常见赤潮藻类的变性梯度凝胶电泳分析

第32卷第5期暨南大学学报（自然科学版）Vol．32No．5 2011年10月Journal of Jinan University（Natural Science）Oct．2011常见赤潮藻类的变性梯度凝胶电泳分析邵娟，王朝晖，林朗聪，张珂（暨南大学水生生物研究所，广东广州510632）［摘要］为了解我国典型有毒有害赤潮藻类的变性梯度凝胶电泳（DGGE）指纹图谱以及DGGE技术在赤潮藻类分析鉴定中的作用，本课题组运用DGGE技术，研究了我国沿海7种重要赤潮藻类的单一种类以及混合种类样品的18S rDNA V3区的DGGE指纹图谱，并且对2009年10月底在广东省珠海海域发生的双胞旋沟藻（Cochlodini-um geminatum）赤潮样品进行了DGGE分析．结果表明，DGGE技术能够对环节环沟藻、海洋原甲藻、血红哈卡藻、锥状斯氏藻、中肋骨条藻、塔玛亚历山大藻、双胞旋沟藻7种常见的海洋赤潮藻类具有较好的区分效果，同时监测出赤潮样品中双胞旋沟藻、血红哈卡藻、环节环沟藻和海洋原甲藻4种优势种，种类组成与显微镜观察结果具有较好的一致性．结果说明DGGE技术可作为一种辅助方法对赤潮藻类进行分类鉴定．［关键词］变性梯度凝胶电泳（DGGE）；海洋微藻；双胞旋沟藻；赤潮；聚合酶链式反应（PCR）［中图分类号］Q178．53；X55［文献标志码］A［文章编号］1000－9965（2011）05－0504－05Analysis of harmful algal bloom species using denaturinggradient gel electrophoresis（DGGE）SHAO Juan，WANG Zhao-hui，LIN Lang-cong，ZHANG Ke（Institute of Hydrobiology，Jinan University，Guangzhou510632，China）［Abstract］Denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）fingerprints of18S rDNA V3region of single species and multi-species of seven harmful algal bloom（HAB）taxa were studied in this study．The purpose is to understand DGGE fingerprints of typical HAB species from Chinese sea areas and the use of DGGE in the identification of HAB specie．A nature sample from the Cochlodinium geminatum bloom in Zhuhai coasts in October2009was analyzed．Results showed that distinguish lanes appeared in DGGE fingerprints by the seven HAB species including Gyrodinium instriatum，Prorocentrum micans，Akashiwo sanguinea，Scrippsiella trochoidea，Skeletonema costatum，Alexandrium tamarense and Cochlo-dinium geminatum．Meanwhile four dominant species（Cochlodinium geminatum，Akashiwo sanguinea，Gyrodinium instriatum and Prorocentrum micans）were observed in fingerprint of the bloom sample，which were consistent with the microscopical observation．The results suggested that DGGE technique could be applied as an auxiliary method for HAB species identification and analyzing．