限制性核酸内切酶的命名
基因工程习题
基因工程习题及参考答案02工具酶部分——限制性内切核酸酶一、填空题1．严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。
基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。
2．年Luria 和Human 在T 偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。
3．1970 年，Smith 和Wilcox 从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。
4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。
5．Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20~40kDa，通常由亚基所组成。
它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA 杂合双链。
这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有专一性，一般在识别序列内切割。
切割的方式有，产生末端的DNA 片段或的DNA片段。
作用时需要作辅助因子，但不需要和。
6．完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：(1)(2) 。
7．Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶。
根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有倾向，即它们在识别序列中含量较高。
8．EcoK 是I 类限制性内切核酸酶，分子组成是α2 β2 γ，分子量300kDa。
在这些亚基中，α亚基具有作用；β亚基具有的活性；γ亚基的作用则是。
9．个体之间DNA 限制性片段长度的差异叫。
10．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、第三两个字母取自，第四个字母则用表示。
11．限制性内切核酸酶Acy I 识别的序列是5’—GRCGYG-3’，其中R ，Y 。
最新基因工程作业题及答案
最新基因工程作业题及答案基因工程作业题及答案第二章1. 名词解释：核酸内切酶、核酸内切限制酶、同裂酶、同尾酶、核酸外切酶、末端脱氧核苷酸转移酶答：核酸内切酶：是一类从多核苷酸链的内部催化磷酸二酯键断裂的酶。
核酸内切限制酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。
同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。
核酸外切酶：是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。
末端脱氧核苷酸转移酶：可以不需要模板，在单链DNA或突出的双链DNA3’-OH端随机添加dNTPs的酶2. 限制性内切核酸酶的命名原则是什么？答：限制性内切核酸酶按属名和种名相结合的原则命名的，即：属名+种名+株名+序号；首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写；第二字母：取种名的第一个字母，斜体小写；第三字母：(1)取种名的第二个字母，斜体小写；(2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。
第四字母：若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。
顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、…等，用正体。
3．部分酶切可采取的措施有哪些？答：1）缩短保温时间2）降低反应温度3）减少酶的用量4. 在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么?答：回文序列是：5'-CATATG-3，5．什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素影响?答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。
条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星活性。
基因工程中常用的酶
识别位点
剪切位点
MS
R
75kD
108kD
Ⅲ 型酶有两个亚基：MS 亚基在靶位点负责识别 和甲基化； R 亚基在其邻接位点起限制作用
基因工程中最常用的是Ⅱ型酶 三. Ⅱ型酶的命名,书写与剪切方式：
限制酶 来源 剪切方式 Eco R I Escherichia coli RY 13 G↓AATTC Pst I Providencia stuartii 164 CTGCA↓G BseⅡ Bacilus stearothermophilus strain 822 (HpaⅠ) GTT↓AAC
二.甲基化酶(methylase)
可使DNA甲基化。有两种： dam 甲基化酶和dcm甲基化酶 N6A甲基化 5`－GmATC－3` C5C甲基化 CmCAGG 或 CmCTGG 用途中的EcoRI酶切位点，然后将修饰 的片断与人工EcoRI接头连接，接头用EcoRI 切割后，将DNA片断插入噬菌体DNA中。
B 5’ P B OH P P P ATP PPi P P P OH P P NAD B B T4 ligase NMN B B B B B E.coli ligase 3’ P P P B B B
连接酶的功能： (1)能封闭DNA双链或RNA/DNA杂种双链中的单 链缺口，而不能封闭双链RNA中的单链缺口 (2)能封闭粘性末端退火后出现的缺口； 用途： (1)通过粘端连接DNA分子； (2)连接平端双链DNA分子或平端DNA与人工接 头的连接。
1962 , Arber, 1968 Smith 发现限制性酶
W. Arber (t Basel, Switzerland
H. O. Smith (1931 －) Johns Hopkins University School of Medicine,USA
反馈版-技术丨gDNA介导的万能核酸内切酶PfAgo,你真的会用吗？
技术丨gDNA介导的万能核酸内切酶PfAgo，你真的会用吗？(PfAgo常见使用问题解答FAQ)前言限制性内切酶是识别特定DNA序列并在识别位点或附近切割DNA的细菌蛋白质。
它们于20世纪60年代末在细菌中被发现，并自20世纪70年代初以来成为重组DNA技术的基石到目前为止，已经鉴定了超过3600种限制性内切酶，具有超过250种不同的特异性，其中超过250种现已商业化，可用于分子生物学的常规应用。
大多数限制性内切酶(即II型酶)只能识别短的DNA序列(48个碱基对)，这极大地限制了它们在重组DNA 技术中的应用。
为了克服这一限制，蛋白质工程被用来改变天然存在的限制性内切酶的序列特异性，但收效甚微。
另外，人工限制性内切酶(AREs)是通过将DNA结合域融合到核酸酶结构域(例如，锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活物样效应核酸酶(TALENs))或使用簇状规则间隔短回语重复(CRISPR)相关酶9 (Cas9)在体外产生的。
