培养基管理程序
组织培养实验MS培养基及配制注意事项
一、MS培养基母液的配制注意：1．除CaCl2·2H2O单独配制外，大量元素按照使用时高10倍的数值称取，将各种化合物称量后，分别用少量水在不同的容器内充分溶解，然后在500ml烧杯中按顺序加入各溶液，加适量蒸馏水，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。
2．微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签。
3．铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。
4．有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。
5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。
A.制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。
B.称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。
二、培养基配制和灭菌一．养培养基配制程序(一).母液吸取量的计算配制培养基的升数母液吸取量= 母液体积（CC）×——————————母液浓缩倍数（二）各种母液按顺序编号排列A.大量元素；B.CaCl2.2H2O；C.微量元素；D.铁盐；E.有机物；F．生长素萘乙酸（NAA）：配制0.5mg/ml的NAA称取50mg ， NAA用少量95% 酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml；G..细胞分裂素、激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT 称50mgKT 用少量1N HCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。
微生物培养基验证程序
微生物培养基验证程序1.目的验证培养基是否满足培养性能的要求。
2.原理培养基根据其用途主要分为两种：选择性培养基和非选择性培养基。
选择性培养基包含能够抑制某些微生物生长的抗生素或化学试剂，非选择性培养基则不含抑制微生物生长的物质能够促进大多数微生物的生长。
无论商品化培养基还是自配培养基都需要在使用前对培养基性能进行验证。
3.验证菌株：标准菌株、能力验证/室间质评活动使用的菌株、从临床病人标本分离的具有稳定表型的菌株，均可用做验证菌株，实验室对其生化特征及鉴定结果应做好相关记录。
4.操作步骤4.1.直接接种法4.1.1.根据SOP不同的标本类型选择不同培养基直接进行接种，置不同的环境下培养。
观察细菌生长情况。
注意：接种菌量过多或过少都将掩盖培养基的促进或抑制生长的特性，如果使用直接接种法时出现验证不合格，则改用标准化菌悬液进行验证。
4.2.标准化菌悬液法4.2.1.较高浓度的菌悬液能够较好测试选择性培养基抑制特定微生物的生长能力。
较低浓度的菌悬液则能够验证非选择性培养基充分支持细菌生长的能力。
4.3.菌悬液的准备4.3.1.直接菌落法：使用培养18到24个小时的菌落，在0.85%无菌生理盐水中制成菌悬液，使其浊度达0.5麦氏浊度。
4.3.2.生长法：从24h培养物中接种3到5个菌落至无菌肉汤以制备菌悬液。
孵育数小时使其浊度达0.5麦氏浊度。
4.4.接种4.4.1.验证非选择性培养基：用无菌肉汤或生理盐水将0.5麦氏单位菌悬液进行1:100稀释，每个测试平板接种0.01ml悬浮液，均匀涂布。
如果菌落过密，则可将菌液稀释1000倍后再接种。
4.4.2.验证选择性培养基：用无菌肉汤或生理盐水将0.5麦氏单位菌悬液进行1:10稀释，每个测试平板接种0.01ml悬浮液。
如果菌落过密，则可将菌液稀释100倍后再接种。
4.6.培养温度、气体条件和培养时间按SOP规定执行。
5.验证结果5.1.观察细菌生长情况（菌落种类、分区划线以及各区生长情况等）。
