亚甲蓝光化学法对血液及血制品中淋巴细胞及病毒的灭活效果及其机理
研究亚甲蓝光化学法病毒灭活对血浆有效成分的影响
留取 血 浆 标 本 各 １ ｍＬ ， 置专用冰箱待测 。 １ ． ２ 试 剂 与 仪 器 费 森 尤 斯 传 统 血 袋 ； 中保 康 一 次 性 使 用 病
毒灭 活 装 置 配 套 用 输 血 过 滤 器 （ Ｚ Ｂ ＫＭＢ ０ ３ ） ； 中 保 康 医 用 血 浆 病毒灭活柜 （ Ｚ Ｂ Ｋ — Ｙ Ｂ Ｍ一 ０ １ ） ； 大 容量离 心机 （ 日立 Ｃ Ｒ ７ ） ； 无 菌
何 锐 洪
（ 广 东 中山市 中心血站 ， 广 东中山 ５ ２ ８ ４ ０ ３ ）
摘 要 ： 目的 探 讨 亚 甲蓝 光 化 学 法病 毒 灭 活 对血 浆 主要 质 量 指 标 的 影 响及 亚 甲蓝 残 留 情 况 。方 法 分 别 于病 毒 灭 活 前 和 病 毒 灭 活 后 无 菌 留取 血 浆标 本 ， 对 凝 血 因子 Ｖ 、 Ⅷ、 Ⅸ、 血 浆 纤 维 蛋 白原 （ Ｆ ｇ ） 、 血 浆 总蛋 白 （ Ｔ Ｐ ） 的含量及病毒灭活血浆 亚甲蓝残 留 量 进 行 测 定 。结 果 亚 甲蓝 光化 学 法 病毒 灭 活 对 血 浆 蛋 白浓 度 无 明显 影 响 ， 而 凝 血 因子 、 纤 维蛋 白原 含 量 均 有 一 定 程 度 的 降 低 ，
接驳 机 （ 费森尤斯 ） ； 半 自动 生 化 分 析 仪 （ 上 海科华 ） ； 总 蛋 白试
自动 生 化 仪 上 测 定 ， 亚 甲蓝 残 留 量 采 用 分 光 光 度 法 ， 严 格 按 仪 器 及 试 剂 说 明书 操 作 。 １ ． ４ 统计学处理 用配对 ｔ 检 验。
１ 材 料 与 方 法
１ ． ３ ． １ 新鲜血浆制备
三联采血袋采血后 ， ３ ｈ内 的 血 液 经 ３
８ பைடு நூலகம் ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ ， ５ ｍｉ ｎ两 次 离 心 ， 分离出新鲜血浆 。
血液成分单采治疗技术在血液病治疗中的应用
去白细胞红细胞的临床应用
去白细胞红细胞的临床应用范围非常广： 血液疾病的患者 肿瘤患者的输血 小儿科的贫血患者 老年贫血患者 外科手术前后输血 有输血反应的内科贫血病人 妇产科输血 血液透析的贫血病人 代替悬浮红细胞用于所有贫血、手术病人(有条件)
辐照血
辐照血：用适当剂量的γ射线，灭活具有细 胞免疫活性的T淋巴细胞，但不损伤红细胞、 血小板的功能，以预防输血相关的移植物抗 宿主病的发生。
血小板单采
•
血小板增多症可以用羟基脲或阿那格雷治
疗，在有显著临床症状需要尽快减少血小板计数
时、或者患者不能耐受药物治疗时，可以选择血
小板单采。
• 每次采集通常可以减少一半的血小板量，但实际 计数情况不能达到，是由于分离时血小板从增大
的脾脏内释放出。
• 血小板单采可以减轻心肌梗死、脑缺血、肺栓塞 和胃肠道出血的临床表现，但是能否预防血栓和
治疗性血液成分单采不良反应
• 此外，低钙血症还可能是钙与置换液中的白蛋白 结合所致，或者是输入的供者血浆中所含的枸橼 酸盐所致。轻症者口服补充钙剂即可，症状持续 或严重者，须静脉滴注补充钙剂；若不及时治疗， 可以产生严重的症状：如肌肉收缩、手足抽搐和 癫痫发作。由于TA可能需要大量的血液制品，增 加了感染性疾病的风险，如HIV、人类T淋巴细胞 病毒、肝炎病毒以及细菌和寄生虫的传播；非感 染性疾病的风险，如溶血、发热、变态反应、同 种异体免疫的过敏反应、输血相关急性肺损伤等。
