1-1 免疫血清制备及效价测定-1
抗原与免疫血清的制备(实验报告)
抗原与免疫血清的制备××××××××××抗体是机体接受抗原刺激后产生的一种具有免疫特异性的球蛋白。
在免疫学实践中，为制备抗体常以抗原性物质（细菌、病毒、类毒素、血清及其他蛋白质）给动物注射。
经过一定时间后，动物血清中可以产生大量的特异性抗体。
这种含有特异性抗体的血清称为免疫血清或者抗血清。
免疫血清的制备是一项常用的免疫学技术，高效价，高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂（如用于制备免疫标记抗体等），也可供特异性免疫治疗用[1]。
免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。
如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。
而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。
免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。
因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。
此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。
在本实验中采用ELISA法和凝集反应的原理来测定免疫血清的效价：ELISA测定的原理是利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。
在遇到相应的酶底物时，酶能高效、专一催化、分解底物，生成有颜色的产物。
根据颜色的深、浅、可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的大小。
该方法可对待检样品进行定性和定量分析；同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点，因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。
凝集反应是一种经典的抗原抗体反应，也是高等医学院校学生免疫学实验的重要内容之一，它是指可溶性抗原及其相应抗体在一定条件下出现肉眼可见的沉淀物的现象[2]。
凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类。
前者可利用已知抗血清鉴定未知细菌，优点是极端快速，为诊断肠道传染病时鉴定病人标本中肠道细菌的重要手段；后者是一种定量法，现已发展成微量滴定凝集法，它可利用已知抗原测定人体内抗体的水平(效价)，也是诊断肠道传染病的重要方法。
抗体制备技术的发展和医学应用
抗体制备技术的发展及其医学应用抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。
它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白。
国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。
抗体的2条重链和2条轻链根据氨基酸序列变化程度分为V区和C区，其抗原结合特异性主要由V区中高度变异的超变区决定，3 个超变区共同形成1个抗原决定簇互补的表面，故又称为互补决定区( comp lementarity determining region，CDR)。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb），简称多抗。
多克隆抗体是由多克隆B细胞群产生的、针对多种抗原决定簇的混合抗体。
因为天然抗原是由多种抗原分子组成的，每种抗原分子又含有许多抗原决定簇，每一种抗原决定簇可激活相应的B细胞克隆，进而分化、成熟并合成相应的抗体。
由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。
因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。
1 抗体的发展抗体的研究过程经历了免疫血清学研究、单克隆抗体研究和基因工程抗体研究3个不同阶段。
1.1 免疫血清学研究阶段免疫动物产生的抗体是多种抗体的混合物，所以早期制备的抗体是多克隆抗体. 多克隆抗体是人类有目的地利用抗体的第1步，其在生物医学等方面的应用已有上百年的发展历史. 但多克隆抗体具有不均一性，特异性差且动物抗体注入人体会产生严重的过敏反应等特性，限制了其在疾病诊断和治疗中的应用。
免疫血清的制备及效价测定在临床免疫学检验实验教学中的应用
文 献 标 识 码 ：Ｂ
文 章 编 号 ：１６７３—４１３０（２０１３）１０—１３３６—０２
的 健 康 成 年 雄 性 家 兔 ，６只 ／组 。制 备 ］．５ 绵 羊 红 细 胞 （ＳＲＢＣ）悬 液 ４ ℃冰 箱 保 存 备 用 。 免疫 途 径 为 抽 取 １．５ ＳＲ ＢＣ悬 液 ，腹 腔 多 点 注 射 ，时 间为 ２ ｄ短 期 间 隔 免 疫 ，每 只 每 次 ２ ｍＬ，ＳＲＢＣ共 免 疫 ９次 】。 １．３ 方法 １．３．１ 收 集免 疫 血 清 于末 次 免 疫 后 两 周 采 集 兔 静 脉 血 ，置 于无 菌 容 器 ，并 做 好 标 记 ，４ Ｃ冰 箱 中 ２４ ｈ。待 血 清 析 出 后 ，收 集 血 清 分 装 成 小 瓶 ，做 好 标 记 ，一８Ｏ℃冰 箱 保 存 。 １．３．２ 血 球 凝 集 法 筛 选 抗 血 清 将 分 离 的 新 鲜 血 清 灭 活 补
高效 价 、高 特 异 度 的 免 疫 血清 是 免 疫 学 实 验 室 必 不 可 少 的 生物 制剂 ，是 高 等 医 学 院 校 学 生 免 疫 学 实 验 的重 要 内容 ｌ１】。 而 目前 ，在 各 大 医学 院 校 的 医学 实 验 课 中学 生 更 多 应用 的是 市售 的 商 品诊 断试 剂 ，虽 然 方 便 简 单 ，但 是 学 生 对 免 疫 血 清 的 制 备 、 效 价 的 鉴 定 及 制 备 的 注 意 事 项 以及 实 验 结 果 偏 移 与斌 剂 的 关 系 了 解 甚 少 ，同时 极 大 地 增 加 了实 验 费 用 。故 引导 学 生 自己 动 手 制 备 免 疫 血 清 ，对 检 验 专业 的学 生来 说很 有必 要 。 免疫 血 清 的 制 备 是 一 项 综 合 性 实 验 ，在 实 验 中 ，学 生 不 但 能 将 基 础 课 程 和 专 业 课 程 的 理 论 衔 接 起 来 ，同 时极 大 地 培 养 学 生 实 践 动 手 能 力 、科 研 创 新 能 力 和 团 队协 作 精 神 。 １ 实 验 方 案设 计 １．１ 确 定 实验 人员 ２００８级 检 验 专 业 学 生 为 实 验 的 执 行 者 ， 按 成 绩 （好 中差 ）每 ６人 分 为 一 组 ，全班 分 为 ５组 。 １．２ 教师 指 导 学 生 确 定 实 验 方 案 实 验 动 物 为 体 质 量 ２～ ３
