免疫血清制备
抗原与免疫血清的制备(实验报告)
抗原与免疫血清的制备××××××××××抗体是机体接受抗原刺激后产生的一种具有免疫特异性的球蛋白。
在免疫学实践中，为制备抗体常以抗原性物质（细菌、病毒、类毒素、血清及其他蛋白质）给动物注射。
经过一定时间后，动物血清中可以产生大量的特异性抗体。
这种含有特异性抗体的血清称为免疫血清或者抗血清。
免疫血清的制备是一项常用的免疫学技术，高效价，高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂（如用于制备免疫标记抗体等），也可供特异性免疫治疗用[1]。
免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。
如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。
而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。
免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。
因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。
此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。
在本实验中采用ELISA法和凝集反应的原理来测定免疫血清的效价：ELISA测定的原理是利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。
在遇到相应的酶底物时，酶能高效、专一催化、分解底物，生成有颜色的产物。
根据颜色的深、浅、可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的大小。
该方法可对待检样品进行定性和定量分析；同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点，因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。
凝集反应是一种经典的抗原抗体反应，也是高等医学院校学生免疫学实验的重要内容之一，它是指可溶性抗原及其相应抗体在一定条件下出现肉眼可见的沉淀物的现象[2]。
凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类。
前者可利用已知抗血清鉴定未知细菌，优点是极端快速，为诊断肠道传染病时鉴定病人标本中肠道细菌的重要手段；后者是一种定量法，现已发展成微量滴定凝集法，它可利用已知抗原测定人体内抗体的水平(效价)，也是诊断肠道传染病的重要方法。
抗绵羊红细胞免疫血清制备
抗红细胞免疫血清的制备
一、绵羊红细胞抗原的制备
1．采血：无菌试管加EDTA-K2 5滴，静脉采血5ml，加入上述试管，混匀。
2．洗涤红细胞：抗凝血2000r/min离心5min，吸去上清，加入等量无菌生理盐水混匀，2000r/min离心5min，吸去上清，如此连续洗2次，最后一次2500r/min 离心10min以使SRBC密集管底，直至上清液透明无色再吸去上清液，留密集SRBC备用。
3．用生理盐水将SRBC配成需要浓度，即为试验用的SRBC悬液。
如需20%SRBC悬液时，则吸取1ml洗涤后的红血球加生理盐水4ml即成。
二、家兔血清的采集、分离与保存
自家兔耳缘静脉采血（用头皮针）2-3ml，加入塑料试管，温育，2000r/min
离心10min、分离血清分装于EP管中，留作阴性对照。
注：家兔耳静脉采血法：轻弹兔耳，再用75%酒精深擦，使其充血和消毒，然后刺破静脉，用注射器轻轻抽取血液。
三、免疫动物
按如下剂量及程序免疫：
1。
鸡新城疫高免血清的制备
参考内容二
基本内容
鸡新城疫是一种高度接触性的传染病毒性疾病，对养鸡业和家禽业造成巨大的 经济损失。为了有效预防和控制鸡新城疫的传播，生产高质量的鸡新城疫灭活 疫苗至关重要。本次演示将详细介绍鸡新城疫灭活疫苗生产的关键环节质量控 制，包括生产流程、工艺参数、质量控制标准等，旨在提高生产厂家的责任意 识，确保疫苗的质量和安全性。
为了更好地说明鸡新城疫灭活疫苗生产关键环节的质量控制，我们以某生产厂 家的生产流程为例进行阐述。该生产厂家在生产过程中严格遵循了上述关键环 节的质量控制要求。在病毒培养环节，他们选择了合格的种毒，并在适宜的培 养基质和培养条件下进行了病毒的培养。在灭活处理环节，他们选择了有效的 灭活剂，并在适当的灭活时间和温度下进行了灭活处理。
3、静置30分钟后，观察结果，记录待检样品是否出现血凝现象。
二、阳性血清国家标准品的研制
