蛋白表达系统的选择
列举常用的蛋白质表达系统并阐述其基本表达策略
常用的蛋白质表达系统及其基本表达策略1. 介绍蛋白质表达系统是在生物技术领域中广泛应用的重要技术，它可以在大量生产目的蛋白质时提供帮助。
在选择蛋白质表达系统时，科研人员通常需要考虑表达效率、纯度、可溶性和最终产物活性等因素。
在本文中，我们将介绍一些常用的蛋白质表达系统，并阐述它们的基本表达策略。
2. 细菌表达系统细菌表达系统是最常用的蛋白质表达系统之一，其中大肠杆菌表达系统是应用最为广泛的。
基本表达策略包括将目的基因插入原核表达载体中，通过大肠杆菌的代谢系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择适当的启动子、选择合适的宿主菌株以及优化表达条件等因素。
3. 酵母表达系统酵母表达系统通常采用酿酒酵母或毕赤酵母。
基本表达策略包括将目的基因插入酵母表达载体中，通过酵母的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择合适的启动子、选择适当的宿主菌株以及与酵母细胞适应的表达条件等因素。
4. 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统常用于大规模生产蛋白质。
基本表达策略包括将目的基因插入昆虫表达载体中，通过昆虫细胞的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择合适的启动子、适当的宿主昆虫细胞系以及适合昆虫细胞生长的表达条件等因素。
5. 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统通常用于生产高度活性的蛋白质。
基本表达策略包括将目的基因插入哺乳动物表达载体中，通过哺乳动物细胞的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择适当的启动子、选择适合的宿主细胞系以及适合哺乳动物细胞生长的表达条件等因素。
6. 植物细胞表达系统植物细胞表达系统是一种新兴的蛋白质表达系统，常用于农业生物技术和药物开发领域。
基本表达策略包括将目的基因插入植物表达载体中，通过植物细胞的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择适当的启动子、适合的宿主植物组织以及适合植物细胞生长的表达条件等因素。
结论在选择蛋白质表达系统时，科研人员需要根据目的蛋白质的性质、表达需求以及实验条件等因素综合考虑，并选择最适合的表达系统和基本表达策略。
不同表达系统在蛋白质产生方面的优缺点
不同表达系统在蛋白质产生方面的优缺点随着科技的日益发展，人们对于生物学研究的需求也越来越高。
而蛋白质作为生命体代谢过程中的重要组成部分，其产生机制的研究也变得越来越重要。
不同的表达系统在蛋白质产生方面有着不同的优缺点，本文将从多个方面进行分析。
一、概述蛋白质表达是指将 DNA 序列转录为 RNA 后再将其翻译为相应的蛋白质的过程。
在这个过程中，表达系统起到了至关重要的作用。
不同表达系统的优缺点直接影响了蛋白质的产率和质量。
二、大肠杆菌表达系统大肠杆菌系统是最常用的表达系统之一。
其最大的优点是表达量高，结构简单且易于操作。
此外，大肠杆菌表达系统还具有以下优点：1. 成本低廉：大肠杆菌的培养和酵母细胞相比较简单，生产成本相对较低。
2. 短周期：大肠杆菌表达系统的周期短，能够较快产生大量的蛋白质。
3. 稳定性高：大肠杆菌表达系统非常稳定，可以长期保存和传代。
但是，大肠杆菌表达系统也存在一些缺点：1. 没有真核系统那样完善的修饰功能：大肠杆菌表达的蛋白质无法进行真核系统所特有的复杂后修饰。
2. 易受到毒素的影响：表达的蛋白质会容易受到毒素、有害物质的影响。
三、哺乳动物系统表达系统哺乳动物系统表达系统可以表达具有多种复杂后翻译修饰的蛋白质，这些蛋白质更接近自然状态，因此常用于生产生物药物、抗体的制备。
哺乳动物系统表达系统相较其他表达系统的优点包括：1. 复杂修饰：哺乳动物系统表达的蛋白质可以被修饰成比较接近自然状态的蛋白质。
2. 有利于生产生物药：哺乳动物系统表达的蛋白质可以用于生产许多生物药。
但是，哺乳动物系统表达不是没有缺点，主要包括：1. 成本高：哺乳动物系统表达的成本比其他表达系统高。
2. 周期长：哺乳动物表达系统周期长，需要更长时间才能产生足够的蛋白质。
四、昆虫系统表达系统昆虫系统表达是近年来发展起来的新一代表达系统。
这种表达系统的优点主要有：1. 微生物介导不良反应少：由于昆虫细胞培养液比微生物培养液更接近人体环境，所以由昆虫细胞表达的蛋白质导致的过敏反应很少。
生物制药中的表达系统选择和使用注意事项