与天然限制性内切酶相比，该酶具有更高的特异性。
然而，它们没有产生明确的粘性或钝性末端，这是限制性内切酶的标志，并且由于它们的单一或极低的周转率而显示出相当差的活性。
此外，很难获得足够的数量和纯度。
所有这些限制都极大地限制了它们在体外的应用。
酶学性质Argonaute蛋白是一类可以结合短核苷酸的蛋白质，在生命的所有领域都是保守的。
在真核生物中，Argonaute蛋白是RNA沉默机制的关键参与者。
真核生物Argonautes能够结合小RNA分子，可以作为引导物在特定的位置切割与它们结合的RNA向导互补的目标RNA分子的酶在原核生物中，大多数目前鉴定的Argonaute蛋白被认为在宿主防御入侵遗传因子中起作用。
与真核Argonautes不同，一些原核Argonautes有能力使用小的DNA分子而不是RNA作为向导来切割ssRNA或11c ssDNA靶标。
PfAgo是一种原核生物Pyrococcus furiosus的Argonaute蛋白，它被用作可编程的核酸内切酶，可以基于gDNA的引导来切割底物。
基因工程(第二章答案)
第二章基因工程工具酶一、解释下列名词1.Restriction and modification（限制与修饰）宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。
外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。
2. Matched ends(or cohesive end)（匹配末端或粘性末端）识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端3. Blunt ends平末端。
在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。
4. Star activity星星活性。
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
5. Klenow fragment Klenow 片段。
Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3' 外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5' 外切活性不受影响。
6.Reverse transcriptase反转录酶。
即依赖于RNA 的DNA 聚合酶，它有5'--3' 合成DNA 活性，但是无3'--5' 外切活性。
7.Terminal transferase（末端转移酶）8.Ligase连接酶。
催化DNA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。
9.T4 polynucleotide kinase（T4多聚核苷酸激酶）催化ATP 的γ-磷酸基转移至DNA 或RNA 的5' 末端。
10.Alkaline phosphatase（碱性磷酸酶）催化除去DNA 或RNA 5' 磷酸11.S1 nuclease Sl 核酸酶。
可降解单链DNA 或RNA ，产生带5' 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链；对dsDNA ，dsRNA ，DNA:RNA 杂交体不敏感。
常用工具酶
1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象，就是细菌的 限制（限制酶）-修饰（甲基化酶）系统。
当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异 识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在 这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷 甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基 ，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。
CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCG AT AGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT T GGCTA
4.识别位点在DNA分子上出现的频率
推测酶切割位点出现的频率对于推断DNA酶切片段大小很有 用。假定4种核苷酸在DNA分子上出现的频率相同，那么靶 序列为6个核苷酸的内切酶在每46（=4096）个核苷酸中酶 切位点就有一次出现机会。据此推算，一条49000bp长的 DNA中有12个6核苷酸识别序列的酶切位点（49000/4096） 。但事实上并非真正如此，因为DNA分子中4种碱基的出现 频率并不均等。
二、连接酶的类型
大肠杆菌DNA连接酶：由大肠杆菌基因组DNA编码Байду номын сангаас，以NAD+作为能源辅助因子； T4 DNA连接酶：由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以 ATP作为能源辅助因子，是基因工程中常用的连 接酶。
三、DNA连接反应的条件
连接反应最佳温度为37℃，但是此时粘性末端间氢键结合 不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI 粘性 末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开，所以通常在 4-15℃连接。
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
限制性核酸内切酶的分类：根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
第一型限制酶同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用；另有认知(recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并不能准确定位切割位点，所以并不常用。
例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。
所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。
是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。
例如：EcoRI、HindIII。
第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。
可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对，并不能准确定位切割位点，所以并不常用。
例如：EcoPI、HinfIII。