高危型高铁血红蛋白血症。
去白细胞红细胞
• 血液采集后的6小时内将全血或悬浮红细胞中 99.9%以上的白细胞过滤清除掉，可有效地避免系 列免疫性输血不良反应的发生。
少白或去白细胞红细胞临床意义
• 同种异体免疫引起的输血不良反应90%以上是由血液中白 细胞成分引起： 非溶血性输血发热反应 输血介导的免疫功能抑制 急性肺损伤 血小板输注无效 输血相关的移植物抗宿主病
亚甲蓝光化学法灭活血浆病毒的临床应用进展
第44 卷第 5 期 2023 年 5 月安徽医学Anhui Medical Journal亚甲蓝光化学法灭活血浆病毒的临床应用进展陈秀兰 杨君 王红［摘 要］ 输血安全面临免疫反应和感染风险两大管控点。
保障血制品的安全是血液管理的核心，也是临床用血的基本要求。
选择合适的病毒灭活技术是降低经血传播病毒风险的重要手段。
理想的病毒灭活方法应能有效地杀灭和去除病原体，并最大限度地减少对血制品有效成分的损伤。
亚甲蓝光化学法是一种采用光敏剂与光照相结合的技术，能灭活多种病毒，保障血浆制品的安全，具有广阔的应用前景。
［关键词］亚甲蓝光化学法；血浆病毒；输血安全；抗体筛查doi:10.3969/j.issn.1000-0399.2023.05.028依据《中华人民共和国献血法》［1］要求，输血前必须进行乙型肝炎病毒（hepatitis B virus ，HBV ）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus ，HCV ）、人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus ，HIV ）、梅毒螺旋体抗体血清学等常规筛查工作。
病毒窗口期的存在、未知病毒的潜在威胁、试剂灵敏度的限制、人为的差错等都使输血感染的风险难以完全避免。
血浆病毒灭活技术的出现，极大地减少了上述感染风险的发生。
本文对临床应用较广泛的亚甲蓝光化学法（methylene blue photochemis‑try ，MB-P ）灭活血浆病毒的技术原理、应用现状、不足之处及新进展等做一综述。
1 MB-P 灭活血浆病毒的技术原理亚甲蓝是一种芳香杂环化合物，同时具有氧化性和还原性，临床常用作化学指示剂、药物、染料等。
亚甲蓝结合可见光照射处理是一种用于新鲜冰冻血浆 （fresh frozen plasma ，FFP ） 病原体灭活的光动力方法，旨在增加血浆输注的安全性，减少经血传播病毒的风险。
MB-P 的基本原理是在FFP 中使用可溶性亚甲蓝与病毒核酸中的G-C 碱基结合，而经可见光照射激活的亚甲蓝可产生活性氧（单线态氧、自由基等），进而破坏核酸和某些蛋白，使病毒无法复制，失去传染性［2］。
亚甲蓝光化学法灭活血液中HBV的初步探讨
ｂｏ ｄ ＬＵＸ ａ ｇ ｕ Ｆ ＮＲ ｉａ ｇ Ｈ Ｉ ｉ ｉ ＬＮＤ ｎ － ｎ ＨＵ ＮＧＰｎ ｅ Ｕ Ｎ Ｑｎ ．Ｔ ｅＴ ｉ ｆ ｌｏ Ｉ ｉｎ － ， Ａ ｕ－ ｎ ， Ｅ Ｚ— ｎ Ｉ ｏｇｊ ， Ａ ｉ－ ，Ｙ Ａ ｉ ｆ ｆ ｑ ｇ， ｕ ｉ ｆ ｇ ｈ ｈｒ － ｄＡ ｉ ｉ ｅ Ｈ ｓ ｔ Ｕ Ｙ ｔ ｅ ｎｖ ｓｙ ｕ ｎ ｚｏ ６ ０ ｈｎ ； ｏｒ ｐ ｎ ｉｇａ ｔｏ ｆｌ ｔ ｏ ｉ ｌｆＳ Ｎ ａ— ｎＵ ｉ ｒｔ，Ｇ ａ ｇｈｕ５ ０ ３ ，Ｃ ｉａ Ｃ ｒ ｓｏ ｄｎ ｕｈ ｒ ａｄ ｐａ ｏ ｓ ｅｉ １ ｅ