植物组织培养的原理和程序
N、S、P、K、Ca、Mg 细胞分裂素
用合成有机物 (3)温度 无菌
生长素
(4)AaBb
无性生殖
考点二
花药离体培养
近几年高考对花药培养的考查较少，预计
考情 今后高考对本内容的考查将以简答题为主，花 解读 药离体培养技术的操作及与植物组织培养的区 别将是命题的主要方向。
[做一题]
[例2] 下图是花药培养产生花粉植株的两种途径，回答下 列相关问题：
培养基的灭菌最为重要；再分化阶段需要光照，因为叶绿 素的合成需要光照条件。(4)同一植株的所有细胞所含有的 遗传信息相同，但表达不同，故形态功能也存在差异。(5) 酒精灯火焰旁温度较高，可有效杀死空气中的细菌。
[答案]
(1)无机盐 分化
生长素
(2)植物细胞的全能性 芽发育成叶，叶肉细胞 (4)选择性表达 (5)接
一、菊花的组织培养 1．植物组织培养的原理和程序 (1)原理： 植物细胞的全能性 。
(2)程序：
2．植物组织培养的影响因素 (1)选材：不同植物组织或同一植物组织的不同部分，培 养的难易程度差别很大，菊花的组织培养，一般选择 未开花植株的茎上部新萌生的侧枝 。 (2)培养基：植物组织培养需要适宜的培养基，常用的是 MS培养基 ，在配制好的培养基中，常常需要添加
[关键一点]
其他条件对花药培养的影响
(1)光照：离体花药对光照的反应是不同的。一般认为， 花 药培养在诱导愈伤组织和胚状体期间进行暗培养或给 以散射光处理比较好。强光虽然有利于以后的绿苗分 化，但会抑制愈伤组织的形成，而弱的散射光既不影响 愈伤组织的形成，也有利于以后的绿苗分化。
(2) 温度：培养条件中最主要的是温度。离体花药对温度 比较敏感，是诱导小孢子发育的关键因素。
实验室检验超标、超趋势调查处理规程
一、目的规范超标、超趋势以及仪器设备异常处理的规程，确定实验室检验结果是否有效。
二、适用于本公司实验室发生的任何对初始污染菌检测、成品（无菌、EO残留量检测）、纯化水检测、以及环境监控的检测。
三、职责检验所有人员对此负责四、内容1、定义：1.1超出质量标准的检验结果（out of specification,oos）,超出设定质量标准的实验结果，（超标)，其中包括注册标准以及企业内控标准，如果对于产品有多个接受标准，结果的评判采用严格的标准执行。
1.2 超趋势的试验结果（out of trend,ooT）:结果虽在质量标准之内，但是任然比较反常，与长时间观察的趋势或者预期结果不一致。
1.3 异常数据（abnormal data ,AD）指超出标准及趋势以外的异常数据，或来自异常测试过程的数据或事件。
例如：仪器设备停机，认为差错，系统适用性不合格，样品或样品溶液异常等产生的数据或事件。
2. 职责2.1 实验者的职责2.1.1 实验者首先有责任得到准确的实验结果，并且必须警惕可能出现的问题；2.1.2 如果系统适应性结果不令人满意，所有的数据必须判为无效；2.1.3 实验者经核对质量标准确认实验结果符合要求后，方可报废试验溶液；2.1.4 在明显犯错的情况下，实验者一定不可以故意的进行；2.1.5 如果得到OOS/OOT/AD 结果，必须通知相应试验负责人；2.1.6 在调差过程中，实验者应本着实事求是的原则，同实验室负责人共同负责实验室调查；2.1.7 执行与实验室相关的预防和整改措施。
2.2 实验室负责人职责2.2.1 实验室负责人必须客观的，及时的、公正的进行实验调查调查，可能性的实验室差错必须立即确认。
2.2.2 确保在调查过程中清洗、完整的记录每一步；2.2.3 实验室负责人应追踪调查并推动进展，使调查在既定时间内完成，如应为特殊原因或复杂调查不能按期完成，必须填写中期调查报告。
在报告中细化需要进行的工作及完成日期。
培养基灵敏度及适用性检查操作规程
培养基灵敏度及适⽤性检查操作规程1. ⽬的：通过培养基适⽤性检查，确保购买的培养基符合实验要求。
2. 范围：本规程适⽤于技术质量部实验员对培养基适⽤性的检查。
3. 职责：质量部实验员负责执⾏此规程。