限制酶在遗传学方面的应用：1、在甚因工程方面利用能产生“粘性末端”的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一限制酶处理不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性末端, 可以彼此“粘合”,再经连接酶处理, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶主要应用于以下两方面（1）目的基因与载体的重组细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必须通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮助才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。
将供体DNA与载体用同样的限制酶处理, 使载体带上各种各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再筛选出所需的菌株, 便获得带有某一目的基因的繁殖系.用这种方法, 已成功地将酵母菌的咪哇甘油磷酸脱水酶基因、夕一异丙基苹果酸脱氢酶基因和色氨酸合成酶基因通过几噬菌体转人大肠杆菌,并表达了信息.（2）建造新的基因载体作为基因载体,在引人受体细胞后, 必须有较高的复制率, 以求获得大量的基因产物；必须具备一个选择性标志, 以便筛选；还要有一至多种限制酶的作用位点（每种酶只有一个切口）；也要求使用安全。
分子克隆技术常用的工具酶
已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在 对应II类限制酶名称前加一个M表示。
如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲
基化(GAm6ATTC)的酶
识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至 少有3种：
①敏感的，甲基化后不能再切割；
DNA用的乙醇。
2）甲基化
识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会 阻碍限制酶的酶解活性。 受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。
所用符号为：m4C表示N4-甲基化胞嘧啶，m5C为C5-甲基胞嘧啶。
3）底物性状
随底物的不同而活性发生改变
仅2003年1-4月份就有150余种新的酶被登录入网，至2003年 04月19日, REBASE (The Restriction Enzyme Database) 收集的 编号已有7096种；其中Ⅱ类酶有3845种．
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等， 一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。
②不敏感的．甲基化后仍可切割；
③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。
一、大肠杆菌DNA聚合酶 I
1 三种酶活性 1 ）DNA聚合活性
5' A T
||| |
3' T A C G dTTTP
5'
5’ 5’
引物
2）核酸外切酶活性
5’ A G C T T C A G G A T A
(-) 放线菌素D (-)
DNA合成
RNA
DNA(前病毒)
RNA
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
第一节工具酶限制性内切酶
NEB公司的缓冲液成分（1X）
• NEBuffer 1（黄色）： 10 mM Bis Tris 丙烷-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT（pH 7.0 @ 25℃）。
• • NEBuffer 2（蓝色）：
10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT（pH 7.9 @ 25℃）。 • • NEBuffer 3（红色）： 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT（pH 7.9 @ 25℃）。 • • NEBuffer 4（绿色）： 20 mM Tris-Ac, 10 mM Mg(Ac)2, 50 mM KAc, 1 mM DTT（pH 7.9 @ 25℃）。 •
• 这类酶很少能达到完全切割。
某些识别和切割独特的酶
BsmBⅠ
Ⅳ 型限制性内切酶
• 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。
• 限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一 个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们 才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺 苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小， 亚基约 200-350 个氨基酸。
Ⅰ型限制性内切酶
• 是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋 白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。
• 以前认为Ⅰ型限制性内切酶很稀有，但基因组测序 分析发现这类酶其实很常见。尽管Ⅰ型酶在生化研 究中很有意义，但其不
• 能产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带，因 而不具备实用性。
双酶切体系的建立
• 选择最大程度上保证两种酶活性的缓冲液用于双酶切。为 避免星号活性，建议选用 NEB 高保真内切酶。
限制性内切酶和DNA体外重组的基本含义
• 1、基本概念
•DNA重组技术也称为基因克隆或分子克隆。最终目的是把 一个生物体中的遗传信息转入另一个生物体。
2、基本步骤
•目的基因的提取:供体生物基因
或称外源基因的提取 •限制性酶切：目的基因切成不同 大小的片段 •酶接：连接到另一DNA分子上 （克隆载体） •转化:将这个重组DNA分子转入 受体细胞 •筛选和鉴定:对吸收了重组DNA 的受体细胞进行 筛选和鉴定 •基因表达：进行培养，检测外援 基因是否表达。
１、甘油浓度过高「＞5%v/v」 ２、１μｇDNA相对应的酶Unit数过高（因酶不同而不同，一般＞100 Unit/μｇ）
３、离子强度低（＜25mM）
４、pH值高（＞pH8.0） ５、残存有机溶剂。 ６、Mg2+替换为其他二价离子。（Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+）
Star 活性を阻害する条件
１、在切断可能的范围内，尽量减少酶用量。 ２、确认完全除去制备DNA时的有机溶剂。 ３、反应溶剂的离子强度调至100-150mM。４、反应溶液的pH值调整到7。 ５、二价阳离子尽量使用Mg2+。
2、Klenow酶：
• 也称DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’ 3’ 外切酶活性
Kpn I
5'- GGTACC -3' 3'- CCATG G -5'
Asp718 I
GTБайду номын сангаасCC-3' 5'-G + G-5' 3'-CCATG
CTCGA G
CCC
1 Unit 定义： 限制性内切酶在50μL反应液中60分钟完 全切断1μg DNA（多数情况是λ噬菌体DNA ）。