发育与胁迫响应过程.目前,甘薯中有关DEAD-box基因的功能研究尚未见报道.本研究以耐盐性品种徐薯22与盐敏感性品种徐薯32为研究材料,通过RNA-seq及生物信息学分析,首次从甘薯中筛选出一个受盐胁迫诱导的DEAD-box基因,命名为IbDEAD1.根据转录组分析的测序结果设计引物,从徐薯22中克隆出该基因的全长序列（GenBank登录号：MF043568）.序列分析表明,IbDEAD1基因包含一个1 701bp的开放阅读框,编码566个氨基酸.序列分析显示IbDEAD1蛋白具有一个DEAD-box蛋白典型的解旋酶中心和多个磷酸化位点,且为DEAD-box RNA解旋酶.系统进化树及qRT-PCR分析均表明,IbDEAD1基因可能在甘薯盐胁迫响应过程中发挥重要作用.这些结果为进一步研究IbDEAD1基因在甘薯盐胁迫响应中的功能奠定了基础.【期刊名称】《江苏师范大学学报：自然科学版》【年(卷),期】2017(035)003【总页数】7页(P23-29)【关键词】甘薯 DEAD-box解旋酶生物信息学表达分析【作者】朱明库;孟小庆;蔡敬;李格;李宗芸【作者单位】江苏师范大学生命科学学院/江苏省药用植物生物技术重点实验室,江苏徐州221116【正文语种】中文【中图分类】Q812作为固着生物,植物经常会遭受各种环境胁迫,如高盐、干旱、低温、紫外线等,这可能会导致脂质、蛋白质和DNA损伤,从而减弱植物基因组的稳定性,严重影响植物的生长与产量[1-2]．然而,有些植物品种已经进化形成特定的分子、细胞和生理机制,能够经受这些环境逆境．例如,解旋酶(helicase)在应对DNA损伤修复中扮演着重要角色．DEAD-box解旋酶是最大的解旋酶家族,广泛存在于从病毒到人类几乎所有已知生物体中,其通过催化双链DNA/RNA的解旋,在复制、重组、转录、翻译和修复等遗传过程中均发挥重要作用[3]．RNA解旋酶主要参与了RNA结构形成的调控活动,包括RNA的复制、转录、剪接、蛋白质翻译、mRNA的输出及其稳定性等过程[4-5]．DNA解旋酶是促使双螺旋DNA解旋的驱动蛋白,参与了DNA 的复制、重组及修复[6].解旋酶的典型特征是含有一个保守的解旋酶中心,包含了8个或9个特征性的保守基序(motif)．DEAD-box解旋酶由Linder等[7]首次发现,并根据基序Ⅱ中的氨基酸序列DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)而命名,而根据基序Ⅱ氨基酸序列的差异,DEAD-box家族蛋白又可分为DEAD,DEAH和DEXH/D[8-10]．已有研究表明,DEAD-box解旋酶除具有持家基因功能外,还广泛参与植物生长发育过程．因为DEAD-box蛋白参与RNA代谢等过程,因此在胚胎发育中必不可少,比如拟南芥AtRH7基因突变体表现出短根及根分支变少,同时胚胎和子叶发育异常[11]．拟南芥ABO6(ABA overly sensitive)基因编码一个DEXH-box RNA解旋酶,该基因突变体的线粒体中会积累更多的活性氧(ROS),ROS则进一步介导了生长素和脱落酸之间的相互作用,而这个互作调控了主根的生长和种子的发芽[12].除此之外,近年研究表明,DEAD-box解旋酶还广泛参与了植物对生物及非生物胁迫的响应．自从Seki等[13]首次发现冷诱导的解旋酶基因FL2-5A4,第1次表明解旋酶可能在胁迫应答中的新功能,10多年来,研究人员通过对拟南芥、水稻、番茄等植物中解旋酶基因的功能研究表明,DEAD-box解旋酶在多种生物及非生物胁迫响应中均发挥重要作用[14-15]．拟南芥STRS1/2基因编码DEAD-box RNA解旋酶,使突变体strs1和strs2的抗盐性增强,突变体中RD29A,DREB1A及DREB2A等胁迫响应基因的表达均高于野生型[16]．水稻SUV3蛋白同时具有DNA和RNA 解旋酶活性,超表达SUV3基因的水稻耐盐性和抗旱性增强,同时产量不受影响[17]．另外,在CBF-COR冷胁迫应答途径中,DEAD-box解旋酶基因LOS4-1能够抑制、而LOS4-2则促进CBFs及其下游靶基因的表达,说明LOS RNA解旋酶在mRNA的输出、生长发育以及对温度的胁迫响应中都发挥重要作用[18-19]．