4. 内容：4.1 检验依据：《中华⼈民共和国药典》2015版4.2 试验⽤具：烧杯、三⾓瓶、酒精灯、接种环、平⽫、试管、吸管、移液枪、滴管、电⼦天平、电热恒温培养箱、⽣化培养箱或恒温恒湿培养箱、单⼈净化⼯作台、⾼压蒸汽灭菌器、微⽣物限度仪、漩涡混合器、试验菌种、检查⽤培养基等。
4.3 ⽆菌培养基适⽤性检查：本检查可在供试品的⽆菌检查前或与供试品的⽆菌检查同时进⾏。
4.3.1 培养基：硫⼄醇酸盐流体培养基、胰酪⼤⾖胨液体培养基或胰酪⼤⾖胨琼脂培养基（培养基的配制按《培养基配制操作规程》配制）。
4.3.2 稀释液、冲洗液及其制备⽅法稀释液、冲洗液配制后应采⽤验证合格的灭菌程序灭菌。
a) 0.1%⽆菌蛋⽩胨⽔溶液取蛋⽩胨1.0g，加⽔1000ml，微温溶解，滤清，调节pH值⾄7.1±0.2，分装，灭菌。
b) pH7.0⽆菌氯化钠-蛋⽩胨缓冲液取磷酸⼆氢钾3.56g，⽆⽔磷酸氢⼆钠5.77g，氯化钠4.30g，蛋⽩胨1.00g，加⽔1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。
c) 根据供试品的特性，可选⽤其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液（如0.9%⽆菌氯化钠溶液）。
如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加⼊表⾯活性剂或中和剂等。
4.3.3 ⽆菌性检查：每批培养基随机取不少于5⽀（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应⽆菌⽣长。
4.3.4 灵敏度检查4.3.4.1 菌种培养基灵敏度检查所⽤的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中⼼获得的⼲燥菌种为第0 代），并采⽤适宜的菌种保藏技术进⾏保存，以保证试验菌株的⽣物学特性。
⾦黄⾊葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）〔CMCC（B）10 104〕枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕⽣孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕⽩⾊念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F）98 001〕⿊曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F）98 003〕4.3.4.2 菌液制备a) 接种⾦黄⾊葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物⾄胰酪⼤⾖胨液体培养基中或胰酪⼤⾖胨琼脂培养基上，接种⽣孢梭菌的新鲜培养物⾄硫⼄醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24⼩时；b) 接种⽩⾊念珠菌的新鲜培养物⾄沙⽒葡萄糖液体培养基中或沙⽒葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养24～48⼩时，上述培养物⽤pH7.0⽆菌氯化钠-蛋⽩胨缓冲液或0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数⼩于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。
培养基的配制程序
③将①中所取的各种物质(包括蔗糖)，加入煮好 的琼脂中，再加水至1000毫升，搅拌均匀，配成培
养基。 ④用1N的氢氧化钠或盐酸，滴入③中的培养基
里，每次只滴几滴，滴后搅拌均匀，并用pH试纸测 其pH值，直到将培养基的pH值调到5.8。
⑤将配好的培养基，用漏斗分装到三角瓶(或 试管)中，并用棉塞塞紧瓶口，瓶壁写上号码。瓶 中培养基的量约为容量的1/4或1/5。
培养基的成分比较复杂，为避免配制时忙乱而
