新鲜冰冻血浆的病毒灭活方法及其应用

新鲜冰冻血浆的病毒灭活方法及其应用新鲜冰冻血浆的病毒灭活方法及其应用新鲜冰冻血浆（FFP）几乎含有全部凝血因子，主要用于多种凝血因子缺乏伴有严重贫血的患者，也用于大量失血或凝血试验异常而需要施行侵入性操作的患者以预防出血。

虽然对FFP供者进行了严格的筛选和实验室病毒检测，但经血传播病毒的危险性仍然存在，原因在于：1）检测方法灵敏度有限；2）“窗口期”问题；3）新病毒的出现；4）目前我国检测病毒的种类仅为HIV1/2、HBV、HCV；因此，检测结果阴性并不能排除病毒感染的可能。

据估计，输用血浆的危险程度为10 000 U可发生75次不良反应，每1 000名患者有37起不良反应发生。

1项研究在分析了48年来应用未经病毒灭活血浆和经病毒灭活血浆后发生不良反应需要救治的花费，发现应用病毒灭活血浆至少每年为美国节约200万美元，如果考虑非感染性并发症，如输血相关性急性肺损伤（TRALI），可以为英国每年节约5万英镑［1］。

目前欧洲各国都已禁止使用未经病毒灭活的血浆，国内应用FFP非常广泛，但病毒灭活尚未普遍进行。

目前国内外几种病毒灭活技术正在临床应用，血浆成分及其衍生物主要采用有机溶剂去污剂法（SD）和亚甲兰加可见光法（MBR）,补骨脂素加光照血浆（PLT）已经在欧洲应用。

核黄素加光照（PRT）对血浆、红细胞和血小板3种成分中的病毒可能均有灭活作用，但仍处于研发阶段；除SD法外其它灭活剂的作用都是针对病毒核酸的［2］。

现就血浆病毒灭活的方法和应用作一简介。

1 SD法1.1 灭活方法SD法由纽约血液中心发明，通常用磷酸3N丁酯（TNBP）和吐温-80或胆酸钠，二者协同作用可以溶解和去除病毒的脂包膜而使其灭活。

SD法处理血浆是将＜2 500人份的同型、融化的FFP混合与1％TNBP和1％去污剂TritonX100，在37℃孵育4h，用蔬菜油浸出液萃取之后，用C18层析柱清除溶剂和去污剂。

由此制备的血浆经无菌过滤，200ml分装，再次于-30℃冰冻保存。

该法约使血浆稀释10倍，残留的微量TNBP(1.2 优点SD通过破坏脂包膜病毒外膜结构的完整性或靶细胞受体识别位点，使之丧失感染性，故对脂包膜病毒有较好的灭活效果。

国外评价了几种病毒灭活方法后都认为，SD法对含脂包膜病毒的灭活效果最好，如HBV、HCV和HIV ［3,4］。

实验表明SD处理可使黑猩猩感染HBV 和HCV的剂量（CID50）分别减少106和l05以上，使组织培养感染HIV的剂量(TCID50)减少106以上。

SD法能有效杀灭非典型性肺炎（SARS）冠状病毒，但对非脂包膜病毒如HAV和B19病毒无灭活作用。

研究证实经SD处理后的血浆蛋白质量合格，制备技术简单，有利于大规模生产和临床应用［5］，且不会导致红细胞溶血，不会影响血小板的形态及功能。

研究还证实SDP中凝血因子和蛋白抑制因子（PI）在冻溶后4℃保存8h或常温保存6h均较稳定，融化后除了蛋白S （PS）外，所有凝血因子和PI的活性在融化后4℃储存6d至少还有0 5 IU/ml［6］，保持了较高的质量，应用效能和安全性也没有因为PS和纤维蛋白抑制因子活性降低而受到限制。

SDP混合后可通过血浆抗体和过敏原的中和作用消除TRALI，也可明显减少过敏反应的发生，并可移除残余的血细胞、细胞碎片和细菌，移除血管性血友病因子（vWF）等大分子物质。