生物制药中的表达系统选择和使用注意事项生物制药是一项利用生物学原理和技术来生产药物的领域，其中表达系统的选择和使用是至关重要的步骤。
表达系统是指将目标基因转录成mRNA并翻译成蛋白质的系统，它直接关系到生物制药中药物产量、质量和效力等方面。
在选择和使用表达系统时，需要考虑多种因素，包括目标蛋白的性质、产量要求、系统稳定性和成本效益等。
首先，选择表达系统时需要考虑目标蛋白的性质。
不同的蛋白质具有不同的结构和功能，因此需要根据目标蛋白是否是酶、激素、抗体等来选择合适的表达系统。
例如，如果目标蛋白是细胞内酶，可以考虑使用大肠杆菌表达系统，因为大肠杆菌对这类蛋白的表达效果较好。
而如果目标蛋白是复杂的膜蛋白，可以考虑使用哺乳动物细胞表达系统，因为哺乳动物细胞具有更接近人体细胞的表达环境。
其次，生物制药中的表达系统选择还需考虑产量要求。
不同的表达系统对蛋白质的表达能力有所差异，选择合适的表达系统可以提高蛋白质的产量。
例如，选择细胞系表达系统时，可以选择具有高复制和表达能力的细胞系，如CHO细胞。
此外，一些表达系统还可以通过基因工程技术增加蛋白质的产量。
例如，可以通过插入多个目标基因拷贝、优化启动子序列和信使RNA的稳定性等方式来提高表达系统的产量。
同时，选择表达系统还需要考虑系统的稳定性。
所谓稳定性指的是表达系统能否持续稳定地表达目标蛋白。
在生物制药中，长时间和稳定的表达对于大规模生产药物至关重要。
因此，选择具有稳定表达能力的表达系统非常重要。
例如，大肠杆菌表达系统常常因为由于毒力基因的表达而导致大规模突变，从而降低了系统的稳定性。
而哺乳动物细胞表达系统，虽然表达系统稳定性较高，但细胞系的稳定性会受到外界环境的影响。
此外，成本效益也是选择表达系统时需要考虑的因素。
不同的表达系统所需的设备、耗材和操作成本都不同。
因此，在选择表达系统时，需要综合考虑产量要求和成本效益。
对于小规模生产或科研用途而言，大肠杆菌表达系统通常是较为经济的选择；而对于大规模生产企业而言，哺乳动物细胞表达系统可能更具成本效益。
蛋白质可溶性的调控与表达系统的选择
蛋白质可溶性的调控与表达系统的选择蛋白质是生命体中非常重要的一种分子，它们参与了细胞代谢的各个环节，并扮演着结构、信号传递、酶催化等多种重要角色。
在生物制药、基因工程等领域，大量需要生产蛋白质的需求，因此如何实现高效、高产、高纯度的蛋白质制备成为了很多人关注的话题。
蛋白质的可溶性是影响表达量的重要因素之一。
在表达载体中，蛋白质的可溶性受到多种因素的影响，包括蛋白质序列特性、温度、离子强度、pH、氧气含量、分泌效率等等。
若蛋白质处于不可溶性状态，不能在细胞内成功表达，无法用于下游纯化的需求，因此如何实现蛋白质的高度可溶性成为了一项非常有挑战性的任务。
为了提高蛋白质的表达效率及可溶性，人们进行了多种策略的研究。
其中如何选择适合的表达系统成为了一个重要的问题。
在基因工程领域，常用的表达系统包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等等。
大肠杆菌是最常被使用的表达系统之一，因为其生长速度快、培养条件容易掌控、生产成本低、存储条件简单等优点。
不过，大肠杆菌的表达质量常常受到多种因素的影响。
一方面，由于培养条件不可避免地会造成蛋白质聚集和沉淀，因此大肠杆菌表达的蛋白质的可溶性常常较低。
为了解决这个问题，人们通常会选择使用特殊的大肠杆菌突变体，在其内部表达具有较高可溶性标签的蛋白质。
或者也可以在大肠杆菌表达完毕后使用特殊的离子交换介质等来进行可溶性的提升。
另一方面，传统的大肠杆菌表达系统往往难以表达复杂的蛋白质。
复杂蛋白质序列含有大量的游离硫酸氨基酸、脱氨基酸较多等特殊结构，使得其表达难度很高。
因此，一些新的大肠杆菌表达系统如T7表达系统、双RNA多样性补体表达载体等的诞生大大缓解了这个问题。
酵母菌在表达可溶性蛋白质方面也表现出了很高的潜力。
酵母菌表达系统包括酿酒酵母和毕赤酵母。
其中毕赤酵母表达系统因为能耐高温、高pH、高盐等多种恶劣环境而受到人们的青睐。
另外，毕赤酵母表达谷氨酰胺合成酶、重组十六烷酰体素生合成酶、融合菌糖神经酰胺合成酶等多种复杂重要酶的记录表现出出色的表达效果。
原核蛋白表达流程
原核蛋白表达是一种常用的蛋白质生产方法，可以通过大肠杆菌等原核细菌表达目标蛋白。
以下是一个典型的原核蛋白表达流程：1. 选择表达系统和载体：选择适合的原核表达系统和载体。
常用的原核表达系统包括大肠杆菌系统（如E.coli），常用的载体包括pET、pGEX等。
2. 构建重组质粒：将目标基因克隆到选定的表达载体上，通常采用限制性内切酶切割和连接方法，确保目标基因正确插入载体。