为了提高鸡新城疫血凝抑制试验的准确性，我们需要制备阳性血清国家标准品。 首先，我们需要挑选具有代表性的鸡新城疫康复鸡，并采集其血液样本。将血 液样本通过特定工艺处理后，制备成国家标准品。制备过程中需要注意以下几 点：
鸡新城疫灭活疫苗是一种利用病毒灭活株生产的疫苗，具有高度的安全性和有 效性。疫苗的生产流程包括病毒培养、灭活处理、纯化、配制和包装等环节。 每个环节都需要严格的质量控制，以确保疫苗的质量和安全性。
1、病毒培养
病毒培养是鸡新城疫灭活疫苗生产的第一步，也是关键环节之一。培养病毒的 目的是为了获得足够数量的病毒，以便进行后续的灭活处理。在这个环节中， 病毒的种毒、培养基质和培养条件都需要进行严格的质量控制。种毒必须来自 于已经建立了毒种库的合格供应商，同时培养基质也需要经过严格的检验和灭 菌处理。另外，培养条件也需要进行严格的控制，以确保病毒的正常生长和繁 殖。
4-2 免疫血清制备及效价测定-4
补体溶血反应法
实验目的：
了解补体在溶血反应中的作用 熟悉抗血清效价测定方法 掌握补体介导的细胞溶解机理
实验原理：
作为抗原的绵羊红细胞（sheep red blood cell， SRBC）与其对应抗体（溶血素）结合后，通过补体 活化的经典途径激活补体，经过一系列放大的级联反 应，最后形成膜攻击复合体（MAC），产生膜攻击作 用，导致SRBC溶解，发生溶血反应。
1 1:60
弃去 0.25 ml
4 1:120
7
10
弃去 0.25 ml
0.25ml
弃去 0.5 ml
1:240 1:480 0.25ml 0.25ml
弃去
0.75 ml
2 1:80
5 1:160
8
11
0.25 ml
0.25ml
1:320 1:640 0.25ml 0.25ml
弃去
0.25ml
1.0 ml
补体激活途径
经 典 补 体 激 活 途 径
经 典 补 体 激 活 途 径
实验材料：
1. 1％ SRBC悬液 2. 阳性对照溶血素（抗绵羊红细胞抗体，适当稀释） 3. 豚鼠新鲜血清（当做补体用，临用前稀释成适当浓度） 4. 生理盐水 5. 试管架、试管、吸管、37℃水浴箱 6. 自制的小鼠抗SRBC抗血清
摘取小鼠眼球放血：
将小鼠抓出来，放在鼠笼盖上，用右手抓住尾巴，让它向 前爬，用左手抓住耳朵及脑后毛皮，捏紧，使眼珠鼓出来，用小 指和无名指压住鼠尾巴，小镊子夹住并迅速摘出眼球，将小鼠血 收集入一洁净的平皿中。 尔后，通过拉脱颈椎的方法将小鼠处死。
操 作 步 骤：
1）取洁净小试管12支，排列和做标记如下图所示；
血清制备原理
血清制备原理
血清制备是一种从动物（通常是哺乳动物）的血液中得到的透明液体，其中包含大量的抗体和其他血浆蛋白质。
血清常常被用于实验室研究、临床诊断和治疗等领域。
血清制备的过程主要包括以下步骤：
1. 选择合适的动物供体：通常选择小鼠、兔子、猪等动物作为供体。
供体选择通常基于其体积、免疫反应性和商业可获得性等因素。
2. 免疫刺激：将特定抗原或疫苗注射到动物供体体内，以刺激其免疫系统产生抗体。
注射剂量和时间可根据具体要求进行调整。
3. 收集血清：在一定时间后，通过采集供体动物的血液来获取血清。
最常见的方法是从动物的静脉中采集血液，然后将血液置于离心机中进行离心分离，将血浆与红细胞分离。
4. 血清的保存和处理：分离后的血浆可以通过多种方法进行保存和处理，例如添加抗生素以防止细菌生长、冻干或冷冻在低温下保存。
在血清制备过程中，关键的一点是在注射抗原之后充分免疫供体动物，以激发免疫系统产生大量的抗体。
动物的免疫系统会对抗原做出反应，并产生特异性抗体。
这些抗体会被释放到血液中，从而形成抗体丰富的血清。
血清的制备非常重要，因为血清中含有大量的抗体和其他免疫相关因子，可以被用来检测特定抗原的存在、了解免疫反应机制以及进行疾病的诊断和治疗。
由于血清的制备需要动物供体，并在涉及抗原注射的过程中涉及动物实验伦理问题，因此在实际操作中需要严格遵守伦理规范和法律法规。
动物免疫血清的制备
动物免疫血清的制备目的：探讨制备动物免疫血清的方法和效果，以适应其在实验教学中的需要。
方法：制备好的免疫原，按照一定的免疫程序(免疫途径、次数、间隔时间、剂量)接种给所选择的动物。
待动物体内产生抗体后，采集动物血液，分离血清对其效价进行测定。
结果：经免疫后的抗血清最终分别达到1：2040以上的高效价。
结论：此方法制备的抗血清效价高，特异性高，亲和力强，既经济又方便，适用于实验教学，提高了实验的开出率。
标签：免疫血清；免疫；免疫学试验；效价[文献标识码]B[文章编号]1674-4721(2009)12(b)-139-02动物免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术，广泛用于临床诊断、治疗和预防中，为教学、科研、检验之常用。
在医学免疫学教学中，形象、直观、简易的直接凝集反应有助于学生了解抗原、抗体及抗原抗体间的免疫反应等抽象的概念，免疫血清的质量直接影响实验的特异性和敏感性。