［Key words］denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）；marine microalgae；Cochlodinium geminatum；harmful algal bloom；polymerase chain reaction（PCR）［收稿日期］2011－07－13［基金项目］国家自然科学基金资助项目（41076093）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（21611417）［作者简介］邵娟（1986－），女，硕士研究生，研究方向：海洋环境与赤潮，E-mail：shao123456juan@126．com通讯作者：王朝晖（1968－），女，教授，博士，研究方向：海洋生态学变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术是由Fischer 和Lerman［1］于1979年最早提出的用于检测DNA 突变的一种电泳技术，是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开．1993年，DGGE技术被运用至微生物生态学研究中［2］，主要用于分析不同环境中微生物的分子多态性和群落结构，研究结果表明DGGE技术能很好地反映水体、土壤以及污染环境中微生物群落结构特征和基因多态性［3－6］．赤潮是目前全球所面临的重大海洋环境问题，赤潮藻类分类是赤潮研究基础．传统的藻类分类方法主要是根据藻细胞形态学特征和生理生化特点进行分类，一般是运用光学显微镜以及电子扫描显微镜对藻类的外形特征进行观察．虽然形态学方法比较直观，但有的藻细胞形态学差异微小，在光学显微镜下很难区分，特别是有些有毒有害种类［7］．随着分子生物学的发展和完善，为赤潮藻类的分析鉴定提供了新的方法，国内外有很多学者利用分子技术来研究浮游植物的分类，多数研究集中在藻类的分子进化系统发展和检测等方面［8］．但是目前有关DGGE技术在海洋环境中的运用多集中在微生物方面［9－10］，有关该技术在浮游植物的研究报道还非常有限［11－12］．Wang等［11］研究证明用DGGE技术能够较好区分形态相近的18种甲藻实验室培养株系；Sun等［12］利用DGGE技术研究了东海和黄海浮游植物DNA指纹，研究结果显示浮游植物分子多样性与传统显微镜观察法研究结果具有较好的一致性；陈美军等用DGGE技术对太湖不同湖区的浮游生物多样性及组成结构进行了研究，结果表明不同湖区浮游生物的DGGE指纹图谱存在明显差异［13］．为了了解我国典型有毒有害赤潮藻类的DGGE指纹图谱以及DGGE技术在赤潮藻类分析鉴定中的作用，本课题组选取了我国沿海7种重要赤潮藻类，研究了单一种类DNA样品以及混合样品的DGGE指纹图谱，并且对2009年10月底在广东省珠海海域发生的双胞旋沟藻（Cochlodinium geminatum）赤潮样品进行了DGGE分析，以了解DGGE技术对赤潮藻类的鉴别作用特别是对形态相近的有害甲藻的鉴定，为DGGE技术运用于赤潮监测和浮游植物分子多样性研究提供参考．1材料与方法1．1实验藻种与培养本研究选用7种典型赤潮藻类，均来源于广州暨南大学水生生物研究所藻种室，分别为甲藻环节环沟藻（Gyrodinium instriatum）、海洋原甲藻（Proro-centrum micans）、血红哈卡藻（Akashiwo sanguinea）、锥状斯氏藻（Scrippsiella trochoidea）、塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）、双胞旋沟藻（Cochlodini-um geminatum）以及硅藻中肋骨条藻（Skeletonema costatum），其中、塔玛亚历山大藻、海洋原甲藻、锥状斯氏藻和中肋骨条藻分离于广东省大亚湾海域，血红哈卡藻、环节环沟藻和双胞旋沟藻分离于2009年广东珠海双胞旋沟藻赤潮水样．藻种分离后培养于f/2培养基中，培养温度为20ħ，光照强度100μE，光暗比为12ʒ12．1．2赤潮样品采集与分析在珠海赤潮高发期的4月29日下午4时左右，在珠海渔女塑像附近海域采集了赤潮带表层水样，在2h内迅速运回实验室进行处理．取水样50mL 至离心管中进行总DNA的提取，另取约20mL水样，用鲁哥氏液进行固定，在显微镜下对浮游植物进行定性定量分析．1．3总DNA的提取分两组实验进行PCR-DGGE分析，第一组为4种有害甲藻（环节环沟藻、海洋原甲藻、血红哈卡藻、锥状斯氏藻）单一藻种以及两两混合和多种混合进行分析，以了解DGGE技术对甲藻DNA片段的分离效果；第二组实验根据珠海赤潮水样中的浮游植物组成，对水样中的优势藻类单种和混合样品以及赤潮水样进行分析，揭示DGGE技术对自然样品的分离效果．在藻细胞培养至对数生长期，分别取单一藻类培养液以及2种、3种和多种赤潮藻类培养液等体积混合液各50mL至离心管中，在4ħ下10000g 离心5min收集藻细胞，加入200μL Milly-Q水重悬浮后，转入1.5mL离心管中，采用UNIQ柱式植物基因组提取试剂盒（上海生工）提取总DNA，在4ħ下存储备用．