之前我们研究发现,超表达SlDEAD31基因的番茄植株对盐和干旱胁迫的耐受性增强,胁迫下转基因植株存活率更高,而MDA含量降低[15]．以上发现为将来利用DEAD-box解旋酶的“DNA/RNA解旋”功能来改良植物对各种生物及非生物胁迫的耐受性,进而提高作物产量提供了可能．然而,在真核生物中,许多信号转导途径被环境胁迫所激活,很难确定解旋酶在复杂的信号转导网络中的具体位置．因此,由解旋酶介导的胁迫应答机制仍待进一步研究．甘薯(Ipomoea batatas (L.) Lam.)不仅可以作为粮食、饲料和工业原料,还是重要的新兴能源和高效保健作物．我国甘薯的栽培面积和产量均居世界首位,总产量仅次于水稻、小麦和玉米．长期以来,甘薯在我国一直充当着抗灾救荒及保命粮的角色,是保证粮食安全的底线作物[20]．与其他主要农作物相比,大部分甘薯品种具有耐盐碱、抗旱、耐贫瘠等特性,不存在“与人争粮、与粮争地”的问题,因此，可作为盐碱地粮食和能源作物加以开发利用．鉴于此,了解甘薯抵御盐胁迫的应答机制将会为培育高耐盐甘薯新品种(品系)奠定基础．目前,有关甘薯中DEAD-box基因的相关研究尚无报道,GenBank中也未见有甘薯DEAD-box基因的注册信息．为此,本研究利用耐盐性品种徐薯22与盐敏感性品种徐薯32在盐胁迫处理下的RNA-seq数据,首次从甘薯中筛选出一个盐胁迫诱导的DEAD-box基因,命名为IbDEAD1．根据转录组分析的测序结果设计引物,从徐薯22中克隆出该基因的全长序列,并在NCBI中完成注册(GenBank登录号:MF043568)．本研究通过对IbDEAD1基因进行系统的生物信息学分析,同时利用qRT-PCR的方法检测其对盐胁迫处理的响应特性,旨在为进一步研究甘薯IbDEAD1基因在盐胁迫响应中的功能和作用机制奠定基础．1.1 材料及主要试剂本研究利用实验室已完成的耐盐性品种徐薯22与盐敏感性品种徐薯32在盐胁迫处理下的RNA-seq数据筛选出IbDEAD1基因．盐胁迫响应分析实验中,选取大小一致、发育健康的徐薯22茎蔓在1/4浓度的霍格兰培养液中水培生根,培养条件为16 h光照(28 ℃)/8 h黑暗(26 ℃)．培养10 d后选取根系健康、长势接近的植株进行盐胁迫处理．通过在霍格兰溶液中加入200 mmol/L的NaCl,分别于处理后1，3，6，12，24，48，72 h收取根组织样品,对照组用不含NaCl的霍格兰溶液培养．所收取的鲜样迅速用液氮冷冻,放置于-80 ℃冰箱保存备用．基因克隆所需的Trizol试剂、PrimeScript反转录酶、PrimeSTAR® HS DNA聚合酶、pMD19-T-vector,qRT-PCR分析所需的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ均购自大连宝生物(TakaRa)公司．DNA marker、氨苄青霉素(Amp)为Sigma公司产品．大肠杆菌菌种DH5α,由江苏省药用植物生物技术重点实验室保存．1.2 方法1.2.1 甘薯盐胁迫处理RNA-seq数据中DEAD-box基因的筛选通过用关键词“DEAD”和“helicase”在实验室已完成的耐盐性品种徐薯22与盐敏感性品种徐薯32的盐胁迫处理(150 mmol/L NaCl处理1 d)RNA-seq数据中进行检索,搜索到的所有序列信息通过生物信息学的方法进一步筛选,只有包含了解旋酶所具有的典型解旋酶中心的序列才被选出用于下一步对比分析．1.2.2 IbDEAD1基因的PCR扩增、克隆及测序以培养的徐薯22植株的根、茎和叶组织混合取样,按照Trizol试剂操作说明书提取总RNA,并合成cDNA第一链．根据RNA-seq数据库中c60154.graph_c0的序列信息设计引物F-IbDEAD1-F/R(表1),引物由上海生工生物工程股份有限公司合成．PCR步骤如下:在0.2 mL离心管中分别加入20 μL ddH2O,25 μL PrimeSTAR HS(Premix),2 μL cDNA模板及F-IbDEAD1-F/R引物各1.5 μL,于98 ℃ 10 s,58 ℃ 5 s,72℃ 2 min,30个循环．