华南农业大学-LDH同工酶圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳共22页
华南农业大学-LDH同工酶圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase 简称 LDH， EC.1.1.1.27）是催化丙酮酸和乳酸可逆转化的 酶。 • 1959年 Markert 等用电泳的方法将牛心肌提纯 的LDH结晶分离出5条区带，靠近阳极一端的称 LDHl ，靠近阴极一端的称为LDH5；其余3种，由 阳极到阴极依次命名为LDH2 ，LDH3及LDH4。它 们均具有LDH 催化活性，从而首先提出了同工酶 (isoenzyme)的概念。 • 目前已知LDH同工酶是由亚基及M亚基按不同比例 组成的四聚体，它们是H4（LDHl），H3M （LDH2），H2M2（LDH3），HM3（LDH4）及M4 （LDH5）5种。心肌中以LDHl含量高，骨骼肌及 肝中LDH5 含量高。
12
7.2
7.2
30
3
15
72
• （2）把配好的染色液倒入试管中，脱出的凝胶 放入盛有染色液的试管中,避光置37℃水浴中保 温10～20min，待LDH 同工酶呈现蓝紫色区带,回 收染色液。 • （3）用蒸馏水洗3次除去染色液，加入水浸泡， 凝胶底色脱净，背景清晰，把凝胶柱放在灌满水 的试管中，对光观察过乳酸脱氢酶同工酶谱，并 画电泳图或拍照。 • （也可将凝胶板放在保存液中浸泡）
(三)、试剂
1 制备样品有关试剂（老师配） （1）0.01mo1／L pH 6.5磷酸盐缓冲液（PBS）， 用于组织匀浆缓冲液及LDH的染色液 Na2HPO4· 12H2O 0.2256g ，NaH2PO4· H2O 0.2137g，加水定容到200mL。 （2）40%蔗糖溶液 20g蔗糖用水溶解定容至50mL。 （3）0.5％溴酚兰 10mL
聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质.
实验七聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质一实验目的掌握聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质。
二实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰化胺凝胶作支持物的一种区带电泳，由于此种凝胶具有分子筛的性质，所以本法对样品的分离作用，不全决定于样品各组分所带净电荷的多少，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度的作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构，很少带有离子的侧基，惰性好，电泳时，电渗作用小，几乎无吸附作用，对热稳定，呈透明状，易于观察结果。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰化胺基侧链的脂肪族大分子化合物。
三实验器材1、血清及其他蛋白质样品。
2、移液器。
3、稳压直流电源（500V）。
4、玻璃管0 .5cm×7-10cm(×10)。
5、灯泡瓶。
6、注射器10ml(×1)。
7、滴管。
8、培养皿10cm(×5)。
9、圆盘电泳槽。
10、量瓶25ml（×1）、10ml（×1）。
四实验试剂1、1mol/LHCL。
2、丙烯酰胺（Acr）：3、N，N，N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED):密封避光保存.可用N-二甲氨基丙腈或三乙醇胺代替,但效果较差.4、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis):5、三羧甲基氨基甲烷(简称Tris).6、过硫酸铵(A.R)(聚合用催化剂)7、0.05％氨基黑10B溶液:称取50mg溶于100ml水中.8、冰醋酸.9、0.05％溴酚蓝溶液:称取50mg溴酚蓝加水溶解并定容到100ml10、40％蔗糖。
11、20％蔗糖-溴酚蓝溶液：100ml20％蔗糖溶液加50mg溴酚蓝12、甘氨酸-Tris 缓冲液：称取甘氨酸28.8mg，Tris 0.6g加水定容至1000ml （pH8.3）13、1％考马斯亮蓝G250。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告一、实验目的1、学习聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）的基本原理和操作方法。
2、掌握蛋白质和核酸在聚丙烯酰胺凝胶中的分离和检测技术。
3、运用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品的纯度和分子量。
二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成的三维网状结构。
这种凝胶具有分子筛效应，即不同大小和形状的分子在电场中通过凝胶时受到的阻力不同，从而实现分离。
蛋白质和核酸等生物大分子在一定的 pH 条件下带有电荷，在电场中会向与其电荷相反的电极移动。
分子的电荷量、大小和形状等因素共同影响其在凝胶中的迁移速度。
对于蛋白质，通常采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）。
SDS 能使蛋白质变性并与蛋白质结合，形成带大量负电荷的 SDS蛋白质复合物，消除了蛋白质原有的电荷差异，使得蛋白质的迁移速度主要取决于其分子量大小。
对于核酸，常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率更高，适用于分离小片段的核酸，如寡核苷酸和 RNA 片段。