将一些成分漏掉，可以准备一份配制培养基的成 分单，将培养基的全部成分和用量填写清楚。配 制时，按表列内容顺序，按项按量养基的配制程序 计算并吸取母液—大量元素母液、
微量元素母液、 铁盐母液、 有机物质母液、 生长调节物质母液
称量—蔗糖、琼脂
加热溶解 调节PH 分装—玻璃器皿清洗、干燥
封口、高压蒸汽灭菌 接种（培养基冷却凝固）
二.培养基的灭菌与保存
培养基配制完毕后，应立即灭菌。培养基通 常应在高压蒸汽灭菌锅内，在汽相120℃条件下， 灭菌20分钟。 经过灭菌的培养基应置于10℃下保存，特别 是含有生长调节物质的培养基，在4～5℃低温 下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培养 基，要在配制后的一周内使用完，其它培养基 最多也不应超过一个月。
培养基的配制程序
教学目标 掌握培养基的配置方法。
任务 培养基的配制程序
一、培养基的配置 ①根据配方要求，用量筒或移液管从每 种母液中分别取出所需的用量，放入同一烧 杯中，并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边 备用。 ②将①中称好的琼脂加蒸馏水300～400 毫升，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透 明状，再停止加热。
培养基的高压灭菌
作业
说明培养基的配置程序。
实验室质量管理及控制
培养基的控制、使用和管理
培养基： 是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁 殖使用的混合营养液（主要成分为碳源、氮源、 无机盐、维生素、微量元素、水、指示剂、抑 制剂、凝固剂）用于微生物的培养、分离、鉴 定研究和保存所用。 重要性： 是微生物学检查的基础材料。直接影响微生物 试验的结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件 和质量控制试验是提供优质培养基的保证，是管 理的重要性。
2010版药典对微生物实验室管理要求
保证检验质量和结果可靠性的要求贯穿在 无菌检查法和微生物限度检查法的各项要 求中。如：检验设施、环境洁净度、日常 监控、防污染的措施、人员、培养基、标 准菌株的规定。 附录XIXQ微生物实验室规范指导原则 人员、培养基、菌种、实验室的布局 和使用、设备、文件、实验记录、结果判 断。
设施、设备、环境要求
菌种的控制、使用和管理
菌种管理的重要性： 菌种是微生物学检验的基本材料。在微生物检 验中的标准菌种，相当于理化分析中用的对照品 管理：专人管理，加锁保存在冰箱内，保存菌 种的冰箱不得放置食品及易挥发性试剂及有机溶 媒等；定期有专人按操作规程进行传代接种；菌 种定期检查，发现染菌及变异现象应及时报告， 研究处理。；实验菌种不得任意带出；使用致病 菌时应及时通知保管人员，用后必须及时处理
设施、设备、环境要求
原则要求 无菌检查和微生物限度检查应分别有独 立的洁净室 FDA提出：用于无菌检查的设施不应比 无菌加工生产设施造成更大的微生物污染、 机率；环境的检测和更衣程序也应与药品 生产中的要求一致
设施、设备、环境要求
2010版GMP附录1对洁净度的规定： A级：指高风险操作区，如灌装区、放置胶塞 桶和与无菌制剂直接接触的敞口包装容器的区域 及无菌装配或连接操作的区域，应当用单向流操 作台（罩）维持该区域的环境状态。单向流系统 在其工作区域内必须均匀送风，风速为0.360.54m/s。应当有数据证明单向流的状态并经过 验证。在密闭的隔离器操作器或手套箱内，可使 用较低的风速。 B级：指无菌配制和灌装等高风险操作A级洁净 区所在的背景区域 C级和D级：指无菌药品生产过程中重要程度 较低操作步骤的洁净区。
USP微生物室管理规定
USP药典《1117》章节就是这个：良好的微生物实验室操作规范简介在微生物实验室中，良好的实验室操作规范是基于很多原则，包括以下活动：无菌技术、培养基的控制、菌种的制备、仪器设备的管理、细致的记录和数据的评估、人员的培训。
众所周知，微生物测定数据的可变性、可靠性和重现性是基于公认方法的使用和坚持良好的实验室操作规范。
