3第3章免疫原和抗血清的制备多媒体.pptx
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• 通过凝胶分子筛作用，大、中、 小三类分子彼此较易分开。
离子交换层析
• 离子交换层析是利用一些带电离子集团的 凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白 质抗原。
• 1、具有离子交换集团的纤维素。 • 2、具有离子交换集团的交联葡萄糖、琼脂
糖和聚丙烯酰胺。 • 3、被覆以离子化物质的细粉。 • 4、凝胶合成的高度交联树脂。
颗粒性抗原－细胞、细菌、寄生虫 可溶性抗原－蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸
一、颗粒性抗原的制备
细胞抗原：绵羊红细胞 细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原 寄生虫体抗原：虫卵
颗粒性抗原的制备
颗粒性抗原包括人和各种动物细胞抗原以及 各种细菌抗原和寄生虫体抗原。
• 细胞抗原：（绵羊红细胞）一般情况下经 生理盐水洗净，配制一定浓度的细胞悬液， 即可应用。
免疫原的制备
• 细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。
• 鞭毛抗原需用0．3%~0．5%的甲醛处理；菌体 抗原加温100℃2~2．5h去除鞭毛抗原；毒素抗原 则在杀菌后再加0．5%~1．0%氯化钙溶液等。
• 颗粒抗原大多用静脉内注射免疫法，较少加佐剂 作皮内注射。
二、可溶性抗原的制备和纯化
每次30到6 0分钟，时间过长会导致产热。
• 研磨法： • 用玻璃均浆器或乳钵研磨，经过旋转、压挤将
组织粉碎。 • 组织均浆液要离心沉淀，沉淀物组织和细胞碎
片，上清液为提取可溶性抗原的材料。
二、可溶性抗原的制备和纯化
• 组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备
• 制备抗原的细胞包括正常的细胞、传代细 胞或肿瘤细胞。
凝胶过滤法： 利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质进
行分离
离子交换层析法： 利用蛋白质带电荷不同进行分离
离子交换剂： 离子交换纤维素、Biblioteka Baidu子交换凝胶、离子交换树脂
凝胶过滤
• 分子筛层析，具有三维空间 多孔网状结构的物质。
• 将含多种分子量的样品溶液 缓慢流经凝胶柱时，各分子 在柱内进行两种不同运动， 垂直向下移动和无定向扩散运动。
第三章 免疫原和抗血清的制备
第一节 免疫原的制备 一、颗粒性抗原的制备 二、可溶性抗原的制备和纯化 三、半抗原性免疫原的制备
第二节 免疫佐剂 一、佐剂的种类 二、佐剂的作用机制
第三节 抗血清的制备 一、免疫动物的选择 二、免疫程序 三、动物采血法
第四节 抗血清的鉴定和保存 一、抗血清的鉴定 二、抗血清的保存
选择性沉淀法： 核酸去除法－氯化锰、硫酸鱼精蛋白、
链霉素 盐析法－硫酸铵、硫酸钠 有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮 聚合物沉淀法－聚乙二醇
选择沉淀法
• 采用各种沉淀剂或某些条件促使抗原成分 沉淀的方法。
• 核酸去除法：可采用氯化锰、硫酸鱼精蛋 白等核酸提取沉淀剂，而核糖核酸降解法 更简单（采用DNA或RNA酶）
合； ⑤有丰富的微孔，以增加结合容量。
最常用的支持物是Separose4B（琼脂糖珠）
(2)配体的选择条件： ①抗原或抗体必须单一特异性； ②抗原与抗体必须具有较高的亲和力； ③配体必须有一个适当的化学基团。
亲和层析
• 抗原或抗体与支持物的结合
• 将抗原或抗体结合到支持物上的方法达数 十种，可归纳为载体结合法、物理吸附法、 交联法和网络法。
第五节 抗血清的纯化 一、特异性IgG抗体 二、单价特异性抗血清
思考题 小结
• 基本要求： • 掌握：免疫原、抗血清的制备过程。
• 掌握：抗血清的鉴定方法、抗血清的纯化 方法
第一节 免疫原的制备
免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体 或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏 淋巴细胞发生特异性反应的物质。
• 细胞抗原一般分为三个部分：膜蛋白抗原、 细胞质抗原（细胞器）和细胞核与核膜抗 原。
组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备： 反复冻融法－-20℃冻结，然后室温融化 超声破碎法－超声波（1～20kHz） 自溶法－自身酶系 酶处理法－溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶 表面活性剂处理法－SDS、去氧胆酸钠、 二乙基十六烷基溴