三、实验材料和仪器1、材料标准蛋白质样品（如分子量已知的蛋白质Marker）待测蛋白质样品核酸样品（如 DNA 片段）丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺过硫酸铵（APS）N,N,N'，N'四甲基乙二胺（TEMED）十二烷基硫酸钠（SDS）三羟甲基氨基甲烷（Tris）甘氨酸盐酸溴酚蓝考马斯亮蓝 R-250 染色液脱色液琼脂糖2、仪器垂直电泳槽直流稳压电源移液器离心管微量进样器脱色摇床凝胶成像系统四、实验步骤（一）制胶1、安装电泳槽：将两块玻璃板洗净、晾干，放入电泳槽中，用夹子夹紧，确保玻璃板之间无空隙。
2、配制分离胶：根据所需分离胶的浓度，计算所需丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TrisHCl 缓冲液（pH 88）、去离子水和 APS、TEMED 的用量。
生化实验课件 实验四、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清ldh
精选ppt
6
3．缓冲溶液：
① pH值：溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度， 亦即决定Q。
② 离子强度：一般最适的离子强度在0.02～0.2 之间，溶液的离子强度越高，则电泳速度越慢。
③ 溶液粘度：迁移率与溶液粘度呈反比关系。
精选ppt
7
4．电场强度（E）：
电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降， 也称电势梯度。
分子筛效应与电荷效应分子筛效应与电荷效应进入分离胶后进入分离胶后glygly成为快离子成为快离子分离胶只有分离胶只有电荷效应和分子筛效应电荷效应和分子筛效应根据各根据各蛋白质所带电荷不同蛋白质所带电荷不同分子大小不同而分离分子大小不同而分离精选ppt2019591959年年markertmarkert等用电泳的方法将纯化等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱氢酶的心肌乳酸脱氢酶ldhldh分离出分离出55条区带由阳极到阴极依次命名为阳极到阴极依次命名为ldhldh11ldhldh22ldhldh33ldhldh44ldhldh55精选ppt21将凝胶浸泡在活性染色液中将凝胶浸泡在活性染色液中ldhldh与底物的反应与底物的反应精选ppt22ldh精选ppt23采用pharmacia公司的se250小型夹心式垂直板电泳装置
连续性；缓冲液pH梯度的不连续性；电位梯度的不连续性。
三个效应：浓缩效应、分子筛效应与电荷效应
1. 浓缩效应 1）凝胶层的不连续性
两层凝胶T与C不同 孔径不同
浓缩胶：大孔径 分离胶：小孔径
精选ppt
15
2）缓冲液离子成分的不连续性
甘氨酸 （pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移动， 进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度（）很小， 有效迁移率（M ）很低，移动速度较慢，称为 慢离子。
表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定PPT课件
➢ 使用RNAfold软件对每个区间计算最低自由能，构建最低自由能矩阵。 ➢ 使用Tclass程序对最低自由能矩阵进行t检验及判别分析，得到理论上可以判别表达水平高
低的6个区间组合。
第10页/共51页
➢ 我们将40例数据按75％的比例随机分成两组，多数组应用上述6个区间来建立判别函数
在SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的
亚基或单条肽链的分子量。
第20页/共51页
被分离物质分子量与凝胶浓度的选择
第21页/共51页
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分类：
按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大 类：
➢ 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要 靠电荷和分子筛效应分离。
第1页/共51页
此实验共包括如下三个部分
• 第一部分：外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测 • 第二部分：毕赤酵母蛋白表达产物的SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳分离分析鉴定 • 第三部分：分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表
达的概率
第2页/共51页
第一部分：外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测
➢ 在科研和临床中需要大量的蛋白质，这些蛋白不可能由人体组织或体外细胞培养而大 规模的获得，人们利用一些低等生物的特点，来生成和获得这些人属蛋白质。
➢ 不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度以及电位梯度的不连续性，带 电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分 离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
第22页/共51页
不连续系统的特点
➢ 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。 ➢ 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为的Tris-HC1。 ➢ 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。 ➢ 电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。 ➢ 2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子