从质量角度而言，SDP汇集易于标准化，且易于过程质量控制，同一批中的各种凝血因子、纤维蛋白原(Fg)及总蛋白含量都是相同的，能给出准确含量，易于临床参照使用。

1份研究报告显示，2×106U的SDP和11×106U经SD处理的血液制品输用后，尚未见发现病毒传播。

因此认为SDP对临床使用有实际意义，适合大多数患者选择应用。

1.3 缺点SD法处理血浆后对凝血因子活性影响很大，Doyle等［7］研究发现，经SD处理后，血浆FⅤ、FⅧ和PS分别下降31%、28%和50%；而Heger等［6］研究SDP在冻溶后4℃保存8h或常温保存6h后的凝血因子活性，发现FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ、vWF:Ag、Fg和PC（蛋白C）水平至少平均含有94%，FⅡ、FⅤ、FⅧ和抗凝血酶（AT）水平至少平均含有78%，立刻融化后FⅦ下降到83%，PS下降到43%，与FFP相比有很大差异，且FFP中FⅧ活性下降晚于SDP［8］。

虽然经SD处理后血浆中各种凝血因子均有不同程度的下降，但是仍能满足临床的应用要求。

从处理工艺上讲，大量混合后血浆原始成分可能发生变化，如大分子在vWF SDP及其制备的冷沉淀中缺失，在某种程度上又增加了感染病毒的危险性，其后还需去除血浆中的稳定剂或有毒的化学物质，技术要求高，投资大，且SD法处理还不能对血浆中的未知病毒灭活。

1.4 临床应用SDP已成功地用于治疗DIC 和因大量输血引起的凝血因子缺乏的患者，临床适应证同FFP，即主要用于各种凝血因子缺乏的患者和血栓性血小板减少性紫癜的患者，不能用做血浆容量扩充剂和蛋白支持疗法。

SDP可代替各种凝血因子制剂，用于心脏手术和各种创伤性失血、烧伤、低蛋白血症、各种失血性休克以及血液置换治疗，对于TTP的治疗效果也很好。

SDP 副反应非常少，临床表现包括寒战、腹痛、气短等，总反应率为06％，发生变态反应比FFP 低。

有研究对比较了应用SDP和FFP对心脏手术后患者凝血功能紊乱治疗的效果，发现它们均使Fg、FⅧ、AT、PC、游离PS、α1抗胰蛋白酶和纤溶酶原升高，PT和APTT下降，两者没有明显不同；但应用FFP后PS活性明显增加，PI 明显下降，对凝血酶原片段（F1+2），D二聚体（DD）或Fg降解产物（FDP）没有明显影响；两者临床止血效果无明显不同，均无不良反应，提示2种成分对改善止血和纤溶的效果一样，这已经在严重的PS和PI缺陷的患者治疗中得到证实［9］。

但是若患者有出血危险，准备外科手术或侵入性操作时，只能补充相应成分缺乏的血液，而不能应用SDP［10］。

SDP中的Triton X100能够改变α2抗纤维蛋白酶活性，应用时应考虑可能发生纤溶的危险［11］，特别是对有肝病、继发性FⅤ缺陷和先天性或者获得性PS缺陷的患者应小心使用。

2 MBR法2.1 灭活方法MBR法病毒灭活技术自20世纪90年代初期发展起来，目前主要集中于血浆病毒灭活的研究和临床应用，在欧美等发达国家己开展多年，是一项比较成熟的技术。

MB属于吩噻嗪类染料，是一种光敏染料，可高效灭活含脂包膜病毒，包括逆转录病毒、疱疹病毒、囊膜病毒、黄热病毒等。

MBR灭活病毒的原理为：不可逆的插入病毒核酸，诱导断裂缺口产生，导致病毒功能和遗传结构基础破坏，从而达到灭活病毒的效果。

病毒灭活的效果与MB的浓度和接受光照的强度有关。

实验证明极低浓度的MB(001μg/ml)与卤素灯光照结合可高效灭活血浆中的模型病毒。

1966年，Pohi首次使用MBR血浆病毒灭活的方法，处理程序：首先冻融血浆，冻融后加入MB［(85—120)μg/U］，光源为白色荧光灯。

该方法自1993年起在德国、瑞士等国输血中心使用，收到良好的临床效果，目前已在欧洲多数国家正式获准用于FFP的病毒灭活处理。

2.2 优点实验表明MBR法几乎可灭活所有的含脂包膜的病毒，如经血传播的HBV、HCV、HIV 和HTLV等均有较好的灭活效果［12］，特别适用于单袋FFP的病毒灭活，但对无包膜病毒没有效果。