患者 ３ ０例 ，抽取 其静 脉血 并使 用亚 甲蓝光化 学 法灭 活 Ｈ Ｖ，以 ５０Ｉ ｏ Ｌ亚 甲蓝 灭活 病毒 １５ Ｂ ０ ｍ ｌ ￣ ／ ． ｈ后评 价灭 活效果 ，并检 测 灭活前后 红 细胞功 能 。结 果 ：患者 血液 中 ＨＢ Ｎ ＶＤ Ａ拷 贝数 由灭 活前
的 （ ． ９ｘ１ ． ３×１ 。 ｏｉｓｍ 减 少至灭 活后 的 （ ． ６×１ ±５ ０ １ １ ±１２ ０ ０ ）ｃｐｅ／ ｌ ３４ ０ ． １×１ ｃｐｅ／ ｌ（ ０ ） ｏｉ ｍ Ｐ ｓ
新 医学 ２ １ ０ ０年 ８月第 ４ 卷第 ８期 ｌ
论 著
亚 甲蓝 光化 学法 灭活 血 液 中 ＨＢ 的初 步探 讨 Ｖ
中山大 学附属 第三 医院 （１６ ０ 刘相 富。 范蕊芳 黑子 清。 林 东军。 黄 品婕 袁 ５０ ３ ） ， ［ 摘 要］ 青
目的 ：研 究 亚 甲蓝 光化 学法 对 Ｈ Ｖ 的灭 活 效 果 。方法 ：选择 慢 性 乙型病 毒性 肝 炎 Ｂ
影响 。
［ 关键词］ 乙型肝炎病毒 ；血液 ；光化 学法；亚甲蓝
Ａｎ ｅ ｐ ｒｍ ｅ ａｌｓｕｄ ｈｅ ｅ ｅ ｔ ｏ ｅ ｈ ｌ ｎ ｌ ｐ ｔ ｃ ｅ ｉｔ ｙ ｔ ｎａ ｔｖａ ｅ ｅ ａ ｉｉ Ｂ ｉ ｕ ｎ ｘ ｅ ｉ ｎｔ ｔ ｙ ｏｎ ｔ ｆ ｃ ｆ ｍ ｔ ｙ ｅ ｅ ｂ ｕｅ ｈｏ ｏ ｈ ｍ ｓｒ ｏ ｉ ｃ ｉ ｔ ｈ ｐ ｔｔｓ ｖｒ ｓ ｉ
亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测定
医用病毒灭活箱的应用
当前的医用病毒灭活箱是用于光照灭活 时的专用设备，它集光源、温控、机械 摆动等装置于一身，可以根据需要设定 照射强度、照射温度、照射时间和摆动 频率等诸多条件，使用方便。
光源选择：荧光灯
（1）单位时间内照射所释 放的热量较低； （2）达到相同灭活效果的 照射时间最短； （3）波长接600~700nm。
2004年，世界卫生组织将亚甲蓝光化学血浆病毒灭活技术列入 “人血 浆制品病毒灭活或去除指南”， 欧盟和英国也纳入“输血指南”。
2007年乌鲁木齐市血液中心引进该技术, 截至2014年底使用亚甲蓝光 化学病毒灭活血浆13万单位以上。
一次性使用血浆病毒灭活输血过滤器
Depasse 最早提出了 “过滤器的应用”， 极大地简化和改进了 MB-P 法的操作，为 MB-P 法由实验室走向临床迈出了重要一 步。
主要检测设备：固相萃取富集装置
19
亚甲蓝残留量检测方法
使用Waters Oasis小柱萃取血浆中的亚甲蓝
使用前的Waters小柱
1、用6ml甲醇活化Waters小柱 2、加入6ml供试血浆
亚甲蓝残留量检测方法
将萃取出的亚甲蓝洗脱后进行比色
Waters小柱萃取出 血浆中的亚甲蓝
3、萃取亚甲蓝 4、用30％甲醇6mL清洗 5、用含1％乙酸的甲醇溶液2ml洗脱 6、洗脱液离心（3500rpm/10min） 7、用含1％乙酸的甲醇溶液作试剂
辛酸处理法 低pH孵放法
以上方法多用于从原料血浆生产血 浆蛋白制品，均需要将大量的不同 人份的血浆混合处理，不但容易增 加某些不能被灭活病原体（如朊病 毒prion等）的扩散风险，且处理 难度大，费用高。
亚甲蓝光化学法能对单人份血 浆进行病毒灭活，适用于采供 血机构对临床用血浆的病毒灭 活处理，更适合于我国的国情 和临床实际应用。
三种方法灭活血浆病毒的研究
维普资讯
・
２ ・ ４
ｏｕｒ ｌｎｉａｌＴ ｒ ｎｓ ｕｓｏｎ ａ ｎａｌｏｆＣ ｉ ｃ ａ ｆ ｉ ｎｄ Ｌａｂ ａｔ ｙ Ｍ ｅ ｃ ｎｅ， ｐ． ２０ ｏｒ ｏｒ ｄｉｉ Ｓｅ ０２， ｏ ４， ｏ１３ Ｖ ｌ Ｎ