生化实验课件 实验四、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清ldh
精选ppt
6
3．缓冲溶液：
① pH值：溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度， 亦即决定Q。
② 离子强度：一般最适的离子强度在0.02～0.2 之间，溶液的离子强度越高，则电泳速度越慢。
③ 溶液粘度：迁移率与溶液粘度呈反比关系。
精选ppt
7
4．电场强度（E）：
电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降， 也称电势梯度。
E↑，v ↑
精选ppt
8
【聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）】
聚丙烯酰胺凝胶的性能 聚丙烯酰胺凝胶的制备 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理
精选ppt
9
一、聚丙烯酰胺凝胶的性能
特性： ➢ 机械强度好，有弹性，透明，相对化学稳定，
对pH和温度变化较稳定，没有吸附和电渗作用。 ➢ 调节单体的浓度和交联度可以控制孔径大小。 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，能分离、小量制备
体浓度。
精选ppt
11
精选ppt
12
【凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响】
凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包 括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。
T为凝胶总浓度，C为交联度。
T ab100% m
C b 100% ab
a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)，m为溶液的终体积(mL)。
凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬，
不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈
糊状；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹
性并且透明。
精选ppt
13
三、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析聚丙烯酰胺凝胶电泳实验是一种分离和分析生物分子的方法，它可以通过电场使不同分子质量的DNA、RNA和蛋白质在物理性质相近的聚丙烯酰胺凝胶中移动，从而实现它们的分离和检测。
本文将就聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的理论、实验步骤、结果分析以及实验存在的问题进行详细的讲述。
一、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳实验主要是通过电场作用，将DNA、RNA和蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中分离并判断分子的大小。
其中聚丙烯酰胺凝胶是一种网状物质，它有很强的吸水性和渗透性，因此可以将生物分子填充其中。
当聚丙烯酰胺凝胶通过电场作用列成微观孔隙时，各种生物分子会在微孔内移动，根据分子的质量和大小，会在不同位置形成不同的电泳带。
在实验中，首先需要制备聚丙烯酰胺凝胶，然后将待测试的样品加入凝胶溶液中均匀混合，再将其注入电泳槽中，加入电解液并通电，通过电泳将被检测的生物分子分离后，用染色剂在凝胶上染色并观察其带型。
二、实验步骤1. 制备聚丙烯酰胺凝胶a. 测量所需聚丙烯酰胺的质量，按照重量比例混合罗丹明B缓冲液和甲醛b. 加入半加固剂后，在模板两边运用吸管将混合液吸入模板内，并加入宽度相等的橡皮垫c. 在上方加入半加固剂，使其混合，并等待其凝固，最后取下橡皮垫，去除凝胶。
2. 样品荧光标记a. 将测试样品制备好b. 将样品添加荧光染料，进行反应后用同样的染料标记分子质量标准。
3. 准备电泳槽a. 连接电源和电极，注入电解液b. 将制备好的聚丙烯酰胺凝胶放入槽中。
4. 进行电泳操作a. 分别添加样品和分子质量标准至凝胶中b. 通过电泳，将生物分子在凝胶中分离和定位c. 取下凝胶并对凝胶染色d. 进行显带，将电泳带进行图像捕捉5. 结果分析a. 在凝胶上观察带型b. 分离它们以确定大小及数量c. 分别进行其电泳常数的测定三、结果分析根据上述的实验步骤，在实验中我们可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，将DNA、RNA 和蛋白质分子分离，并判断分子的大小及数量。
实验六：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶实验报告
班级：植物142 姓名：刘国强学号：1401080229实验六：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工一、研究背景及目的同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
它们是DNA 编码的遗传信息表达的结果。