血清抗体效价的测定
实验报告
10.选择波长630nm，将酶标板置于载板台上，开始扫描，测定OD值。
结果如下所示：
思考题：
1.查阅资料，了解共有哪些类型的ELISA实验，以及本实验中所用ELISA属于哪一类？答：本实验中所用ELISA属于间接法ELISA。
①直接ELISA
原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
②间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
③双抗夹心法ELISA
原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异。
生化免疫技术----免疫血清的制备及效价测定
免疫血清的制备及效价测定制备免疫血清的传统方法是将抗原注入动物体内，由动物体内 B 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。
由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原受体的 B 细胞系产生该决定簇的抗体，因此用抗原免疫机体获得的免疫血清一般均为多克隆抗体。
制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案（加强免疫次数，间隔时间，佐剂的使用等）等。
因此要获得高质量的免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方法。
测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集实验，沉淀实验、溶血实验， ELISA 等均可用于对抗体效价的测定。
第一部分、免疫血清的制备我们要制备的是多克隆抗体----抗IgG抗体的制备。
Ig是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。
可以刺激异种动物产生抗Ig血清，经适当提取后，产生抗Ig抗体，又叫第二抗体或抗抗体。
在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig抗体。
【实验材料】1．动物IgG（兔源的，购买）2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂3．青霉素和链霉素4．实验动物： BALB/c小鼠5．无菌 1ml 注射器6. 生理盐水，酒精棉等【实验步骤】1. 免疫程序：40 ug+弗氏佐剂+青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml+生理盐水混悬液背部皮下多点注射，隔10天加强免疫2次，腹腔注射20ug+不完全弗氏佐剂，一周后收血清。
一般在末次免疫结束后的第7 天,自鼠尾取少量血,分离血清,采用间接法ELISA 分析血清中抗体的效价，达到效价即可收取。
2. 获得免疫血清：小鼠摘眼球取血,收入小试管中,3000转/分离心5分钟,上清即为免疫血清。
第二部分、免疫血清质量评价一、 效价测定抗体效价测定方法很多，本实验采用琼脂扩散法，ELISA法—）、琼脂扩散法1.操作步骤（具体见附注）⑴ 做琼脂板，打梅花孔。
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
《免疫血清的制备》课件
总结
免疫血清的制备是一项复杂的过程，需要严格的质量控制。同时，免疫血清 在疾病诊断、生物学研究等方面具有举足轻重的作用。
参考文献
• 张三，李四。免疫学。北京：人民卫生出版社，2015。 • 王五，赵六。生物制品生产技术。北京：化学工业出版社，2016。
将免疫原注射到动物体内，使其免疫产生特异性抗 体。
采血
采集免疫动物的血液，制备成免疫血清。
灌装和贮存
对免疫血清进行筛选、灌装和储存。
体外机制合成免疫血清的步骤
1
抗原制备
制备抗原并纯化，确保其具有特异性。
抗体产生
2
利用体外细胞培养方法合成特异性抗体。
3
免疫沉淀
用盐析法或其他方法将抗体沉淀下来。
纯化和灌装
4
对产生的免疫血清进行纯化和灌装。
免疫血清的质量控制
纯度检测方法
免疫电泳、SDS-PAGE等方法可以检测免疫血清 的纯度。
效价测定方法
ELISA、放射免疫测定等方法可以检测免疫血清 的效价。
免疫血清的应用案例
免疫血清在疾病诊断中的应用
检测患者血液中是否存在特定抗体，以确诊疾病。
免疫血清在生物学研究中的应用
免疫血清的制备
免疫血清是一种重要的生物制品，本课程介绍了免疫血清的制备方法、质量 控制和应用案例。
背景介绍
定义
免疫血清是从免疫动物血清或体外制备中获得的含有特异性抗体的血清。
用途和重要性
免疫血清广泛应用于疾病诊断、生物学研究等领域，对于人类健康和科学发展具有重要意义。
动物免疫血清的
免疫血清的制备实验报告
实验报告实验名称多克隆抗体的制备一（抗血清制备）实验日期院系专业班级姓名学号一、实验目的了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术。
二、实验器材试剂：酒精棉球、NDV灭活油乳剂疫苗、麻醉剂器材：兔笼、注射器、剃毛剪、手术刀、止血钳、手术剪（组织剪、眼科剪）、动脉夹、眼科剪、动脉导管、纱布、棉线、细线、培养箱、冰箱、结扎细线、离心机、温箱三、实验原理1.机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产体液免疫和细胞免疫的过程。
一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构——抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。
2.将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。
抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。
抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。
待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。
3.由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体。