因此，制备高质量的免疫血清是建立高水平检测方法的前提条件。
但免疫血清的制备较复杂，且需学生动手操作，用量较大，为达到这一目的，除了具备理想的免疫原外，还需要选择适宜的动物和设计有效可行的免疫程序或方案。
通过多年的工作实践，笔者制备了高效价、高特异性、高亲和性的动物免疫血清，既经济又方便，供教学、科研所用，提高了实验的开出率。
1方法与结果1.1动物的选择及饲养制备抗血清的动物主要是哺乳类和禽类。
羊、马、豚鼠、兔都是常用的动物，在实验中，选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、要求以及动物个体等因素。
因不同动物对同一抗原的敏感性不同，免疫时至少取用2只以上动物。
选择制备免疫血清的动物必须是适龄、健壮、无感染的正常动物，体重最好在2～3 kg，年龄6个月以上，因雌性动物在性周期的不同阶段和怀孕、授乳时机体对抗原的敏感性有较大改变，所以一般挑取雄性动物。
动物免疫后要认真做好动物的编号、标记、管理和记录，本实验用的动物是健康家兔。
抗血清 的制备
抗血清的制备抗血清制备是一种常见的免疫学实验技术，用于检测特定物质的存在和数量。
下面将对抗血清制备的原理、步骤及注意事项进行详细介绍。
一、原理抗血清是由动物免疫某种抗原制备得到的一种免疫血清，其中包含了特异性抗体。
抗血清制备的原理是通过注射一定量的特异性抗原到动物体内，使其产生特异性抗体，然后收集抗血清。
二、材料和试剂1.抗原：需要制备抗血清的特定抗原。
2.兔、小鼠等动物。
3.盐酸：用于调整兔抗血清的pH值。
4.取血器：用于采集动物血液。
5.离心管、离心机：用于收集血清。
6.不含菌的容器：用于保存抗血清。
三、步骤根据实验要求，制备特定抗原，可以是蛋白质、细胞、病毒、细菌等。
2.制作与抗原相应的抗体兔/小鼠选择适宜种类的动物，注射免疫原，隔一段时间后，在动物体内试验特异性抗体的出现，出现后即可采血制血清。
一般来讲，兔子被认为是制备抗血清的最佳动物，而小鼠常常会出现交叉反应。
3.采集兔血液注射完最后一次免疫原后一周左右，在一个清洁的容器上臂处用取血器采血2-3ml。
离心采集到的兔血液，定量将其分离出血清，再加入盐酸，调节pH值，即可得到兔抗血清。
5.评价抗血清的质量评价抗血清的质量，主要是通过测定抗体滴度来判断抗血清的特异性和强度。
四、注意事项1.严格控制免疫原和免疫过程，确保抗原和抗体的特异性和纯度。
2.合理选择免疫动物种类，不同种类免疫动物会对抗原产生不同反应。
3.采血时要注意安全和卫生，防止感染病毒和细菌。
4.在制备抗血清的过程中需要注意保护动物的健康和福利，并严格按照实验室安全规范操作。
高免血清制作方案
高免血清制作方案
免疫对象：最好是准备淘汰的经产母猪
免疫剂量：4mL/头口蹄疫合成肽苗
免疫程序：首免后15天二免，二免后15天三免，三免后28天取血。
血清制备：三免后28天后，先将猪只消毒，再倒挂起来，在脖子动脉处取血，下面用消毒好的大盆接着，放到室温
（18℃-25℃）过夜，次日将盆中的血块用消毒好的铲子
铲出来，此时可能有少量的溶血，这没关系。
最后1mL
血清中加入2000单位的青霉素和200单位的链霉素。
分装：将制备好的血清放入500 mL或250 mL的消毒好的葡萄瓶。
贮存：-20℃保存，或制备好直接使用。
注射剂量：2mL/kg。
使用对象：各日龄的仔猪。
注意事项：1、铲子、刀子、盆子可先用消毒液消好毒，最后一定要用酒精消毒。
2、采血时母猪可先用乙醚将其麻醉，猪只也应消毒，最
后也用酒精消毒。
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二、宿主方面的因素
1.遗传因素 同种动物不同品系及不同个体对同种抗 原产生不同强度的免疫应答。
2.其他因素 年龄、性别与健康状态。
三、免疫原的剂量及进入途径
（1）剂量 1）剂量不足或过多均不引起免疫应答。 2）重复进入引起强免疫应答。 （2）途径：皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、呼吸 道和口服免疫应答水平依次降低。
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抗原抗体结合力
➢ 静电引力 （electrostatic forces） ➢ 范德华引力:作用最小 （van der Waals interactions） ➢ 氢键:最具特异性
（hydrogen bond ） ➢ 疏水作用力:作用最大
（hydrophobic interactions）
第三周实验步骤
血清制备：
采集剩余小鼠血,将血置室温半小时凝固; 2,000 rpm离心10分钟; 吸取血清置1ml塑料管，做好标记.