1．4PCR扩增本实验所用引物为真核生物18S rDNA V3区的特异性引物对F1427GC（5'-CGCCCGCCGCGC-CCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGAT -GCCCTTAGATGTTCTGGG-3'）和R1616（5'-GCG-GTGTGTA2CAAAGGGCAGGG-3'）［14］，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成．PCR反应在Applied Biosystems veriti TM PCR仪中进行，反应体系为25μL，包括2.5μL10ˑ反应缓冲液、0.6μL上、下游引物（10μmol/L）、0.6μL dNTPs（10mmol/L）、0.2μL Taq DNA聚合酶（5U/μL）、模板量1μL，以ddH2O补足体积．PCR反应条505第5期邵娟，等：常见赤潮藻类的变性梯度凝胶电泳分析件为94ħ1min；94ħ变性1min，65ħ退火1min（每个循环降低1ħ），72ħ延伸1min，10个循环；94ħ变性1min，55ħ退火1min，72ħ延伸1min，20个循环；72ħ延伸10min［15］．用质量分数1%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测．1．5DGGE取PCR扩增产物20μL，在Bio-Rad公司的Dcode TM通用突变检测系统对PCR产物进行DGGE 分析．DGGE条件为：丙烯酰胺质量分数8%，变性梯度30% 70%（100%的变性剂浓度为7mol/L尿素和质量分数40%去离子甲酰胺），先用200V电压电泳10min，然后再用100V电压电泳16h．缓冲液为1ˑTAE．电泳结束后用0.5μg/mL的溴化乙锭染色20min，用Bio-Rad公司凝胶成像系统（Gel Doc2000TM）进行拍照．2结果2．1赤潮水样的观察与分析样品中浮游植物组成见表1．旋沟藻是赤潮水样中最优势物种，细胞密度为315cells/mL，占浮游植物总密度的73.26%；血红哈卡藻是第二优势物种，细胞密度和百分比含量分别为600cells/mL和13.95%；中肋骨条藻和环节环沟藻细胞密度也分别达到100和70cells/mL．表12009年10月29日珠海赤潮样品中浮游植物组成中文名称学名细胞密度/mL双胞旋沟藻Cochlodinium geminatum3150血红哈卡藻Akashiwo sanguinea600中肋骨条藻Skeletonema costatum100环节环沟藻Gyrodinium instriatum70日本纤囊藻Fibrocapsa japonica60米氏凯伦藻Karenia mikomotoi40圆鳞异囊藻Heterocapsa circularisquama30异囊藻Heterocapsa niei30海洋原甲藻Prorocentrum micans20多纹膝沟藻Gonyaulax polygramma20塔玛亚历山大藻Alexandrium tamarense20单眼藻Warnowia polyphenmus20哈曼褐多沟藻Pheopolykrikos harmannii20圆筛藻Coscinodiscus sp．10无纹多沟藻Polykrikos schwartzii10环沟藻Gyrodinium pepo10裸甲藻Gymnodinium aureum102．2PCR扩增产物分析图1为4种有害甲藻（环节环沟藻、海洋原甲藻、血红哈卡藻、锥状斯氏藻）单一藻种以及两两混合和多种混合后PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，可以看出该引物扩增产物大小均一，约为250 bp，可见引物具有较好的专一性，且目的片段的大小适于DGGE分析（200 700bp）．图2显示了6种赤潮藻类单种、混合样品以及2009年10月29日珠海赤潮水样PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，同样所有样品的扩增产物大小一致，均为250bp左右．M：marker DL2000；1：环节环沟藻；2：海洋原甲藻；3：血红哈卡藻；4：锥状斯氏藻；5：环节环沟藻+血红哈卡藻；6：海洋原甲藻+锥状斯氏藻；7：环节环沟藻+血红哈卡藻+锥状斯氏藻；8：环节环沟藻+海洋原甲藻+血红哈卡藻；9：环节环沟藻+海洋原甲藻+血红哈卡藻+锥状斯氏藻．