4.多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。
对于免疫原性较弱的可溶性抗原（如蛋白质类抗原）要加入佐剂，以增强免疫性。
3. 放37度温箱温浴，是为了让血液内纤维蛋白原收缩，降低血清和红细胞的粘连，从而使使血清更容易与红细胞分离，不易产生溶血现象。
4. 在4℃冰箱内放置使血清析出，低温有利于稳定抗体等蛋白质的结构，防止其变性而丧失功能。
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实验目的和要求
1、学习抗血清的制备方法； 2、掌握抗血清的收集和保存方法； 3、掌握免疫血清效价的测定方法。
实验原理
制备免疫血清的基本方法是将抗原注入动物体内，由动物体内特异的B淋 巴细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决 定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原决定簇受体的B淋巴细胞系产生 针对该决定簇的抗体，因此用抗原免疫动物获得的免疫血清一般为多克隆抗体 （polyclonal antibody）。
本次实验将采用溶血实验测定所获免疫血清的效价。
• 抗原的两种特性：免疫原性与抗原性
• 免疫原性的本质——异物性
• 与机体亲缘关系越远，组织结构的差异越 大，异物性越强。
实验材料
1. 40% SRBC 2. 18-22g的BALB/C系小白鼠 3. 无菌1ml 注射器 4. 抗凝剂（枸橼酸钠或肝素） 5. 新鲜豚鼠血清（作为补体用） 6. 小试管等
实验内容
1、免疫动物
初次免疫小鼠为腹腔注射40%绵羊红细胞 （SRBC）0.2ml，以后分别于第4天、第7天和第10 天时间，以相同免疫剂量、相同免疫途径加强免疫。
小鼠腹腔注射
1. 小鼠腹腔注射可以用1ml的注射器，配合4号针头。 2. 腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的
尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。 这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损 伤大肠、小肠等器官。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器 官。 3. 尤其是对于体重较小的小鼠，腹腔注射时针头可以在腹部皮 下穿行一小段距离，最好是从腹部一侧进针，穿过腹中线后 在腹部的另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头， 并轻微旋转针头，不要越轨。20 20年12 月12日 星期六 10时9 分59秒1 0:09:59 12 December 2020
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9、一个人即使已登上顶峰，也仍要自 强不息 。上午 10时9 分59秒 上午10 时9分10 :09:592 0.12.12
• 10、你要做多大的事情，就该承受多大的压力。12/12/
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1、有时候读书是一种巧妙地避开思考 的方法 。20.1 2.1220. 12.12Sa turday, December 12, 2020
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2、阅读一切好书如同和过去最杰出的 人谈话 。10:0 9:5910: 09:5910 :0912/ 12/2020 10:09:59 AM
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3、越是没有本领的就越加自命不凡。 20.12.1 210:09: 5910:0 9Dec-20 12-Dec-20
• 13、无论才能知识多么卓著，如果缺乏热情，则无异 纸上画饼充饥，无补于事。Saturday, December 12, 2020
12-Dec-2020.12.12
• 14、我只是自己不放过自己而已，现在我不会再逼自 己眷恋了。20.12.1210:09:5912 December 202010:09
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6、意志坚强的人能把世界放在手中像 泥块一 样任意 揉捏。 2020年 12月12 日星期 六上午 10时9 分59秒1 0:09:59 20.12.1 2
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7、最具挑战性的挑战莫过于提升自我 。。20 20年12 月上午 10时9 分20.12. 1210:0 9December 12, 2020
2020 10:09:59 AM10:09:592020/12/12
• 11、自己要先看得起自己，别人才会看得起你。12/12/
谢 谢 大 家 2020 10:09 AM12/12/2020 10:09 AM20.12.1220.12.12
• 12、这一秒不放弃，下一秒就会有希望。12-Dec-2012 December 202020.12.12
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4、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的 错儿。 10:09:5 910:09: 5910:0 9Saturday, December 12, 2020
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5、知人者智，自知者明。胜人者有力 ，自胜 者强。 20.12.1 220.12. 1210:0 9:5910: 09:59D ecembe r 12, 2020
制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响， 主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案 （免疫次数、间隔时间以及免疫佐剂的使用等等）。因此要获得高质量的免疫血 清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方案。
测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集反应、沉淀反应、溶血反应、 ELISA分析等均可用于对抗体效价的测定。