主 细 胞 用 于 培 养 和 活 力 检 测 ， ｅ ｏ细 胞 株 为 ＶＳ ｖｒ Ｖ
病 毒 的 滴 度 下 降 ６ｌＴＣＩ 达 到 灭 活 效 果 。 ｇ Ｄ
表 １ 三 种 方 法 对 Ｆ Ｐ 中模 型 病 毒 的 Ｆ
灭 活 效 果 （ ＴＣ Ｄ ｏ Ｉ ｇ Ｉ ５）
的 宿 主 细 胞 用 于 培 养 和 活 力 检 测 。 病 毒 液 和 含 处 将
浆 而 引起 的 传 染 病 是 个 亟待 解 决 的 问题 。 了加 强 除
筛 选 献 血 者 的 质 量 控 制 外 ， 临 床 用 的血 液 制 品进 对 行 病 毒 灭 活 处 理 是 一 种 最 有 效 的方 法 。 为此 我 们研 究 比较 了二 种 效 果 较 为 可 靠 的血 浆 病 毒 灭 活 方 法 ， 以期 为 选 择 一 种 适 合 于 我 国 国 情 的 病 毒 灭 活 方 法
理 的 血 浆 按 １：１ ０比例 混 合 后 按 上 述 方 法 处 理 并
检 测 病 毒 活 力 。病 毒 滴 定 按 终 点 稀 释 法 ， 胞 病 变 细 效 应 （ Ｅ） Ｋａｂ ｒ公 式 计 算 ＴＣ Ｄ５。 ＣＰ 按 ｒｅ Ｉ ０ ２ 样 品 制 备 及 处 理 随 机 取 采 血 后 ６ｈ血 液 ， 分
２０ ０ ２年 ９月 第 ４卷 第 ３期
・２５ ・
讨
论
பைடு நூலகம்
方 法 对 血 浆 中 蛋 白 质 都 有 轻 微 影 响 ， 其 是 对 血 浆 尤 中 的凝 血 因子 有 一 定 影 响 ， 白质 损 失 一 般 在 ２ 蛋 ５ 以 内 ， 与 国 内外 报 道 相 符 ［ ， 血 浆 的 临 床 应 用 这 ５ 对 ］
亚甲蓝光化学法病毒灭活血浆技术及应用
亚甲蓝光化学法病毒灭活血浆技术及应用亚甲蓝光化学法病毒灭活血浆技术及应用马静瑶徐元宏【摘要】随着医学技术的发展。
血液的安全性越来越受到重视。
为提高输血安全性,在血液检测项目增加的同时,血液检测技术也在不断改进。
但这些都无法完全杜绝输血传播病毒的可能性。
近年来发展起来的亚甲蓝光化学法血浆病毒灭活技术对于提高输血安全性有很大潜力,本文就该技术的研究进展,以及在我国血站开展后的应用情况进行综述。
【关键词】亚甲蓝光化学病毒灭活血浆【文献标识码】【文章编号】??一【中国分类号】.输血既能够治疗疾病,又可能引起经血传播的相关病灭活病毒过程中,病毒核酸是最主要的靶结构,其灭活能力毒性感染。
目前主要通过严格筛选无偿献血者以及对血液依赖于亚甲蓝与病毒核酸的结合口。
亚甲蓝表面携带正电进行病毒检测这两个途径来控制经血传播病毒性感染的发荷.可以嵌入/中。
特别是与病毒核酸的带负电生。
随着科技的发展.血液检测项目逐渐增加。
检测技术不荷的碱基对相结合。
在一项亚甲蓝诱导组氨酸与断改进。
但血液输注的风险仍然存在.原因主要有:一是检交联的试验中发现.亚甲蓝的嵌合作用也很重要】.测方法的局限性。
即使将核酸检测技术应用于血液在光照下,亚甲蓝吸收光能.从基态澈活为单线态筛查中,仍避免不了试剂灵敏度的限制和“窗口期”感染 ,。
可再回到基态或成为更稳定的三线激活态的问题;二是检测项目的局限性.目前常规检测的病毒种类,可通过衰变缓慢回到,或通过型、型仅为,、/.而血浆中还有可能携带未列入途径发生反应。
型途径是指把激发能转移到邻近分检测范围的人类细胞白血病病毒、肝炎病毒子.通过电子转移或夺氢发生氧化还原反应。