3. 转化宿主菌：将构建好的重组质粒转化入宿主菌中，一般选择适当的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)等。
4. 培养菌液：将含有重组质粒的宿主菌接种到适当的培养基中，进行菌液的培养。
培养条件可根据所选的菌株和载体进行优化，包括温度、培养时间、培养基成分等。
5. 诱导表达：在适当的生长阶段，向培养基中加入适量的诱导剂，常用的诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。
6. 细胞破碎：经过一定时间的表达后，收集培养菌液并将细菌进行破碎，释放目标蛋白。
破碎方法可以选择超声波破碎、高压破碎等。
同时添加适量的蛋白酶抑制剂，避免蛋白质的降解。
7. 蛋白纯化：通过一系列的蛋白纯化步骤，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，分离纯化目标蛋白。
此步骤可以根据目标蛋白的特性和需求进行优化。
8. 鉴定和确认：对纯化得到的蛋白进行鉴定和确认，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等。
确保表达的目标蛋白符合预期。
9. 储存和应用：将纯化好的目标蛋白进行适当的保存和储存，确保其稳定性和活性。
根据需要，可以进行后续的功能研究、结构分析、制备抗体等应用。
需要注意的是，原核蛋白表达流程可以根据实验目的和具体要求进行调整和优化。
不同的表达系统和载体可能需要适应性调整。
此外，对特定蛋白的表达可能需要进一步优化培养条件和蛋白纯化步骤。
蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统及其优缺点
蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统及其优缺点蛋白质表达是生物学研究中一项重要的技术，它可以通过合成蛋白质来研究其结构和功能。
蛋白质表达系统是实现这一过程的关键工具，主要包括原核表达系统和真核表达系统两种。
本文将对这两种蛋白质表达系统进行介绍，并分析它们的优缺点。
一、原核表达系统原核表达系统是利用原核生物（如大肠杆菌）来表达外源蛋白质的系统。
该系统具有以下特点：1. 高表达水平：大肠杆菌是常用的原核表达宿主，具有高表达水平的优势。
通过利用原核细胞的强大蛋白质合成机器，可以获得高产量的外源蛋白质。
2. 易操作性：原核表达系统相对简单，操作步骤少，易于操作和控制。
不需要复杂的细胞培养条件，可以在常见培养基中进行表达。
3. 快速表达：从启动表达到获得蛋白质通常只需要数小时至数天，速度较快。
这使得原核表达系统在高通量表达和快速实验中具有优势。
然而，原核表达系统也存在一些缺点：1. 外源蛋白质折叠问题：由于原核细胞的机器无法正确折叠某些复杂蛋白质，这可能导致外源蛋白质的不正确折叠和失活。
2. 原核特异性翻译后修饰：原核细胞缺乏一些真核细胞所具有的翻译后修饰机制，这可能影响蛋白质的功能和稳定性。
3. 复杂蛋白质表达困难：对于复杂蛋白质（如膜蛋白），原核表达系统通常无法达到理想的表达水平和正确的折叠结构。
二、真核表达系统真核表达系统主要利用真核生物（如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞）来表达外源蛋白质。
真核表达系统具有以下特点：1. 正确的折叠和修饰：真核细胞具有复杂的蛋白质折叠和修饰机制，能够产生正确折叠和修饰的蛋白质。
2. 适用于复杂蛋白质：真核表达系统适用于复杂蛋白质（如膜蛋白）的表达。
真核细胞提供了正确的环境和细胞器，能够较好地表达这类蛋白质。
3. 适用于大规模表达：真核细胞通常可以进行大规模培养和表达，适用于工业化生产。
然而，真核表达系统也存在一些缺点：1. 低表达水平：相对于原核表达系统，真核表达系统的表达水平较低，可能无法满足高产量蛋白质的需求。
重组蛋白的制备与应用
重组蛋白的制备与应用重组蛋白是一类通过基因工程技术制备出来的在生物体外表达的蛋白质物质，其制备过程包括三个主要步骤：基因改造、载体构建和表达系统选择。
使用这种技术可以获得各种高效、高产、高纯度的蛋白质，其应用广泛，例如制药、生物技术、生物学研究等领域。
一、基因改造基因改造是制备重组蛋白的第一步。
由于自然界中很多生物的蛋白质并不能满足人类的需求，因此必须对其基因进行改造以改变蛋白质的结构和性能。
常见的基因改造技术包括反转录PCR、酶切法、打靶法等等。
这些技术的原理是依据DNA的复制和重新组合原理，通过扩增、切割和拼接DNA分子来改变基因序列。
基因改造的成功关键在于构建基因合适的载体。
载体是用来承载目标基因，从而实现其表达的一种DNA分子，常见的载体包括质粒、噬菌体等。