琼脂糖凝胶电泳检测后,目的片段连接到pMD-19-vector后,送上海英骏生物技术有限公司测序．1.2.3 IbDEAD1基因生物信息学分析核苷酸翻译、保守结构域检索等在NCBI网站上进行;应用CBS,ExPASy,SMART,PredictProtein和PSORT等综合软件包,预测分析IbDEAD1蛋白的理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位和磷酸化位点等;利用ClustalX及DNAMAN软件进行序列多重比对分析,MEGA软件构建NJ系统树,参数为bootstrap replicates 1 000,poisson model及pairwise deletion．1.2.4 qRT-PCR表达分析设计合成IbDEAD1基因的定量分析特异性引物Q-IbDEAD1-F/R(表1),分别以对照和盐胁迫处理下的植株cDNA为模板,以甘薯Tubulin为内参基因,以ABI StepOne Plus仪器进行qRT-PCR分析．具体步骤如下:在0.1 mL八联管中分别加入3.2 μL ddH2O,5μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ,1μL cDNA模板及F-IbDEAD1-F/R引物各0.4 μL,反应程序为95 ℃ 30 s,然后95 ℃ 5 s,60 ℃ 60 s,40个循环,再进行融解曲线分析．所有样品均进行NRT(no reverse transcription control)和NTC(no template control)分析．数据采用单因素方差分析(ANOVA),差异显著性分析采用Dunnett’s test.2.1 甘薯盐胁迫响应IbDEAD1基因的筛选从徐薯22盐处理根/徐薯22盐对照的RNA-seq数据中,筛选到一条ID为c60154.graph_c0的基因序列,Swissprotein注释为DEAD-box RNA helicase(表2),经进一步的生物信息学分析确认,其包含有解旋酶所具有的典型解旋酶中心．因目前有关甘薯中DEAD-box基因的相关研究尚无报道,GenBank中也未见有甘薯DEAD-box基因的注册信息,因此将其命名为IbDEAD1．RNA-seq分析显示,IbDEAD1基因受盐胁迫处理的诱导水平为2.62倍,暗示其可能参与甘薯盐胁迫响应．2.2 IbDEAD1基因的生物信息学分析2.2.1 IbDEAD1基因及所编码蛋白的理化性质分析测序结果表明，IbDEAD1基因开放阅读框长度为1 701 bp,编码566个氨基酸(图1)．IbDEAD1基因编码一个分子量为62.09 kD的蛋白,理论等电点pI为8.32,说明为碱性蛋白．其中负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)65个,正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)69个,分别占总氨基酸含量的11.48%和12.19%．应用ProtScale程序的Hphob./Kyte & Doolittle算法,预测IbDEAD1蛋白的平均疏水性为-0.164,表明其为亲水性蛋白,由图2可知，第282位的Glu亲水性最强(-2.967),第337位的Ala疏水性最强(2.311)．分析蛋白的跨膜结构域对正确认识该蛋白的功能有重要指示意义.TMpred程序的预测结果表明,在IbDEAD1蛋白的第85～106位aa区域内具有跨膜结构．NetPhos 3.1磷酸化位点预测显示,IbDEAD1蛋白有39个Ser磷酸化位点、13个Thr磷酸化位点和3个Tyr磷酸化位点,这些磷酸化位点的存在说明IbDEAD1蛋白的翻译后磷酸化修饰在其功能实现中起着重要作用．蛋白的亚细胞定位与该蛋白所执行的功能是密切相关的．通过PSROT程序对IbDEAD1蛋白进行亚细胞定位分析,结果显示,该蛋白可能定位于细胞核(表3),这与Plant-mPLoc的预测结果相一致,进一步验证了预测结果的可信度．