如与邻近水分、、,、巨细胞病毒、病毒子反应形成超氧化物、与细胞膜分子反应形成脂过氧化物.等,以及一些未知病毒,上述未经检查的病毒可通过或与包膜氨基脂及多肤作用,从而导致病原体的损伤。
输血途径感染人体。
因此,仅依赖传统的途径尚不能完全型途径发生在有氧环境下,分为快反应和慢反应两种。
评估病毒灭活血浆两种制备方式的应用效果
评估病毒灭活血浆两种制备方式的应用效果【摘要】目的：分析病毒灭活血浆两种制备方式的应用效果。
方法：选取中心血站无偿献血的血液标本60份，时间为2020年4月-2022年4月，随机分为A组和B组，各30份。
分离新鲜血浆后制备病毒灭活血浆，A组采用亚甲蓝光化学法制备，B组采用巴斯德液态湿热法制备。
比较两组血浆病毒灭活后的各项指标水平。
结果：在指标水平上，A组总蛋白（59.75±3.47）g/L、纤维蛋白原（2.57±0.46）g/L、凝血因子Ⅷ（0.86±0.33）IU/ml，分别高于B组的（50.16±2.84）g/L、（1.93±0.32）g/L、（0.68±0.16）IU/ml，P＜0.05。
结论：在病毒灭活血浆的制备过程中，采用亚甲蓝光化学法制备，对血浆成分影响更小，应用效果更为理想。
【关键词】病毒灭活血浆；制备方法；应用效果在临床抢救及治疗当中，经常需要应用输血的方法，并且对于血液需求量也比较高。
为了保证输血的安全性，减少交叉感染的可能，应重点加强血液管理措施，提升血液筛查技术，降低感染性输血风险。
不过，为了进一步提高用血安全，减少输血参与分线，需要将血浆制品进行血液筛查之后，再利用灭菌工艺将参与病原体彻底杀灭，形成合格的病毒灭活血浆，满足安全输血的要求[1]。
目前常用的病毒灭活血浆制备方法，主要由于亚甲蓝光化学法、巴斯德液态湿热法等方法，对于血浆成分可能产生不同影响。
基于此，本文选取中心血站无偿献血的血液标本60份，时间为2020年4月-2022年4月，分析了病毒灭活血浆两种制备方式的应用效果。
1资料与方法1.1一般资料选取中心血站无偿献血的血液标本60份，时间为2020年4月-2022年4月，随机分为A组和B组，各30份。
所有血液标本均经初步检查合格，用于分离新鲜血浆后制备病毒灭活血浆。
1.2方法1.2.1仪器设备材料所用仪器设备和材料主要包括：凝血因子Ⅷ促凝活性检测试剂盒、总蛋白试剂盒、纤维蛋白原检测试剂盒、亚甲蓝、一次性使用病毒灭活输血器材、一次性使用血液病毒灭活剂吸附过滤器、CA-500血凝仪、PUZS-300全自动生化分析仪、ZBK-YBM-01医用血浆病毒灭活柜等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
亚甲蓝光化学法对血液及血制品中淋巴细胞及病毒的灭活效果及其
机理
【摘要】：背景输血是现代医学不可或缺的治疗手段,且随着医学诊疗技术的发展以及社会老龄化程度的提高,临床上对血液的需求持续增加,输血的重要性愈加彰显。
然而,输血亦可能发生不良反应,严重的输血不良反应甚至可给受血者带来灾难性的后果。
受血者遭遇输血不良反应的可能性称为输血风险,由于输血治疗涉及临床各科,覆盖范围广、其个案累计绝对数相当可观,因此,如何在确保临床输血疗效的同时防范输血风险一直是世界卫生组织、各国卫生行政部门和医学界共同关注的热点问题。
输血风险包括感染性风险及非感染性风险两大类。
感染性风险由可通过输血传播的病原微生物构成,其中包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等多种病毒以及细菌和原虫等。
非感染性输血风险则主要由免疫因素引起的输血不良反应所构成。