不同的载体具有不同的优点，在选择载体时需要根据目标基因所需的表达强度、稳定性和是否存在毒性等因素进行综合考虑。
二、载体构建载体是将目标基因导入宿主细胞内进行表达所需要的工具。
载体构建是制备重组蛋白的第二步。
载体的构建通常包括：目标基因的克隆、检测和定向插入等步骤，这些步骤构成了载体构建的关键环节。
在目标基因的克隆过程中，需要对其进行的多个PCR扩增和多个限制性内切酶切割和定向克隆。
因为该过程涉及到许多不同的关键步骤，如果操作不当，将会导致载体构建的失败。
三、表达系统选择表达系统是实现基因表达的系统，是制备重组蛋白的最后一个关键环节。
表达系统的选择必须考虑到目标蛋白的需求和表达目的。
常用的表达系统有：细胞表达系统、水相体系、脂质体、真核和原核表达系统等。
真核表达系统通常适用于较大的重组蛋白以及需要进行修饰的蛋白质，该系统其他优势可能还有较低的真核细胞毒性，转化效率高，能够表达高度复杂的蛋白等。
原核表达系统可以使用大肠杆菌或是其他的真核细胞外原核性微生物表达基因。
由于大肠杆菌是一种常见的微生物，所以原核表达系统被广泛地应用于重组蛋白的表达中。
重组蛋白的表达系统(详细版)
终止子：转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作用分为两类，这两类终止子均在终止点前含有一段7-20bp的回文序列。终止子可以保护mRNA在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的表达量。但是对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率极高，宿主中随时都有充足的mRNA以供翻译，因此大部分在T7系统中表达的重组蛋白并不在意质粒上是否有终止子，只有一些自身带有翻译起始信号的外源基因需要终止子。启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真核宿主）的类型选择不同的启动子以便于目的基因的高效表达。
表4：常用原核表达载体质粒
1.3 优化表达条件
重组蛋白的表达流程很少有一次成形的，为了提高蛋白表达量、改善蛋白质量，表达条件和白不表达时：
2
如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有），首先检查cDNA和质粒是否正确，蛋白对宿主菌是否有很大毒性，然后尝试更换菌株、质粒载体和融合标签。原核蛋白在大肠杆菌中不能表达的情况很少见，通常是真核蛋白不能表达。不能表达的重组蛋白，即使在更换了宿主、载体后可以表达，表达量也不会很高，如果需要大规模生产，最好尝试酵母和昆虫细胞表达系统。
融合标签：融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也不必引入标签。融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒，如pET、pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择。His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（pH8.0），免疫原性差，通常不影响重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度。如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）帮助重组蛋白表达和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标签。标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮助目的蛋白表达，提高表达量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度，对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签；C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区，如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免影响重组蛋白的结构和功能。如果融合标签对蛋白性质有较大影响，但又是纯化所必须的，就可以考虑在纯化过程中去除标签。主要有三种方法：化学裂解，如溴化氰（CNBr）、羟胺（NH2OH）等，能够简单有效地去除标签，但反应条件苛刻（羟胺需要在pH9.0下反应），特异性较差，而且会引入不必要的修饰，除包含体蛋白的处理外已经很少使用了；酶解，如PPase等，其底物一般是一段比较长的肽链，特异性强，是目前比较常用的方法，缺点是酶切反应需要较长的时间，也增加了蛋白纯化的步骤，使纯化变得繁琐；IMPACT质粒，该质粒在纯化标签和目的蛋白之间插入了一个蛋白质内含子（intein），intein具有可诱导的自切割活性，使用IMPACT质粒表达的重组蛋白，只需要改变缓冲液的pH和温度，即可切掉融合标签。