2.2.2 IbDEAD1蛋白二级结构、保守结构域及蛋白序列同源比对分析分析蛋白的高级结构对理解某蛋白结构与功能的相关性有重要指导意义．SOPMA预测分析表明，IbDEAD1蛋白含43.11%的α螺旋,11.13%的β转角，18.55%延伸和27.21%无规卷曲．通过ScanProsite功能域分析表明,IbDEAD1蛋白具有一个DEAD-box解旋酶典型的解旋酶中心,由2个蛋白结构域组成,即解旋酶超家族结构域(DEXDc)和C末端结构域(HELICc,图1A)．IbDEAD1蛋白序列的多重序列比对分析表明,其与已知植物的DEAD-box蛋白序列具有很高的相似性(图1B),与牵牛花InDEAD22蛋白(XP_019170808)的序列相似性达到97.7%，与土豆StDEAD22蛋白(XP_006355937)的相似性为72.9%．另外,研究表明解旋酶中心包含有多个特征性的保守基序(motif),正因这些基序的存在,赋予了解旋酶的典型特征[8]．其中,基序Ⅰ对于ATP酶活性和解旋酶活性的实现至关重要,DNA解旋酶含有经典的基序Ⅰ(G-X-X-X-X-G-K-T),RNA解旋酶含有变异的基序Ⅰ(A-X-X-X-X-G-K-T)[21]．多序列比对显示,IbDEAD1蛋白的基序Ⅰ为“AETGSGKT”,基序Ⅱ为“DEAD”,因此，属于DEAD-box RNA解旋酶家族的DEAD类群．然而,IbDEAD1蛋白并没有DEAD-box解旋酶中保守的基序Ⅲ(SAT),说明IbDEAD1蛋白中基序Ⅲ的保守性较差．2.2.3 IbDEAD1蛋白的系统进化树构建为了揭示甘薯IbDEAD1蛋白与其他植物DEAD-box解旋酶的进化关系,20个来自拟南芥、水稻、豌豆等已报道的DEAD-box解旋酶被筛选出来进行进化树构建．图3A显示,IbDEAD1蛋白与HVD1，AtRH3以及OsBIRH1等同在一个亚组,研究发现，HVD1基因能够被低温和盐胁迫诱导表达[22],AtRH3基因被证实参与了拟南芥叶绿体发育以及盐胁迫耐力[23],而OsBIRH1基因在病原菌感染与氧化胁迫耐力方面扮演着重要角色[24],这意味着IbDEAD1基因在甘薯中也可能具有相似的功能．另外,根据已有的文献报道,各个基因的可能功能总结于图3B中．2.3 IbDEAD1基因对盐胁迫处理的表达分析我们从盐胁迫处理下的RNA-seq数据中筛选出盐胁迫诱导的IbDEAD1基因,同时生物信息学分析也显示IbDEAD1基因可能参与盐等非生物胁迫响应过程．随后,我们通过qRT-PCR验证IbDEAD1基因对盐胁迫处理的响应特性,结果表明，盐胁迫能够显著诱导IbDEAD1基因的表达(图4),这与RNA-seq数据相一致,进一步暗示其可能与甘薯耐盐性密切相关．自从1976年DNA解旋酶第1次从原核生物大肠杆菌及1978年第1次从真核生物百合植物中被发现,到目前为止已从许多物种中分离出数目众多的解旋酶[25],这为该家族基因在甘薯中的研究提供了理论和实践依据．已有研究证实,有些解旋酶在植物生长发育以及胁迫应答等方面发挥重要作用[3]．然而,目前DEAD-box解旋酶在植物逆境应答等方面的功能研究依然处于起步阶段,其参与的胁迫应答机制仍待进一步研究．有关DEAD-box解旋酶在植物中的功能研究主要局限于模式植物拟南芥和水稻中,甘薯作为保证我国粮食安全的底线作物,其重要性不言而喻．当前,科学家正寻求提升甘薯耐盐等非生物胁迫抗性的生物技术途径,其分子生物学研究主要集中在以下几个方面:1) 抗氧化系统．比如,超表达甘薯POD基因swpa4提高了烟草POD活性,并增强了其对高盐、干旱及MV等胁迫的抗性[26]．2) 胁迫诱导蛋白的合成．Park等[27]从甘薯脱水处理纤维根EST表达文库中分离到LEA14蛋白,超表达LEA14的转基因甘薯愈伤耐盐性和抗旱性增强,沉默LEA14的转基因愈伤则相反．3) 离子、代谢物的积累与渗透调节(细胞膜保护系统)．超表达SOS的转基因甘薯耐盐能力明显增强,盐胁迫处理下其长势更好、生根能力更强[28]．4) 转录因子调控．比如转IbMYB1基因的土豆对盐和干旱胁迫的抗性增强[29]．