培养基的制备和质量控制－培养基的制备培养基是微生物测定的基础，培养基的质量因而成了保证微生物实验成功的关键。
培养基的制备、合理的贮存、培养基的质量检验，能确保提供持续高质量的培养基。
在按照可接受的来源和标准中的配方制备培养基的过程中，重要的是选择正确的培养基和成分。
与脱水和制备好的培养基一起的还常常伴有供应商的配方和说明。
因为不同的培养基可能有不同的制备要求（如：加热、填加物、ph值的调节等），按照说明确保制备可接受的培养基是重要的。
一份描述效期和建议贮存条件的COA是同制备好的培养基一起的，同时附有用于培养基的促生长试验和灵敏度测试的菌种。
水普遍用于微生物培养基的稀释。
纯化水是最常用的，但是在有些情况下，也用去离子水和蒸馏水。
稀释用水的体积应该记录。
使用脱水培养基和培养基组分来制备培养基时要准确称量。
使用己校正的具有适合的称量范围的天平。
使用清洁的容器和工具，防止配方中带入外来物质，改变培养基的最终组成。
称量也应该记录。
脱水培养基先在水中分散，并完全溶解和灭菌。
如果必要可以加热使溶解,但要防止过度加热，因为所有的培养基或多或少有对热敏感的。
用于培养基制备的设备应适于加热控制，持续搅拌，溶质混合。
培养基变黑（梅特拉反应和非酶的棕色着色剂）通常显示过度加热。
当需要向培养基中添加补充物时，添加后应充分混合。
制备好的培养基应放在清洁无菌的玻璃器具中，也可以加入抑制性物质。
抑制性物质可以由器具清洁时产生也可由先前贮存在此器具的物质产生。
必须确保清洁过程能有效去除残留和异物，确保清洁剂用纯化水充分清洗。
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培养基管理程序
Standardization of sany group #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
培养基管理程序
1.适用范围
药品微生物检验用培养基。
2.责任
培养基管理员：按本程序规定进行微生物检验用培养基管理。
QC主管：监督检查该程序的执行情况。
3.内容
3.1.培养基管理员由质量部门授权人担任、应具有一定的微生物学专业知识，
并经过培训合格。
3.2.培养基的购入
由培养基管理员提出购买计划，由QC主管、质量部经理批准后，按《物资采购管理程序》购买，培养基应是由中国药品生物制品检定所生产。
3.3.培养基制备前的准备工作
3.3.1.制备培养基所用的玻璃器皿、吸管、试管、锥形瓶和平皿等，新
的玻璃皿和再次使用的玻璃器皿分别按各自批准的规程洗涤、晾干。
3.3.2.晾干后的器皿按规定程序进行湿热灭菌、干燥。
并填写《QC湿热
灭菌记录》。
3.3.3.已灭菌的器皿按规定要求保存，并在下述规定期限内用完。
3.4.培养基的制备
3.4.1.按批准的规定程序进行称量、配制、过滤、分装、灭菌。
3.4.2.填写配制记录。
内容：名称、配制量、配方（比）、操作方法中
重要参数（时间、压力、温度）、配制日期、配制者、截止使用日期。
3.4.3.在每个已灭菌的培养基容器外做好标记，注明名称、截止使用
期。
3.5.培养基的保存
3.5.1.环境条件：各种培养基均应在洁净的普通冰箱内保存，以5℃左
右为宜，不得冻结。
否则融化后常因理化条件改变而不能再用。
3.5.2.保存时限
3.5.2.1.基础营养培养基应在2周内用完。
3.5.2.2.生化鉴别培养基应在1周内用完。
3.5.2.3.选择性分离鉴别培养基制成平板后当日用完。
3.6.管理
3.6.1.贮存培养基的冰箱内不得存放食品、饮料等无关物品。
3.6.2.管理员应按规定的时间检查培养基的外观，如失水、沉淀、过
期、棉花塞松驰或脱落等异常情况，发现问题及时处理。
3.6.3.开封的干燥培养基，应盖紧内外盖，尽快用完。
3.6.
4.开封及未使用完的干燥培养基，应分别放入干燥器内保管，防止
吸潮及微生物污染。
4.相关文件
《物资采购管理程序》1209·002
《QC湿热灭菌记录》 2102·001
《培养基及稀释液配制记录》 2102·005。