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外源蛋白在酵母菌中表达的一般步骤: （1）将编码外源蛋白的DNA序列克隆到含有酵母启动 子和转录终止子的表达框中； （2）转化及在宿主中稳定维持该DNA融合产物； （3）外源蛋白在特定培养条件下合成； （4）外源蛋白的纯化与及其天然产物的比较。
3.2 高效表达特性 整合型表 达载体 表达载体 甲醇氧化酶启动子 pAOX1
抑制基因
大肠杆菌表达系统
是一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列 使转录在目的基因之后立即停止，避 免多余的转录以节省宿主内RNA的合成 底物，提高目的基因的转录量 防止产生不必要的转录产物，控制目 的基因mRNA的长度，提高 mRNA稳定性， 避免质粒上其它基因的异常表达
终止子
大肠杆菌表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
DNA复制及重组载体的选择系统 原核表达载体 外源目的基因的转录系统
蛋白质的翻译系统
大肠杆菌表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
DNA复制及重组载体的选择系统 原核表达载体 复制子 选择标记
大肠杆菌表达系统 是一段包含复制起始位点和反式因子 作用区的DNA片段。 大肠杆菌基因表达载体一般是质粒表 达载体，有效的复制子包含在质粒中
基 因 表 达 系 统
原核生物表达系统
外源基因
原核生物细胞 基因产物
原核生物表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
原核表达载体
大肠杆菌 芽孢杆菌 链霉菌 蓝藻
原核生物表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
原核表达载体
大肠杆菌
大肠杆菌表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
酵母表达系统的优点：
A.可以大规模生产，有效降低了生产成本 B.收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工 和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳 定 C.很容易纯化
2.酵母表达系统的组成
宿主 自主复制型质粒 质粒载体 选择标记
外源基因表达的相关元件
3.主要酵母表达系统 酿酒酵母表达系统 乳酸克鲁维亚酵母表达系统 甲醇营养型酵母表达系统 裂殖酵母表达系统
(一)以重组杆状病毒为载体的昆虫表达体系
多数杆状病毒表达载体的构建过程大体如下：
① 将目的基因克隆入合适的转移载体
② 用重组的转移载体和相应的野生性或改造过的野
生型杆状病毒DNA共转染昆虫细胞
③ 用噬菌斑分析分离并鉴定阳性重组体
④ 扩增病毒以进行大规模的蛋白生产
⑤纯化所表达的外源蛋白
多核多角体病毒(MNPv)是应用最广的杆状病 毒载体
高效产 生的关 键因素
醇氧化酶-1（AOX1） 的终止子3’AOX1 酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列
受体菌：蛋白水解酶缺陷型
甲醇营养型酵母表达系统的主要优点：
A.应用AOX启动子，转录效率高，易于诱发调控 B.表达质粒易于整合到基因组,不易丢失,适于高度 发酵,产量高 C.表达产物分拣进入过氧化物酶体,利于工业生产和 分离纯化 D.对分泌蛋白的糖基化修饰和糖基化程度适中
复制子
选择标记
使转化体产生新的表型，以便于将转 化了的细胞从大量的菌群中分离出来
大肠杆菌表达系统
氨苄青霉素抗性 四环素抗性 链霉素抗性 氯霉素抗性 卡那霉素抗性 选择标记
显性标记
营养缺 陷标记
使转化体产生新的表型，以便于将转 化了的细胞从大量的菌群中分离出来
大肠杆菌表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
• 该病毒基因组为共价闭合环状双链DNA，长80～200kb， 1，组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配 2，具有与高等生物相似的蛋白翻译后的加工修饰能力