图14种赤潮甲藻PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图M：marker DL2000；1：环节环沟藻；2：海洋原甲藻；3：血红哈卡藻；4：中肋骨条藻；5：塔玛亚历山大藻；6：双胞旋沟藻；7：环节环沟藻+海洋原甲藻+血红哈卡藻+中肋骨条藻+塔玛亚历山大藻+双胞旋沟藻；8：珠海赤潮海水样品．图26种赤潮藻类及珠海赤潮水样PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图2．3DGGE分析将图1和图2中所示的PCR扩增产物进行DGGE分析，结果分别见图3和图4．从图3中可以看出，单一种类的PCR产物在DGGE分析中清楚的出现一条条带（1 4泳道），而两两混合藻细胞PCR 产物则出现与其单种产物相对应的两条条带（5 6泳道），在3种混合（7 8泳道）以及4种混合（9泳道）的PCR产物分别出现了3条和4条条带．研究结果表明DGGE技术能够准确的区分出环节环沟藻、海洋原甲藻、血红哈卡藻、锥状斯氏藻这4种甲605暨南大学学报（自然科学版）第32卷藻，并且每条泳道里的条带数正好与样品中的种类数相同，说明DGGE 技术能够较好的区分不同种的甲藻．从图4中的1 6泳道分别为6种赤潮藻类单种PCR 产物的DGGE 图谱，而第7泳道为6种藻混合的图谱．可以看出，第7泳道出现了比较清晰6条带，并且正好与1 6泳道中的单种泳带位置相对应，表明DGGE 技术能够准确的区分出环节环沟藻、海洋原甲藻、血红哈卡藻、中肋骨条藻、塔玛亚历山大藻、双胞旋沟藻这几种常见的海洋赤潮藻类．第8泳道赤潮样品中较清晰的4条带正好与1、2、3、6号泳道中的条带位置相对应，说明珠海赤潮样品的优势种类包括双胞旋沟藻、血红哈卡藻、环节环沟藻、海洋原甲藻，而另一优势种类中肋骨条藻则由于细胞微小，只在图谱中出现了微弱条带，这与显微镜观察结果基本一致（表1）．样品中的其他微弱条带则是本研究中没有设置单一物种对照的一些非优势种条带．1：环节环沟藻；2：海洋原甲藻；3：血红哈卡藻；4：锥状斯氏藻；5：环节环沟藻+血红哈卡藻；6：海洋原甲藻+锥状斯氏藻；7：环节环沟藻+血红哈卡藻+锥状斯氏藻；8：环节环沟藻+海洋原甲藻+血红哈卡藻；9：环节环沟藻+海洋原甲藻+血红哈卡藻+锥状斯氏藻．图34种赤潮甲藻PCR 扩增产物的DGGE图谱1：环节环沟藻；2：海洋原甲藻；3：血红哈卡藻；4：中肋骨条藻；5：亚历山大藻；6：双胞旋沟藻；7：环节环沟藻+海洋原甲藻+血红哈卡藻+中肋骨条藻+亚历山大藻+双胞旋沟藻；8：珠海双胞旋沟藻赤潮海水样品．图46种赤潮藻类以及珠海赤潮水样PRC 扩增产物的DGGE 图谱3讨论赤潮藻类的鉴定在赤潮监测中具有很重要的作用，特别是对某些造成严重危害的有毒有害赤潮藻类的鉴定尤为重要．在目前的监测技术中，光学显微镜分析是最为简单、快速的方法之一，但是有些赤潮藻类形态学差异不明显，很难在光学显微镜下区分．虽然扫描电子显微镜能区分赤潮微藻的细微结构，但很耗时而且需要昂贵的扫描电镜．而一些裸甲藻类由于缺乏细胞壁，固定后很容易变形，更难在显微镜下进行分类鉴定．随着分子生物学技术的发展，许多分子生物学技术已经运用到赤潮藻类种类鉴定之中，如双向电泳［16］、实时定量PCR ［17］以及PCR 与凝胶电泳结合技术等［18－20］．这些技术可以对某一特定种类进行定性鉴定，有的还可以定量分析，但它们有一个共同弱点，就是不能对环境中共存的其他藻类进行鉴定［11］．在本研究中，PCR-DGGE 技术实现了对血红哈卡藻、环节环沟藻、海洋原甲藻、锥状斯氏藻4种甲藻以及环节环沟藻、双胞旋沟藻、亚历山大藻、中肋骨条藻、血红哈卡藻、海洋原甲藻6种常见海洋赤潮藻的明显区分，并且正确分析了珠海赤潮样品中的优势种类组成．说明PCR-DGGE 技术能在环境样品中区分多种赤潮藻类，实现对赤潮原因种和优势种的正确分类．在微生物群落结构监测中，通过比较DGGE 图谱中条带的数量和亮度，可反映环境样品中微生物物种的数量和优势种群［21］．目前，PCR-DGGE 技术也已经运用于海洋浮游植物群落结构和多样性研究，该技术对形态结构相近的Pfiesteria 属的种类具有很好的区分效果，同时也能较好地鉴别赤潮样品中的主要原因种［11］．本研究中，在珠海赤潮样品的DGGE 图谱中较为清晰地出现了双胞旋沟藻、环节环沟藻、血红哈卡藻和海洋原甲藻条带（图4），而且条带亮度与细胞密度一致．样品中的骨条藻细胞密度也达到100cells /mL ，但由于骨条藻细胞微小，只在图谱中出现了微弱条带（图4第8泳道）；而骨条藻的单一条带（图4第4泳道）却很清晰，这是因为单种条带的DNA 是从实验室培养的对数生长期藻液提取，细胞密度远远高于环境样品（＞106cells /mL ），提取的DNA 量也较大，故条带较亮．