研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼叶叶片和根部的过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有的操作过程二、实验原理本实验采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，分离小麦幼叶叶片和根部的过氧化物酶同工酶。
利用过氧化物酶在分解过氧化氢的过程中产生自由氧基，从而将联大茴香胺连接到过氧化物酶分子上，使之呈现棕褐色，将电泳后的凝胶置于含有过氧化氢的联大茴香胺染色液中浸泡，有过氧化酶同工酶蛋白的部位便可以观察到褐色的谱带。
通过这些谱带的数量、位置等获得相关信息。
三、仪器试剂1．实验材料小麦幼苗2．仪器:垂直板电泳槽(型号：DYY-III28A型电泳槽厂家：北京市六一仪器厂) 电泳仪（型号：DYY-III2稳压稳流电泳仪厂家：北京市六一仪器厂）主要器具：移液器、微量进样器、培养皿一套（直径15cm）、小烧杯3.试剂（1）分离胶缓冲液(pH8.9 Tris-HCl缓冲液)：称取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用无离子水溶解后定容至100 mL。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(共42张PPT)全
配制20ml不同浓度分离胶 所需各种试剂用量/ml
5% 7.5% 10% 15%
配制10ml浓缩 胶 所需试剂用量
3%
3.33 5.00 6.66 10.00
-
2.50 2.50 2.50 2.50
-
-
-
-
-
3.0
-
-
-
-
1.25
0.20 0.20 0.20 0.20
0.10
1%TEMED 重蒸馏水
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
概述
❖1967年由Shapiro建立。
❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入 离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移 率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽 视。
基本原理
1.蛋白质分子的解聚
(1)SDS
（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂 变性剂
助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠
破坏蛋白质分子的二级和三级结构
❖ (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的 谱带即为蛋白质亚基。
实验原理
浓缩效应：不连续性所致 制胶缓冲液：Tris-HCl （根据亚基分子量分离蛋白质） (3)二硫键是否完全被还原 与蛋白质的结合量：大多数1. (2)样品缓冲液的离子强度 混匀后，置真空干燥器中，抽气10min 圆盘电泳 不连续SDS-PAGE 1967年由Shapiro建立。 注入电极缓冲液 用 (3)二硫键是否完全被还原 选择适当的凝胶浓度。 （根据亚基分子量分离蛋白质） ＞100 糊状不成形，易破碎。
实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳共19页word资料
实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理一聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE），由称盘状电泳。
这种电泳是在区带电泳的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2cm），然后再进行电泳分离。
圆盘电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质的不连续性（discontinuity），凑巧在垂直柱形凝胶上分散出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”和“圆盘状”的英文字头“disc”。
因此英文名称为“disc electrophoresis”，中文直译为盘状电泳。
仪器装置：如图A所示，上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液（图中曲线表示缓冲液面）。
上下槽的缓冲液分别有正负电极通入。
下槽外壳在必要时可通入冷水促使降温，水流方向用箭头表示。
上槽底部有许多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺的玻璃管。
图A在圆盘电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。
由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。
下面就圆盘电泳过程中的三种物理效应的原理加以说明：1.样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。
（1）凝胶层的不连续性：浓缩胶：为大孔凝胶，有防止对流的作用。
分离胶：为小孔凝胶，也有防止对流的作用。
样品在其中进行电泳和分子筛分离。
蛋白质在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。
进入小孔凝胶时遇到的阻力大，速度就减慢了。
由于凝胶的不连续性，在大孔胶与小孔胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。
（2）缓冲离子成分的不连续性。
(3)电位梯度的不连续性。
(4)pH的不连续性：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续性，浓缩胶应有的pH应为8.3，分离胶应有的pH为8.9。