AP标记技术

碱性磷酸酶（AKP）标记抗体（戊二醛法）

1．取0.2ml AKP（含2mg），与0.1ml纯化的IgG（含1mg）混合，加PBS到0.5ml。2．在0.5ml AKP/抗体混合液中加4μl 25％戊二醛，室温放置2小时。

3．向反应物中加PBS到2ml，4℃中对PBS透析过夜。透析物用Tris缓冲液

（0.5mol/L Tris-HCl pH7.4，1mmol/L MgCl

2，0.04％ NaN

3

，5％ BSA）稀释

到5ml，4℃可保存1年以上。

辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（过碘酸钠法）

1．取5mg HRP溶于0.5ml双蒸水中，加0.5ml新鲜配制的60mmol/L NaIO

4

水溶液，4℃中避光搅拌30分钟，加0.5ml 160mmol/L乙二醇水溶液，室温中继续搅拌30分钟。

2．加1ml纯化的IgG（5mg）水溶液，混匀后置透析袋中，对50mmol/L pH9.5的碳酸钠缓冲液透析6小时或过夜。

3．向透析物中加0.2ml 5mg/ml NaBH

4

水溶液，4℃搅拌2小时。继续4℃搅拌，20分钟内逐渐加入等体积饱和硫酸铵，再4℃搅拌30分钟。

4．4000×g离心30分钟，去上清液。用1ml 20mmol/L pH7.4磷酸缓冲液溶解沉淀物，对20mmol/L pH7.4磷酸缓冲液透析过夜。4000×g离心20分钟，除去不溶物。加上述磷酸缓冲液到5ml。鉴定标记物。

5．分装后冻干保存或加甘油到40％（v/v）分装后4℃或－20℃保存。1～2年活性不变。

6．测定标记物的OD

403和OD

280

。

标记率＝OD

403/OD

280

标记率应是0.3～0.6，即每个IgG结合1～2个HRP分

子。

酶含量（mg/ml）＝OD

403

×0.4

IgG含量（mg/ml）＝（OD

280－OD

403

×0.42）×0.94×0.62

标记物的克分子比值＝酶含量×4/IgG含量比值应在1～2之间。

用半乳糖苷酶标记抗体

1．取1mg纯化的抗体蛋白，溶于1ml含50mmol/L NaCl的0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液中。立即加入10μl含0.25mg MBS的四氢呋喃，30℃水浴1小时。

2．反应液经BioGel P-30层析柱过滤除去未结合的MBS，层析柱用含50mmol/L NaCl的10mmol/L pH7.0磷酸缓冲液平衡和洗脱。

3．立即向洗脱物中加1mg新鲜配制的半乳糖苷酶水溶液，30℃标记1小时。加入2mol/L 2-巯基乙醇到终浓度2mmol/L，终止反应。

分别到终浓度0.1％和0.05％，4℃中可保存1年以上，不4．加入BSA和NaN

3

要冻存！。

生物素抗体的方法

1．将40mg羟基琥珀亚胺生物素脂溶于1ml二甲基甲酰胺中，－20℃保存。

2．用0.1mol/L pH8.0碳酸钠缓冲液透析抗体制剂，去除小分子物质。用透析液将抗体配制到10mg/ml。抗体浓度低时，生物素化率也低。

3．在1ml抗体溶液中加50μl羟基琥珀亚胺生物素脂保存液，混合后室温反应2小时。

4．对PBS透析，除去未结合的羟基琥珀亚胺生物素脂，加等量甘油，－20℃保存。

标记步骤

（1）取抗体（2～5mg/mL）1mL，加入AP 5mg溶解。

（2）装入透析袋，用0.01mol/L、Ph7.2PBS4℃透析18h，换液3次。

（3）加入2.5%戊二醛20uL，室温（20℃±）放置2h。4℃0.01mol/L、pH7.2PBS透析过夜，换液3次。

（4）移入0.05mol/L、pH8.0Tris-HCl缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次。

（5）取出标记抗体，用含%BSA和0.02%NaN3的Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标记物原液。

（6）加入1/3量纯甘油，测定工作效价后，小量（0.1mL）分装，4℃保存（使用前以pH7.4PBS-吐温溶液将结合物适当稀释）。