但是PCR-DGGE 技术也具有其局限性，该技术不能定性定量监测样品中每一种生物物种，只有在已知种类对照条带的基础上进行比较和分析鉴定，当然也可以将DGGE 胶上的DNA 条带回收，进行二次PCR 扩增，然后测定DNA 序列，从而对赤潮生物进行准确分类，但这比较耗时，费用也较高．因此，在赤潮藻类分析鉴定中，PCR-DGGE 技术只能作为显微镜观察分析方法的补充，在大致确认了优势种之705第5期邵娟，等：常见赤潮藻类的变性梯度凝胶电泳分析后，进而对优势物种进行准确鉴定．［参考文献］［1］FISCHER S G，LERMAN L S．Length-independent sepa-ration of DNA restriction fragments in two-dimensional gelelectrophoresis［J］．Cell，1979，（16）：191－200．［2］MUYZER G，DE WAAL E C，Uitterlinden A G．Profi-ling of complex microbial populations by denaturing gradi-ent gel electrophoresis analysis of polymerase chain reac-tion-amplified genes coding for16S rRNA［J］．Appliedand Environmental Microbiology，1993，59（3）：695－700．［3］SHAO K Q，GAO G，QIN B Q，et al．Comparing sedi-ment bacterial communities in the macrophyte-dominatedand algae-dominated areas of eutrophic Lake Taihu，Chi-na［J］．Canadian Journal of Microbiology，2011，57（4）：263－272．［4］HOSSAIN M Z，SUGIYAMA S．Influences of plant litter diversity on decomposition，nutrient mineralization andsoil microbial community structure［J］．Grassland Sci-ence，2011，57（2）：72－80．［5］BELLUCCI M，CURTIS T P．Ammonia-oxidizing bacterta in wastewater［J］．Methods in Enzymology，2011，496：269－286．［6］王洋清，杨红军，李勇．DGGE技术在森林土壤微生物多样性研究中的应用［J］．生物技术通报，2011，（5）：75－79．［7］甄毓，于志刚，米铁柱．分子生物学在微藻分类研究中的应用［J］．中国海洋大学学报，2006，36（6）：875－878．［8］王鹏，梁君荣，高亚辉，等．基于核糖体DNA大亚基片断序列探讨中国东海海域原甲藻的分子分类［J］．厦门大学学报：自然科学版，2005，44（3）：437－440．［9］AN C，TAKAHASHI H，KIMURA B，et al．Comparison of PCR-DGGE and PCR-SSCP analysis for bacterial floraof Japanese traditional fermented fish products，aji-nare-zushi and iwashi-nukazuke［J］．Journal of the Science ofFood and Agriculture，2010，90（11）：1796－1801．［10］BAGWELL C E，FORMOLO M，YE Q，et al．Direct a-nalysis of sulfate reducing bacterial communities in gashydrate-impacted marine sediments by PCR-DGGE［J］．Journal of Basic Microbiology，2009，49：87－92．［11］WANG Q，DEEDS J R，PLACE A R，et al．Dinoflagel-late community analysis of a fish kill using denaturing gra-dient gel electrophoresis［J］．Harmful Algae，2005，4（1）：151－162．［12］SUN J，YU Z G，GAO Y H，et al．