免疫原的制备

用为免疫动物产生抗体的抗原物质如果是人工合成的。质地比较纯，免疫动物后可获得质量好的抗血清。如果以从组织中提取的物质作为抗原，必须经过纯化，保证提取物的纯净，才能获得质量好的抗血清。某些物质的分子量比较小，抗原性弱，属于半抗原，不易使动物产生抗体，必须把这些半抗原连接到大分子物质（载体）上，形成较为理想的免疫原，既能减少免疫注射的次数，又可节约抗原，产生良好的免疫效应，获得高质量的抗体。

（一）载体

用为作为载体的物质较多，下列几类可供选择。

蛋白质类载体：人血清白蛋白（HSA）、牛血清白蛋白（BSA）、兔血清白蛋白（RSA）、牛甲状腺球蛋白（TG）、血蓝蛋白（Hemocyanin）以及人、牛和鸡γ-球蛋白等均可作为载体。这些载体免疫活性较强，有商品供应，容易获得，即使自选提取，操作也较方便。常用的有TG、BSA、HAS等，以TG为好。

多肽聚合物，人工合成的多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、多聚混合氨基酸等，可与半抗原结合，所形成的免疫原可获高滴度、高亲合度的抗血清。

大分子有机化合物和某些粉末，如聚乙烯吡咯酮、羧甲基纤维素、聚甲基丙酸酯微粒、乳胶和炭末等，可吸附半抗原，也可用来作为载体，但用这类载体合成的免疫原免疫动物，所获抗血清的质量不稳定。

载体，尤其是大分子物质本身就是一种抗原，它们进行体内，可发挥致敏作用，激活免疫系统，从而使半抗原也可以使机体产生优质的抗体。因此，如果把半抗原与无免疫原性的载体结合，就不能使机体产生抗体。另外，半抗原与载体结合后，可适当延迟其降解和排出体外，从而可以发挥更久的作用。

（二）偶联剂

半抗原和载体联接，操作比较简单，在一般实验室中都可进行。但对反应条件有一定的要求：在反应过程中半抗原的免疫活性不发生改变，也不应引起载体变性到不溶解的程度。常用的方法是利用偶联剂把半抗原和载体联接起来。用作偶联剂的有碳化二亚胺类、戊二醛、二异氰酸化合物和二卤化二硝基苯等。这些偶联剂使半抗原与载体在-COOH、-NH2或-SH等基团部位发生结合。

碳化二亚胺偶联过程示意如下：

由反应过程可见，碳化二亚胺的偶联作用即可以在NH2部位发生，也可发生在羧基部位。

戊二醛所起的偶合作用与碳化二亚胺有所不同，戊二醛的两个醛基分别与载体和半抗原的-NH2结合。它起一种“桥梁”作用，而把载体与半抗原联接在一起，其反应过程为：

在免疫原的制备中，应根据不同的半抗原选用偶联剂。

（三）制备过程

以制备催产素（OT）免疫原为例：

（1）1mgOT，溶解于1ml 双蒸馏水或0.25%醋酸溶液中。10mgTG溶解于1ml 0.1mol/LPBS(pH7.5)或蒸馏水内。

（2）把OT溶液与TG溶液振荡混匀。

（3）边搅拌边滴加入0.25%戊二醛1ml。加毕后再搅拌5～10min，在室温下继续反应2～3h，就可供免疫动物用。

免疫原以新制备的为好，如果一次制备了较多的免疫原，也可保存在-40℃的低温冰箱内备用。

抗原的制备

除完整的细胞可作为抗原外，各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质，也都具有全抗原或半抗原的性质，某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的，可作为这种细胞的一个标志。由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质，有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质，以供科学研究之用。

一、抗原的提取

抗原的制备是一件十分细致的工作，要制备一个高纯度的抗原，需要付出艰巨的努力，制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面：①利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；②把混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心和超滤等。由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质，其分离方法也不一样，就是同一类大分子物质，因选材不同，所使用的方法也很大差别。因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用，所以在提取前必须针对所欲提取的物质，充分查阅文献资料，选用合适的方法。如果要提取一个结构及性质未知的抗原物质，更需要经过各种方法的比较探索，才能找到一些工作规律和获得预期的效果。

抗原物质的制备，大概要经过如下过程：①材料的选择和预处理；②细胞的粉碎（细胞器的分离）。③提取；④纯化；⑤浓缩或干燥，保存。现分别简述如下。

（一）材料的选择及预处理

选择什么材料主要根据实验目的而定。通常选含量高、工艺简便、成本低的材料。材料选定后，通常要进行预处理，剔除结缔组织、脂肪组织等，把组织块剪碎。若取材后不立即进行提取，则应冷冻保存，动物组织更要深低温保存。某些容易失活的物质，一般宜采用新鲜材料。

（二）细胞的粉碎

除了提取体液、组织间液内的多肽、蛋白质、酶不需粉碎细胞外，凡要提取组织内、细胞膜上及胞内的生物活性物质，都必须把组织和细胞粉碎，使活性物质充分释放到溶液内。不同的组织，细胞的破碎难易不一，因此所使用的粉碎方法也不完全相同。如脑、胰、肝等比较软嫩的组织，用普通匀浆器研磨就行，肌肉、心脏等则需绞碎后再作匀浆。现浆常用的细胞粉碎方法介绍如后。

1．物理法

（1）高速组织捣碎机：通常由调速器、支架、马达、带杆刀叶、有机玻璃筒等组成。把材料放于筒内（约占筒内容积的1/3）固定筒盖，开动马达，调速器由慢逐渐增至所需速度。此法适用于内脏组织。

（2）玻璃匀浆器：由一个内壁经过磨砂的玻璃管和一根一端为球状（球面经过磨砂）玻璃研杆组成。把绞碎的组织置于管内，加适量溶液，插入研杆，用手或电动转动研杆，并上下移动。用此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，对大分子的破坏也少。是粉碎少量软嫩材料（脑、胰、肝等）时常用的方法。

（3）超声波处理法：多用于软嫩组织，根据不同组织采用不同频率，处理10～15min，超声波处理时溶液温度升高，使不耐热的物质失活，使用时为防止温度升高，除间歇开机外，还需人工降温，避免溶液内存在气泡。核酸及某些酶对超声波很敏感，要慎用。