3，表达水平高，可达总蛋白量的50%；
4，可容纳大分子的插入片段； 5，能同时表达多个基因。
外源蛋白的表达的影响因素
• 高质量的培养基是获得高效表达的前提，
拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的
载体系列
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2013.01.08
植物表达载体 Ti质粒表达载体
Ti质粒
• Ti质粒 为植物根癌土壤杆菌菌株中存在的 质粒，其特定部位与植物核内DNA组合来 表达信息，使植物细胞肿瘤化。Ti质粒是 在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体 外自主复制的环形双链DNA分子。它控制 根瘤的形成，可作为基因工程的载体。 • 农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列,可以从农 杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中。 这段DNA序列叫做T-DNA序列。
DNA复制及重组载体的选择系统 原核表达载体 外源目的基因的转录系统
启动子 抑制基因
终止子
大肠杆菌表达系统 是一段能被宿主RNA聚合酶特异性识别 和结合并指导目的基因转录的DNA序列 启动子 种类: 诱导型启动子,Lac、Trp、λ PR tra组成型启动子,T7噬菌体的启动子 是一种控制启动子功能的蛋白质，对 启动子的起始转录功能产生抑制作用 在适当的诱导条件下可使抑制物失活， 启动子功能重新恢复。
3.1甲醇营养型酵母表达系统
甲醇作为唯一的能源和碳源 表达载体：整合体型载体 筛选标记：组氨醇脱氢酶 基因HIS4 启动子：AOX1 作为分泌型表达时，外 源基因需要接上一段信号 肽序列
我国酵母表达载体产品结构分析
毕赤酵母系统模式表达载体
5’AOX1 启动子片段含有AOX1启动子， 在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达; α -因子信号肽序列为约89个氨基酸的 信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上 清中，更利于外源蛋白的纯化； 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基 因的插入提供位点； TT序列提供有效的转录终止和polyA修 饰信号； HIS4为营养缺陷型筛选标志； 3’AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基 因同源重组； 抗Amp基因和pBR322复制起始位点，使 载体可在E.coli中筛选和复制。
A：缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工 B：表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复 杂的复性才能恢复构象和活性 C：背景杂蛋白很多、纯化起来麻烦 D：表达量一般不是很高
1979年，为了克服大肠杆菌表达系统的缺点， 发展了酵母表达系统。最先使用的是酿酒酵 母。 1981年,Hizeman等人首次报道了人重组干扰 素基因在酿酒酵母中表达并获成功。
起始密码子
终止密码子
优势
劣势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读
框架
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能
缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统
基因克隆表达系统成熟完善
内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异
繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传 源蛋白
稳定
已发展为一种安全的基因工程实验体系，
细胞周质内含有种类繁多的内毒素
蛋白质表达系统的选择
大肠杆菌表达系统
基因表达系统
DNA
调控 RNA 翻译 中心法则
蛋白质
基因表达系统
DNA
RNA 翻译
蛋白质
基因表达系统
基因表达系统
基 因 表 达 系 统
原核生物表达系统 真核生物表达系统
酵母 植物 昆虫 哺乳动物细胞
... ...