Phytoplankton diver-sity in the East China Sea and Yellow Sea measured byPCR-DGGE and its relationships with environmental fac-tors［J］．Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2010，28（2）：315－322．［13］陈美军，孔繁翔，陈非洲，等．太湖不同湖区真核微型浮游生物基因多样性的研究［J］．环境科学，2008，29（3）：769－775．［14］VAN HANNEN E J，VAN AGTERVELD M P，GONS H J，et al．Revealing genetic diversity of eukaryotic micro-organisms in aquatic environments by denaturing gradientgel electrophoresis［J］．Journal of Phycology，1998，34：206－213．［15］BERGLUND J，JRGENS K，BRUCHMLLER I，et al．Use of group-specific PCR primers for identification ofchrysophytes by denaturing gradient gel electrophoresis［J］．Aquatic Microbial Ecology，2005，39（2）：171－182．［16］OLDACH D W，DELWICHE C F，JAKOBSEN K S，et al．Heteroduplex mobility assay-guided sequence discov-ery：elucidation of the small subunit（18S）rDNA se-quences of Pfiesteria piscicida and related dinoflagellatesfrom complex algal culture and environmental sampleDNA pools［J］．Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America，2000，97（8）：4303－4308．［17］BOWERS H A，TENGS T，GLASGOW J R，et al．De-velopment of real-time PCR assays for rapid detection ofPfiesteria piscicida and related dinoflagellates［J］．Ap-plied and Environmental Microbiology，2000，66（11）：4641－4648．［18］RUBLEE P A，KEMPTON J，SCHAEFER E，et al．PCR and FISH detection extends the range of Pfiesteria piscici-da in estuarine waters［J］．Virginia Journal of Science，1999，50：325－335．［19］SAITO K，DRGON T，ROBLEDO J，et al．Characteriza-tion of the rRNA locus of Pfiesteria piscicida and develop-ment of standard and quantitative PCR-based detection as-says targeted to the nontranscribed spacer［J］．Appliedand Environmental Microbiology，2002，68（11）：5394－5407．［20］ZHANG H，AND LIN S．Detection and quantification of Pfiesteria piscicida by using the mitochondrial cytochromeb gene［J］．Applied and Environmental Microbiology，2002，68（2）：989－994．［21］FROMIN N，HAMELIN J，TARNAWASKI S，et al．Sta-tistical analysis of denaturing gel electrophoresis（DGE）fingerprinting patterns［J］．Environmental Microbiology，2002，4（11）：634－643．［责任编辑：黄建军］805暨南大学学报（自然科学版）第32卷。