• 反复冷冻法：将细胞或整块组织置-20℃ 冰箱内冻结，然后置室温融化，如此反复 两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可 冻融破碎。
• 超声破碎法：利用超声波机械振动的原理 使细胞破碎。常用于处理微生物和组织的 细胞。
自溶法：利用组织和微生物的自身酶系统，在一 定PH和温度下，使其细胞裂解。
• 酶处理法：溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶等， 在一定的条件下能消化细菌和组织细胞。
• 蛋白质、糖蛋白、细菌毒素、酶、补体和 核酸都是良好的可溶性抗原。
• 这些蛋白质多为复杂的蛋白组成，免疫前 需进行纯化。
二、可溶性抗原的制备和纯化
（一）
组织细胞抗原的制备： 高速捣碎法－组织捣碎机捣碎 研磨法－用玻璃匀浆器或乳钵研磨
二、可溶性抗原的制备和纯化
• 高速组织捣碎机法： • 将组织加盐水装入捣碎机筒内，间断进行离心，
• 表面活性剂处理法：常用十二烷基硫酸钠等表 面活性剂处理。
（二）可溶性抗原的纯化
超速离心法： 差速离心法－低速和高速离心交替进行 密度梯度离心法－区带离心法
超速离心分离法
• 常用于分离亚细胞成分及大分子蛋白。
• 差速离心法：用于分离大小差异较大的抗 原颗粒
• 梯度密度离心法：区带分离法，通过梯度 密度离心，使各类分子量的颗粒分离。 （梯度柱）。
• 有机溶剂沉淀法：使用的有机溶剂多为乙 醇或丙酮。
选择沉淀法
• 盐析沉淀法 经典的蛋白质纯化分离技术 抗原的初筛：用不同饱和度的硫酸钠或硫酸
铵使蛋白抗原进行初筛。 • 提取丙种球蛋白:（IgG95%以上）将
33%~50%饱和度硫酸胺沉淀物经去盐后 可直接用于抗体试剂。 • 抗原的浓缩：通过加入硫酸铵，将其沉淀 下来，以利于进一步纯化。
亲和层析
• 是利用生物大分子的生物学特异性，即生 物分子间具有的专一性亲和力的层析技术。
• 在一定条件下，二者能紧密结合成复合物， 如将复合物的已知一方固定在固相载体上， 则可从溶液中专一性地分离和提纯另一方。
亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力 (1)亲和层析支持物的选择：
①非特异性吸附低； ②液体流速快； ③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定； ④有合适丰富的化学基团，与蛋白质或其它化合物结
离子交换层析
• 离子交换层析是利用一些带电离子集团的 凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白 质抗原。
• 1、具有离子交换集团的纤维素。 • 2、具有离子交换集团的交联葡萄糖、琼脂
糖和聚丙烯酰胺。 • 3、被覆以离子化物质的细粉。 • 4、凝胶合成的高度交联树脂。
颗粒性抗原－细胞、细菌、寄生虫 可溶性抗原－蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸
一、颗粒性抗原的制备
细胞抗原：绵羊红细胞 细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原 寄生虫体抗原：虫卵
颗粒性抗原的制备
颗粒性抗原包括人和各种动物细胞抗原以及 各种细菌抗原和寄生虫体抗原。
• 细胞抗原：（绵羊红细胞）一般情况下经 生理盐水洗净，配制一定浓度的细胞悬液， 即可应用。
免疫原的制备
• 细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。
• 鞭毛抗原需用0．3%~0．5%的甲醛处理；菌体 抗原加温100℃2~2．5h去除鞭毛抗原；毒素抗原 则在杀菌后再加0．5%~1．0%氯化钙溶液等。
• 颗粒抗原大多用静脉内注射免疫法，较少加佐剂 作皮内注射。
二、可溶性抗原的制备和纯化
每次30到6 0分钟，时间过长会导致产热。
• 研磨法： • 用玻璃均浆器或乳钵研磨，经过旋转、压挤将
组织粉碎。 • 组织均浆液要离心沉淀，沉淀物组织和细胞碎
片，上清液为提取可溶性抗原的材料。
二、可溶性抗原的制备和纯化
• 组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备
• 制备抗原的细胞包括正常的细胞、传代细 胞或肿瘤细胞。
凝胶过滤法： 利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质进
行分离
离子交换层析法： 利用蛋白质带电荷不同进行分离
离子交换剂： 离子交换纤维素、Biblioteka Baidu子交换凝胶、离子交换树脂
凝胶过滤
• 分子筛层析，具有三维空间 多孔网状结构的物质。