血清抗体检测：
以ELISA测定抗体效价，以未免疫鼠 血清作对照。
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Thanks!
抗原抗体结合力示意图
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抗原抗体的亲和力和亲合力
亲和力：抗体分子上一个抗原结合点与 对应的抗原决定簇之间相适应而存在着 的引力，是抗原抗体间固有的结合力
亲合力：抗体结合部位与抗原表位之间 结合的强度
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亲水胶体转化为疏水胶体
抗原抗体的结合后，使水化层表面电荷减少或消失， 水化层变薄，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化 为疏水胶体。如再加入电解质，如NaCl，则进一步使 疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。
实验方案
免疫佐剂制备及动物初次免疫（第一周） 再次免疫及血清采集（第二周） 血清采集及抗体检测（第三周）
W1
W2
W3
初次免疫
再次免疫
未免疫血清采集
初次免疫血清采集
再次免疫血清采集
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实验材料
动物：昆明鼠（每组一只），约20g／只。 抗原：4mg／ml牛血清白蛋白（BSA) 佐剂：完全福氏佐剂。 其它：
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第二次课内容
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抗原抗体反应
抗原与抗体特异性结合，形成抗原抗体复 合物。
物质基础:
1）抗原表位与抗体高变区间的互补结合 2）抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表 面的结合 3）抗原抗体之间的结合力 4）亲水胶体转化为疏水胶体
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免疫应答的影响因素
抗体的产生通常与抗原的质和量、动物种类以及接种的途径有密 切关系。 一、抗原分子的结构和性质 1.分子量：分子量越大，免疫原性越强。 2.化学组成及结构
（1）蛋白质 （2）多糖：具有免疫原性, 较蛋白质弱。 （3）核酸：多无免疫原性。 3.结构的复杂性 4.分子构象 5.易接近性 6.物理状态
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实验目的和要求
了解影响机体免疫应答强度的因素; 明确初次应答和再次应答抗体产生的规律； 制备牛血清白蛋白（BSA）的抗血清； 熟悉佐剂的制备和动物免疫的常用方法； 了解抗体检测的常用方法。
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实验原理
➢ 在免疫学实验中,为制备抗体通常以抗 原性物质给动物注射,经一定时间后, 动物血清中可产生大量特异性抗体， 这种含有特异性抗体的血清称免疫血 清。
PBS、1ml塑料管（保存血清用），无菌小试管， 棉签，1ml注射器、12＃针头等。
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实验流程
W1
W2
12
只 小2 鼠只
初次
免疫
再次
（1只 2 免疫 /组） 只
W3
8 只
小鼠眼眶取血制备血清
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第一周实验步骤
1.抗原制备
1.5mlBSA
4℃保存下次用。
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第一周实验步骤
3.采集阴性血清（每班2只） 用无菌小试管收集未免疫小鼠血（眼眶 放血法），标记后送准备室； 2,000 rpm离心 10分钟; 吸取血清置1ml塑料管，做好标记;
注意: 老鼠断颈椎处死后放到楼梯口的红桶
1.5ml完全 福氏佐剂
搅拌
完全乳化 滴于水中经久不散
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第一周实验步骤
2.动物免疫
用1ml注射器12＃针头吸出完全乳化的抗原 1ml；
换4＃针头双后足垫和背部皮下接种，每处约 10-20ul。(接种处先用碘酒、酒精消毒)
将免疫后的小鼠放回鼠笼。 1ml注射器（内有乳化好的抗原）贴好标签，
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抗体产生的一般规律
初次应答和再次应答规律。
抗体产生的顺序规律：
IgM - IgG - IgA - IgD - IgE
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初次应答和再次应答抗体产生比较
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抗原 (亲水胶体)
+
抗体 (亲水胶体)
电解质
抗原抗体复合物
可见反应
(疏水胶体)
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抗原抗体反应的一般规律
特异性与交叉反应 性；
可逆性：表面的结 合，有可逆性；
抗原抗体交叉反应示意图
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适比性：适合的比 例，反应才可见；
阶段性：不可见 可见ห้องสมุดไป่ตู้应；
条件依赖性：PH， 温度，电解质。
抗原抗体反应比例性示意图
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第二周实验步骤
血清制备： 取首次免疫后的小鼠2只，采集血清(方 法同上),标记后冻存备用。
再次免疫： 其余小鼠于腹腔和背部皮下注射上次制 备的乳化抗原，每鼠注射0.5ml。
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