经MBR处理后的血浆（MBRP）中Fg、FⅦ和FⅨ等的回收率均＞75%，能够满足临床应用要求。

MBRP中丙种免疫球蛋白的二级结构没有明显的改变，基本保持完整，大多数血浆蛋白活性未受影响，处理前后血浆抗体活性没有明显改变，vWF多聚体没有明显的改变，ATⅢ、PC 和vWF:Ag没有减少，MB移除过滤（MBRF）后没有激活C3a、C5a、F1＋2和FⅫa［13］。

MBR 法可以避免血浆大量混合增加传播病毒和其它病原体的危险，对单人份血浆处理方法简单，效果好；而且用MBR法处理不会像SD法那样造成明显的vWF丢失，vWF多态性结构没有改变，但活性有下降。

此外，MBR是治疗氰化物和亚硝酸盐中毒的解毒剂，临床使用剂量比血浆消毒的剂量要大数百倍，在毒理学方面对人体是比较安全的。

MBR法用于单袋血浆处理，处理后对MB 的去除也较为简单，临床使用效果肯定，未见副作用。

MBR法具有高效、安全、简便、毒性低等特点，可大大降低因输血造成的病毒传播，比较适用于我国血站系统。

2.3 缺点研究发现采用高浓度MBR和延长光照时间处理血浆后，大多数血浆蛋白都有复杂的改变，包括纤维蛋白γ链、甲状腺激素结合蛋白和载脂蛋白AⅠ，因此应用MBR时浓度要严格限制［14］。

有研究对MBR处理10份A型血浆后进行评估，凝血因子的损失程度为：Fg 23%，FⅤ10%，FⅧ26%，FⅨ11%和FⅪ13%［13］。

而Aznar等［15］研究发现MBP凝血因子的活性平均丧失25％，其中FⅧ29％，Fg 39％，FⅩⅢ16％，vWF 18％。

vWF活性丧失明显低于FⅧ。

用MBRP和冷沉淀对血管性血友病和FⅩⅢ和Fg缺乏症患者有一定的影响。

MB 和红光处理血浆对血浆的聚合凝结有影响，形成结构更为紧密的纤维凝块，但对纤维蛋白形成凝块的稳定性或纤溶没有影响［16］。

虽然经MB 处理和过滤后血浆FⅧ和FⅨ丧失15％，光照进一步导致10％—15％的其它凝血因子丧失，FⅧ和vWF回收率降低，但是不影响冷沉淀的制备［17］。

MBR处理后的冷沉淀丧失最多的是FⅧ(23%)，其次是Fg、FⅩⅢ和瑞斯托霉素辅因子活性（vWF：RCo），分别是18%、14%和13%，vWF：Ag的丧失最小，仅3％, 对凝血系统的抑制因子很受有影响。

经MBR处理后，Fg浓度有轻微减少，活性却下降31％，纤维蛋白的聚合指数仅有轻微的改变，在MBRF后也没有明显的改变；TT延长了6s，经MBRF后没有进一步的改变。

这种体外的改变类似于纤维蛋白功能失调患者的血浆改变，但通常没有明显的临床症状［18］。

MBR法对非脂包膜病毒，如HAV、B19等无效。

另外，由于MBRP中各种凝血因子含量和总蛋白含量非标准化，所以临床使用无准确参考剂量。

2.4 临床应用MBRP的适应证同FFP。

MBRP 及由其制得的冷沉淀均是临床无病毒传播的有效制品，可安全地治疗血管性血友病，FⅩⅢ和Fg缺乏症等。

应当指出，MBRP不能用于血浆扩充和蛋白支持疗法。

MB冷上清（经MB处理后的FFP，制备冷沉淀后上清液）可以用于治疗血栓性血小板减少性紫癜，纠正全部或者部分凝血酶原复合物缺陷，特别是FⅤ和FⅪ不足［19］。

3 S59及光化学处理法用补骨脂内酯衍生物S59进行光化学处理血浆(PCT FFP)已经发展成为输血应用中灭活血浆中病原体和白细胞的重要方法。