免疫原和抗血清的制备

第三章免疫原和抗血清的制备

第一节免疫原的制备

免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。

一、颗粒性抗原的制备

细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。

细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。

细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。

颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。

二、可溶性抗原的制备和纯化

（一）组织和可溶性抗原的粗提

蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原。

1.组织匀浆的制备通常需要先将来源于人和动物的组织和细胞破碎，再经一定的方法纯化，才能获得所需的抗原。细胞破碎方法有：

（1）高速组织捣碎机法；

（2）研磨法：组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。

2.细胞的破碎除上述机械捣碎获取外，尚有酶处理法，常用胃蛋白酶或胰酶，可获得游离的单个细胞。

细胞抗原分膜蛋白抗原、细胞质抗原（主要为细胞器）、细胞核与核膜抗原，制备这些抗原前均需将细胞破碎，方法有：

（1）反复冻融法：-20℃冷冻，30～37℃融化

（2）超声破碎法

（3）自溶法

（4）酶处理法：胃蛋白酶或胰酶

（5）表面活性剂处理法：十二烷基硫酸钠

3.免疫球蛋白片段的制备五种免疫球蛋白都具抗原性，皆可提取及纯化，但如分解成片段（如Fab

片段、Fc片段、轻链片段等）作为免疫原可制备出分辨力更高的特异性抗血清。制备方法有：（1）非共价键解离法：改变pH环境或用变性剂

（2）共价键解离法

（3）溴化氰裂解法

（4）酶解法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶.木瓜酶可将IgG裂解成2个Fab片段及1个Fc片段；

胃蛋白酶可将IgG裂解成F（ab′）2个片段及数个小片段；胰蛋白酶可将IgG切成不规则的肽链。

（二）可溶性抗原的提纯和纯化

1.超速离心法：适用于少数大分子抗原或比重较轻的抗原，不适用于大多数中小分子抗原。

2.选择性沉淀法：选择沉淀法是采用各种沉淀剂或某些条件使抗原成分沉淀的方法。核酸去除法、盐析法、有机溶剂沉淀法、聚合物沉淀法。其中盐析法是最常被采用，通过硫酸铵使蛋白抗原进行初筛，提取丙种球蛋白及进行抗原浓缩。

3.凝胶过滤法：根据分子大小进行分离纯化。

4.离子交换层析法：根据所带电荷不同进行纯化分离。

5.亲和层析法：与生物分子间不同的亲和性进行分离。

6.电泳法：蛋白质在同一pH环境中，分子量和电荷不同，在电场中迁移速率不同进行分离。

（三）纯化抗原的鉴定

1.蛋白质含量测定：常用的是紫外光吸收法，该法测定280nm和260nm的吸光度（A）值。

2.分子量测定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法、凝胶过滤法等。

3.纯度鉴定采用醋酸纤维膜电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析法等。

4.免疫活性鉴定采用双向免疫扩散法、免疫电泳法或ELISA法等。

三、半抗原性免疫原的制备

半抗原指只具有抗原性而无免疫原性的物质。多见于分子量小于4000的有机物质。半抗原与载体相结合具有免疫原性。

（一）载体

1.蛋白质：以牛血白蛋白最常见

2.多肽聚合物：常用多聚赖氨酸

3.大分子聚合物和某些颗粒聚乙烯吡咯烷酮、药用炭、羧甲基纤维素等皆常用。

（二）半抗原与载体的连接方法

1.物理方法：通过电荷和微孔吸附半抗原。

2.化学方法：通过功能基团将半抗原与载体连接。

（三）半抗原性免疫原的鉴定

20个以上半抗原连接在一个载体分子上，才能有效刺激免疫动物产生抗体。

第二节免疫佐剂

一、佐剂的种类

1.化合物：包括氢氧化铝、矿物油、吐温-80、弗氏不完全佐剂（羊毛脂与液状石蜡的混合物）以及人工合成的多聚肌苷酸：胞苷酸、脂质体等。

2.生物制剂：①经处理改造的细菌及其代谢产物，如卡介苗、脂多糖（LPS）和类脂A、源于分枝杆菌的胞壁酰二肽等；②细胞因子及热休克蛋白等。

最常用于免疫动物的佐剂是弗氏佐剂，弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂（弗氏不完全佐剂加卡介苗）和弗氏不完全佐剂两种。使用时加入水溶性抗原并充分乳化，使抗原与佐剂形成油包水乳剂。佐剂和抗原的比例为1:1。乳化的方法有两种：①研磨法。②搅拌混合法：本法优点是无菌操作，节省抗原或佐剂，且可用此注射器直接注射。缺点是不易乳化完全。

二、佐剂的作用机制

1.改变抗原的物理性状，延缓抗原降解和排除，从而更有效地刺激免疫系统；

2.刺激单核-巨噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力；

3.刺激淋巴细胞增殖和分化；

4.改变抗体的产生类型和诱导迟发型超敏反应。

第三节抗血清的制备

抗血清的制备是将制备好的免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体。采集动物血液，分离含有抗体的血清，即为抗血清。

一、免疫动物的选择

常用的有家兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。

1.抗原来源与动物种属差异越大，免疫原性越强，免疫效果越好。

2.抗体需求量大时，可选用马、绵羊等大动物。抗血清需求量少时，可选用家兔、豚鼠和鸡等小动物。

3.抗血清分为R型和H型

4.对于蛋白质抗原大部分动物皆适合，常用的是山羊和家兔。在某些动物体内有类似物质时，蛋白质抗原对这些动物免疫原性极差，如IgE对绵羊、胰岛素对家兔、多种酶类对山羊，免疫后均不易产生抗体。

二、免疫程序

1.免疫原的剂量：由免疫原性的强弱、动物的个体状态和免疫时间确定。免疫原剂量过大或过小都可使动物产生免疫耐受，在一定剂量范围内，免疫原剂量越大，产生的抗体效价越高。

2.免疫途径：有皮内、皮下、肌内、静脉、腹腔、淋巴结等途径。皮内或皮下免疫时一般采用多点注射。初次免疫一般选择皮内接种，加强免疫和颗粒性抗原一般选择静脉注射。宝贵抗原可选择淋巴结内微