值得注意的是,DEAD-box解旋酶能够通过调控“DNA/RNA解旋”的方式来提升植物抵御环境逆境的能力,这可能为培育植物抗逆新品种开辟了一条新途径[3]．然而,当前有关甘薯中DEAD-box基因的相关研究尚无报道．本研究利用耐盐性品种徐薯22与盐敏感性品种徐薯32在盐胁迫处理下的RNA-seq数据,首次从甘薯中筛选出一个盐胁迫响应的DEAD-box基因,命名为IbDEAD1．随后对IbDEAD1基因进行了系统的生物信息学分析和预测,结果表明,IbDEAD1基因编码的蛋白含有DEAD-box解旋酶都具有的解旋酶中心,同时包含有解旋酶超家族结构域和C末端结构域[30]．多重序列比对显示,IbDEAD1与其他已知植物的DEAD-box蛋白序列具有高度相似性,且属于DEAD-box RNA解旋酶家族的DEAD类群．然而,IbDEAD1蛋白并没有保守的基序Ⅲ,该基序与RNA解链有关[8],说明IbDEAD1蛋白中基序Ⅲ的保守性较差,这可能与其功能的特异性有关．另外,磷酸化位点预测显示,IbDEAD1蛋白具有多个Ser、Thr和Tyr磷酸化位点,说明IbDEAD1蛋白的翻译后磷酸化修饰在其功能实现中起着重要作用．根据已有研究成果,解旋酶蛋白的翻译后磷酸化修饰可能是其参与胁迫应答的途径之一,从而在转录或翻译水平上调控基因的表达[3,14]．在玉米中发现缺氧胁迫可通过EIF-4A的磷酸化来抑制翻译起始[31]．而由蛋白激酶C介导的磷酸化则增强了豌豆PDH47的DNA解旋酶和ATP酶活性[32]．这些生物学参数为进一步研究IbDEAD1蛋白的酶学性质及其在甘薯中的作用机理奠定了理论基础．另外,在植物中,已有研究证实DEAD-box RNA解旋酶对不同的胁迫条件都有响应,如豌豆DEAD-box RNA解旋酶基因PDH45和PDH47的表达均能被盐、低温和ABA诱导,随后的转基因实验证实它们的超表达均能提高转基因植物的盐胁迫耐力[32-33]．我们发现IbDEAD1基因的表达受盐胁迫处理的显著诱导,暗示其在甘薯盐胁迫响应中发挥重要作用．目前,植物转基因抗性育种方面的研究已经取得很大进展,但许多目的基因的功能趋于单一化,对转基因植株抗性的提升有限．因此,胁迫诱导型DEAD-box基因在胁迫响应途径中的调控功能为分子抗性育种提供了更为合理和高效的基因工程策略．甘薯作为重要的粮食、工业原料和新兴能源作物,其IbDEAD1基因的分子克隆、生物信息学以及对盐胁迫处理的响应特性的分析,为继续深入研究甘薯IbDEAD1基因在盐胁迫响应中的功能和分子调控机理奠定了基础．【相关文献】[1] Tuteja N,Ahmad P,Panda B B,et al.Genotoxic stress in plants:shedding light on DNA damage,repair and DNA repair helicases[J].Mutat Res,2009,681(2):134.[2] Schützendübel A,Polle A.Plant responses to abiotic stresses:heavy metal-induced oxidative stress and protection by mycorrhization[J].J Exp Bot,2002,53(372):1351.[3] Vashisht A A,Tuteja N.Stress responsive DEAD-box helicases:a new pathway to engineer plant stress tolerance[J].J Photochem Photobiol B:Biology,2006,84(2):150.[4] Tuteja N.Plant DNA helicases:the long unwinding road[J].J Exp Bot,2003,54(391):2201.[5] Phan T N,Ehtesham N Z,Tuteja R,et al.A novel nuclear DNA helicase with high specific 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