• 将含多种分子量的样品溶液 缓慢流经凝胶柱时，各分子 在柱内进行两种不同运动， 垂直向下移动和无定向扩散运动。
第三章 免疫原和抗血清的制备
第一节 免疫原的制备 一、颗粒性抗原的制备 二、可溶性抗原的制备和纯化 三、半抗原性免疫原的制备
第二节 免疫佐剂 一、佐剂的种类 二、佐剂的作用机制
第三节 抗血清的制备 一、免疫动物的选择 二、免疫程序 三、动物采血法
第四节 抗血清的鉴定和保存 一、抗血清的鉴定 二、抗血清的保存
选择性沉淀法： 核酸去除法－氯化锰、硫酸鱼精蛋白、
链霉素 盐析法－硫酸铵、硫酸钠 有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮 聚合物沉淀法－聚乙二醇
选择沉淀法
• 采用各种沉淀剂或某些条件促使抗原成分 沉淀的方法。
• 核酸去除法：可采用氯化锰、硫酸鱼精蛋 白等核酸提取沉淀剂，而核糖核酸降解法 更简单（采用DNA或RNA酶）
合； ⑤有丰富的微孔，以增加结合容量。
最常用的支持物是Separose4B（琼脂糖珠）
(2)配体的选择条件： ①抗原或抗体必须单一特异性； ②抗原与抗体必须具有较高的亲和力； ③配体必须有一个适当的化学基团。
亲和层析
• 抗原或抗体与支持物的结合
• 将抗原或抗体结合到支持物上的方法达数 十种，可归纳为载体结合法、物理吸附法、 交联法和网络法。
第五节 抗血清的纯化 一、特异性IgG抗体 二、单价特异性抗血清
思考题 小结
• 基本要求： • 掌握：免疫原、抗血清的制备过程。
• 掌握：抗血清的鉴定方法、抗血清的纯化 方法
第一节 免疫原的制备
免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体 或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏 淋巴细胞发生特异性反应的物质。
• 细胞抗原一般分为三个部分：膜蛋白抗原、 细胞质抗原（细胞器）和细胞核与核膜抗 原。
组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备： 反复冻融法－-20℃冻结，然后室温融化 超声破碎法－超声波（1～20kHz） 自溶法－自身酶系 酶处理法－溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶 表面活性剂处理法－SDS、去氧胆酸钠、 二乙基十六烷基溴
• 反复冷冻法：将细胞或整块组织置-20℃ 冰箱内冻结，然后置室温融化，如此反复 两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可 冻融破碎。
• 超声破碎法：利用超声波机械振动的原理 使细胞破碎。常用于处理微生物和组织的 细胞。
自溶法：利用组织和微生物的自身酶系统，在一 定PH和温度下，使其细胞裂解。
• 酶处理法：溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶等， 在一定的条件下能消化细菌和组织细胞。
• 蛋白质、糖蛋白、细菌毒素、酶、补体和 核酸都是良好的可溶性抗原。
• 这些蛋白质多为复杂的蛋白组成，免疫前 需进行纯化。
二、可溶性抗原的制备和纯化
（一）
组织细胞抗原的制备： 高速捣碎法－组织捣碎机捣碎 研磨法－用玻璃匀浆器或乳钵研磨
二、可溶性抗原的制备和纯化
• 高速组织捣碎机法： • 将组织加盐水装入捣碎机筒内，间断进行离心，
• 表面活性剂处理法：常用十二烷基硫酸钠等表 面活性剂处理。
（二）可溶性抗原的纯化
超速离心法： 差速离心法－低速和高速离心交替进行 密度梯度离心法－区带离心法
超速离心分离法
• 常用于分离亚细胞成分及大分子蛋白。
• 差速离心法：用于分离大小差异较大的抗 原颗粒
• 梯度密度离心法：区带分离法，通过梯度 密度离心，使各类分子量的颗粒分离。 （梯度柱）。
• 有机溶剂沉淀法：使用的有机溶剂多为乙 醇或丙酮。
选择沉淀法
• 盐析沉淀法 经典的蛋白质纯化分离技术 抗原的初筛：用不同饱和度的硫酸钠或硫酸
铵使蛋白抗原进行初筛。 • 提取丙种球蛋白:（IgG95%以上）将
33%~50%饱和度硫酸胺沉淀物经去盐后 可直接用于抗体试剂。 • 抗原的浓缩：通过加入硫酸铵，将其沉淀 下来，以利于进一步纯化。
亲和层析
• 是利用生物大分子的生物学特异性，即生 物分子间具有的专一性亲和力的层析技术。
• 在一定条件下，二者能紧密结合成复合物， 如将复合物的已知一方固定在固相载体上， 则可从溶液中专一性地分离和提纯另一方。
亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力 (1)亲和层析支持物的选择：
①非特异性吸附低； ②液体流速快； ③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定； ④有合适丰富的化学基团，与蛋白质或其它化合物结