其它
无细胞系统 胚细胞
... ...
基因表达系统
• 农杆菌侵染植物后， Ti 质粒中的 T-DNA 区段脱离质粒而整合到受体植物的染色体 上。因此，如果把外源基因插入 T-DNA 中， 就有可能携带进入受体植物并整合到染色 体上。 • 农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为 植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁 香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可 以诱导Vir（Virulence region)基因的启动 表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－ DNA 单链切下，而位于根瘤染色体上的操 纵子基因产物则与单链T－DNA 结合，形 成复合物，转化植物根部细胞。
昆虫细胞培养要求相对较高的氧浓度，应
使细胞具有高度活性并维持在对数增长期。
除此之外，使用的载体、启动子、前导肽
以及所表达外源基因的特性也会对表达水
平产生影响。
（二）稳定转化的昆虫表达系统
酵母表达系统
Concept
1
酵母表达系统的产生
2
3 4 5
酵母表达系统的组成
主要酵母表达系统 不同酵母表达系统的特点 酵母表达系统的方法
1.酵母表达系统的产生
基因工程技术的发展为用微生物合成 和生产外源蛋白展示出广阔的前景。长期 以来，人们用大肠杆菌作为宿主表达了多 种蛋白。
大肠杆菌表达系统存在若干缺陷：
农杆菌感染植物细胞的方法
• （1）叶圆片法：用打孔器打取几毫米直径 的叶圆片，表面消毒，进入农杆菌液数秒 后，置于适当培养基上培养2天，，再转到 含有卡那霉素和羧苄青霉素的选择培养基 上培养20天，通过脱分化、再分化长成新 的含有目的基因的植株。
• （2）整株感染：在无菌培养的整株植 株的适当部位上人工造成伤口，用农 杆菌液接种，待形成肿瘤后切下，在 含有抗生素且无激素的培养基上进行 培养并除菌。 • （3）原生质体和农杆菌共培养法：将 除去细胞壁的原生质体与农杆菌共培 养，然后再分化细胞壁、脱分化、再 分化得到含有目的基因的植物植株。
甲醇营养型酵母表达系统的主要不足： A.甲醇不适于食品工业生产 B.易发生火灾
Thank You!
昆虫表达系统 Insect Expression
昆虫表达系统
• 用重组杆状病毒在昆虫细胞系中表达外源蛋白目 前应用较多，对果蝇等昆虫进行稳定转化后可以 获得稳定性和表达效率方面更为优异的表达系统。 • 目前已经利用昆虫表达系统成功地表达了鼠源单 克隆抗体、人一鼠嵌合抗体、单链抗体、人单克 隆抗体及抗体融合蛋白等基因工程抗体分子，这 些抗体分子多数能正确组装，完成糖基化过程， 具有相当的活性。
Ti质粒的转化过程
T-DNA的边界