输血相关的移植物抗宿主病(TA-GVHD)则是后果最为严重的非感染性风险之一,它是由输注了一定数量的具有免疫活性的异体淋巴细胞所引起的致命性输血并发症,目前尚无有效的治疗措施,一旦罹患,死亡率高达90%以上。
血液成分的病原体灭活技术是阻断输血传播病原体,保障输血安全的重要防线。
亚甲蓝光化学法是可用于单袋血浆病毒灭活的病原体灭活技术,已在我国和部分欧洲国家应用于临床,其有效性及安全性已得到证实。
亚甲蓝是一种带正电荷的小分子化合物,可穿过病毒的包膜与核酸结合,并在吸收可见
光提供的能量后发生光化学反应,介导核酸损伤,阻止核酸复制从而导致病原体的灭活。
根据这一原理,理论上该方法也同样适用于淋巴细胞的灭活从而达到预防TA-GVHD的目的。
该原理还为利用核酸扩增技术评价亚甲蓝病毒灭活效果奠定理论基础。
目的1)研究亚甲蓝光化学法对人外周血淋巴细胞在细胞增殖及细胞因子分泌方面的作用,并对淋巴细胞灭活机理进行探讨。
2)进一步深入研究亚甲蓝光化学法对病毒的灭活效果及其机理,建立荧光定量PCR技术对亚甲蓝病毒灭活效果的评价方法,并通过无感染性的可度量核酸破坏程度的质控品建立更为安全、有效的病毒灭活效果评价体系。
方法1)向人外周血淋巴细胞中加入终浓度3μM的亚甲蓝,将混匀后的细胞悬液转移至PVC储血袋内并置于4℃病毒灭活箱中,在照射强度为35000lux的荧光光源下照射50min,作为实验组。
将淋巴细胞在辐射剂量为25Gy的γ射线下辐照作为辐照组。
将处理前后的样品进行淋巴细胞形态、存活趋势、增殖抑制率、细胞因子分泌以及细胞凋亡等检测,分析亚甲蓝光化学作用对淋巴细胞的灭活效果及其机理。
2)亚甲蓝光化学法对Sindbis 病毒的灭活处理条件如下：a.将病毒悬液于避光条件下加入亚甲蓝,使其终浓度为1μmol/L,将病毒悬液转移至储血袋内并置于4℃病毒灭活照射箱中,在光照强度为15000lux的荧光光源下照射,分别于光照0、1、3、5、7、10、20、30min时取样检测；b.将病毒悬液于避光条件下加入亚甲蓝,使其终浓度为1μmol/L,将病毒悬液转移至储血袋内并置于4℃病毒灭活照射箱中,分别于光照强度为0lux、2000lux、50001ux、10000lux、20000lux、30000lux和40000lux的荧光光源下
照射5min后取样检测;c.将病毒悬液于避光条件下加入亚甲蓝,使其终浓度分别为0μmol/L、0.1μmol/L0.5μmol/L、0.7μmol/L、1.0¨mol/L、2.0¨mol/L、3.0μmol/L,将病毒悬液转移至储血袋内并置于4℃病毒灭活照射箱中,在光照强度为15000lux的荧光光源下照射5min后取样检测。
每组实验重复3次。
所有样品均平行检测其病毒残余滴度并通过定量PCR检测样品中病毒核酸含量,分析病毒感染性的下降与其核酸损伤之间的相关性。
向HCV血浆、热力预灭活的Sindbis病毒悬液及HCV病毒样颗粒中加入终浓度1μM的亚甲蓝并将样品转移至储血袋,于4℃病毒灭活箱中在光照强度为35000lux的荧光光源下光照30min,于不同时间点取样并通过定量PCR检测样品中核酸含量,探讨定量PCR技术评价亚甲蓝光化学病毒灭活效果的可行性,同时分析HCV血浆、热力预灭活的Sindbis病毒及HCV病毒样颗粒作为度量病毒核酸破坏程度质控品的可行性。
结果1)亚甲蓝光化学法能够抑制淋巴细胞增殖及其细胞因子分泌。
荧光染色及细胞存活趋势结果显示实验组活性细胞数显著低于对照组及辐照组。
