免疫细胞化学步骤

细胞爬片

1、PBS清洗标本3次各1 min。

2、冰丙酮固定15 min。

3 、空气干燥5min。

4 、PBS清洗标本3次各2 min。

5 、0.5%Triton X-100( DPBS配) 孵育1次20 min。

6 、PBS清洗标本3次各2 min。

7 、3%H2O2孵育15 min。

8、PBS清洗标本3次各2 min。

9 、滴加一抗，室温或37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液

10、PBS清洗标本3次各2 min。

11、滴加试剂1，室温或37℃孵育10~20 min。

12 、PBS清洗标本3次各2 min。

13 、滴加试剂2，室温或37℃孵育10~20 min。

14 、PBS清洗标本3次各2 min。

15、DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min。

16、蒸馏水洗2次1 min。

17、苏木素复染0.5~1min。

18、自来水洗30min。

19、树胶封片。

2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4℃冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。

3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）

4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜

5、Triton X-100（屈立通）表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。

这是试剂盒和网上的综合。

固定的目的是保持细胞形态尽量与生活时相似，防止细胞内的酶将蛋白质分解而自溶，沉淀或凝固细胞内物质，保持其与组织生活时相仿的成分，使细胞各部分易于着色。一般涂片如宫颈涂片、痰涂片，涂好后应立即固定。但如液体很稀薄，含蛋白质很少的尿液、胸腹水等，涂片后潮干固定，以免细胞漂落太多，影响制片质量。

(一)固定方法

1．浸入法涂片直接浸入固定液内，因固定液充足，固定效果较好。但细胞易脱落而发生交叉污染，因此应该分瓶固定，固定液回收时应过滤。多数标本用此法固定，固定时间15-30分钟。

2．滴加法将固定液直接滴加到涂片上盖满涂片膜，常用于需作瑞氏染色或迈格吉(MGG)染色的胸腹水细胞涂片。涂片一般是完全干燥后再固定。但因固定液量少，效果较差。

(二)常用固定液

1.95％酒精最常用的细胞固定液，可加入l％量的冰醋酸(按95％酒精99份，冰醋酸1份的比例)，以增强固定效果，并能对抗酒精固定的收缩作用。

2．乙醚酒精固定液由95％酒精49.5ml，乙醚49.5ml，冰醋酸lml组成，固定效果较好。但乙醚易燃、易挥发，价格贵，临床使用较少。

3．Carnoy液无水酒精：氯仿：冰醋酸：6:3:l。此固定液穿透力强，固定效果好。但价格贵，配制麻烦，一般只在核酸、糖原和粘蛋白等特殊染色中应用。

4．甲醇固定效果好，核结构清晰，常用于瑞氏、MGG染色或免疫组化染色的自然干燥涂片预固定。一般滴加数滴铺满涂膜即可。

5．丙酮穿透力强，对酶类固定效果好，常用于酶的组织化学染色固定。

(三)注意事项

1．根据染色要求和固定液特点,选择合适的固定液。如巴氏HE染色，选95％酒精；MGG 染色选甲醇固定液；瑞氏染色以空气干燥固定为宜。

2．防止交叉污染，保持固定液浓度。一般酒精固定液浓度低于90%以下，不再用作固定液。

3．液体标本应在涂片后，让其在奎气中放置片刻，待涂膜周边稍干而中央尚未干时浸入固定液即潮干固定，如等全部细胞干燥后再固定，染色后细胞肿胀、核染色质结构模糊不清，此称为人为退变，常严重影响诊断。

4．标本固定时间不宜短于15分钟，最好在48小时内染色。穿透力强的固定液勿过夜染色。如果固定时间已到，应力争及时染色

一批细胞爬片，需要酒精固定，但一批不能同时做完，怕浪费抗体，想能否在－20度保存？具体操作？谢谢

一批细胞爬片,如果细胞爬片是在玻璃上，冷丙酮固定15-20分钟，然后放-20度，没有问题。

如果细胞爬片是在24孔板或6孔板里进行，冷丙酮会腐蚀板子，最好4%多聚甲醛。

只要是贴壁细胞，这些方法都可用，悬浮细胞要用甩片机或

（来自战友的建议）

收集细胞少许，离心1000r/min，5分钟；

留少许上清，以枪冲散细胞，吸取10μl，滴于玻片上，涂开；

待涂片快干时，以冷丙酮：甲醛=1：1的固定液固定5～10min，室温凉干；

需注意的问题:

1）涂片需均匀，厚薄适度。避免来回涂沫而致细胞变形、厚薄不均。

2) 适宜的涂片是细胞成分应涂在玻片右侧三分之一处，各视野细胞满布，重叠不明显

3) 注意勿混入水分，否则会由于渗透压的改变使细胞溶解。

4) 细胞形态特点与其它方法所取得的细胞学标本略有不同,在辨认时应注意区别。

5) 如果做HE,争取在24小时内染色。

也有用75%酒精固定的，呵呵

细胞学标本的固定方法

固定的目的是要保存细胞的形态结构，以利于染色之后清晰地显示细胞的形态。因此固定液和固定方法便成为重要的因素，选择固定液和固定方法是制做高质量涂片的前提。

1.固定液最常用的固定液为95%的酒精。酒精作为一种脱水剂能够防止细胞内的酶将蛋白

质分解和自溶，凝固细胞内的物质（蛋白质、糖类和脂肪等），使细胞保持清晰的结构，也易于细胞结构的着色。在Pap和HE染色方法制片时，特别注重这种固定液及其方法。这种固定液也能保存抗原，因而利于免疫细胞化学染色。有些实验室在95%酒精中滴加冰醋酸以溶解红细胞。95%酒精是可以满足细胞学标本的基本要求的。

在针吸标本做电镜检查时，应采用4%戊二醛固定24小时以上，在制做电镜切片前还需用1%锇酸固定液固定一小时。

2、固定方法标本在经涂片后固定的方法至关紧要。一般认为采用湿式固定（湿固定）的效果最佳，涂片后趁标本新鲜而湿润时，立即投入盛有固定液的固定缸内。必须注意的是不可久置致使干燥后进入固定液，也不能在固定后干燥，因为干燥涂片均会影响染色的效果。标本若为粘稠物应立即固定；若为液体标本，在树起载玻片不流动的情况投入固定液，为防止收缩流动采用喷雾法固定或滴加法固定。总之，在潮湿状态下固定的涂片染色效果最佳。

对于淋巴结的针吸涂片在固定时，固定液95%酒精的浓度应该在90%至93%的浓度之间，因为淋巴细胞的胞质量少，易为固定液所穿透，造成细胞或核的收缩变形，致使观察困难，尤其是细胞核辩认更是无法观察。

95%酒精固定液就应该及时更换，一般每周更换一次或每固定100张淡片后应更换固定液一次，以保持酒精的浓度在最佳状态。

固定的时间一般常规制片应在2-3小时左右为宜，快速涂片在轻薄和均匀的情况下5分钟左右即可，但要注意多做几张涂片备用并留一张作常规染色。