实验组淋巴细胞在PHA刺激下其增殖集落明显小于其他处理组；PHA刺激后3d、4d、5d的增殖抑制率分别为89.31%、100%和94.39%,均高于辐照组。
经PHA刺激后的实验组细胞IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6和IL-8的分泌量显著低于PHA刺激后的对照组,TNF-α、IL-2和IL-12的分泌量与对照组没有显著性差异；经PHA刺激后的实验组细胞除IL-12外,其余细胞因子的分泌量均显著低于PHA刺激后的辐照组细胞；除TNF-α和IL-8外,PHA刺激的实验组细胞细胞因子分泌量与未经PHA刺激之间无显
著性差异。
亚甲蓝光化学作用后的淋巴细胞未检测到caspase-3、caspase-6的蛋白活性以及DNALadder、未出现明显的磷脂酰丝氨酸外翻,推断亚甲蓝光化学作用导致了淋巴细胞的无序死亡。
2)在上述a、b、c三种亚甲蓝光化学灭活处理Sindbis病毒的条件下,Sindbis病毒的灭活效果最终均达 6.0LogTCID50以上,且病毒核酸含量的下降与病毒感染性的消失均具有线性相关性(R20.94),方差分析显示两者间具有极显著的线性相关性(F0.01)。
HCV血浆、热力预灭活的Sindbis 病毒均与活性Sindbis病毒具有相似的核酸动力学曲线及扩增抑制曲线；HCV病毒样颗粒与HCV血浆具有相似的核酸动力学曲线及扩增抑制曲线,且两者的核酸下降量呈现极显著的线性相关性(R20.99)。
结论1)亚甲蓝光化学作用可以有效灭活淋巴细胞,抑制其细胞增殖和细胞因子的分泌(国内首次报道)。
2)亚甲蓝光化学作用可导致淋巴细胞的无序死亡(首次发现)。
3)亚甲蓝光化学法造成了病毒核酸的损伤,且通过病毒核酸含量下降与病毒感染性消失的平行观察证实核酸是亚甲蓝光化学病毒灭活的主要作用靶点,并为荧光定量PCR技术评价亚甲蓝光化学病毒灭活效果提供依据(国际首次报道,相关论文已发表于PhotochemistryandPhotobiology杂志)。
4)热力预灭活的Sindbis病毒以及HCV病毒样颗粒有望发展成为可度量病毒核酸破坏程度的质控品而应用于亚甲蓝病毒灭活效果的评价体系(国际首次提出)。
【关键词】：亚甲蓝光化学法淋巴细胞灭活输血相关的移植物抗宿主病亚甲蓝光化学作用靶点病毒灭活效果评价荧光定量PCR技术质控品
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R457
【目录】：论文摘要6-9ABSTRACT9-15第一部分亚甲蓝光化学法对人外周血淋巴细胞的灭活效果及其机制15-70第一章综述:血液成分病原体灭活技术的研究进展15-41第二章实验研究41-70第一节亚甲蓝光化学法对人外周血淋巴细胞的作用效果41-59材料41-44方法44-47结果47-53讨论53-56参考文献56-59第二节亚甲蓝光化学法对人外周血淋巴细胞的作用机制59-70材料59-60方法60-61结果61-66讨论66-68参考文献68-70第二部分亚甲蓝光化学法对病毒的作用机理及其效果评价70-120第一章综述:核酸扩增技术评价血液病毒灭活效果的研究进展70-80第二章实验研究80-120第一节亚甲蓝光化学法对病毒的作用机理80-107材料80-81方法81-89结果89-101讨论101-105参考文献105-107第二节亚甲蓝光化学法病毒灭活的效果评价107-120材料107-108方法108-110结果110-115讨论115-118参考文献118-120结论120-121附录121-122致谢122 本论文购买请联系页眉网站。