化学发光免疫分析技术
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局限性：方法选择性较差、发光体系相对较少、仪器 商品化不够
直接化学发光的机理（夹心法）
磁微粒
抗体
+
被测抗原
+ 带吖啶酯标 记物抗体
（2） 加入碱 （pH>10）
（1） 加入H2O2 （pH<10）
发光
冲洗后
3.2 化学发光酶免疫分析
化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶 如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或 抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成 固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底 物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收， 光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送 至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。
⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。
2.2 化学发光剂种类 直接化学发光剂，间接化学发光剂
直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催 化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有 产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。
在碱性条件下被H2O2氧化时,发出 波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激 发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。
亲和素—糖蛋白；生物素-维生素H
ECLIA检测流程图一 （双抗体夹心的形成）
ECLIA检测流程图二 （生物素与亲和素结合）
ECLIA体系结构图
ECLIA检测流程图三 （磁珠吸引吸附于电极表面）
ECLIA检测流程图四 （电极充电启动电化学反应）
ECLIA检测流程图五 （撤消磁场冲洗磁珠）
电化学发光免疫测定示意图
A + B C* + D C* + F F* + C F* F + h2
1.3 化学发光的效率
化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学 激发效率（φCE）和激发态分子的发射效率
（φEM）。化学发光反应的发光效率、光辐射的
能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质 所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学 发光光谱和不同的化学发光效率。
ECLIA的优越性
• • • • 高度敏感，可达pg／ml或pmol水平； 特异性强，重复性好，CV＜5％。 测定范围宽，可达7个数量级。 试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长 ，达数月甚至数年。 • 操作简单，耗时短，易于自动化。 • 在对环保很重视的国家，CLIA成了取代 RIA的首选方法。
临床应用
用化学发光剂（吖啶酯或鲁米诺类）直接标记抗体 (抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应 后，形成固相包被抗体-待测抗原-化学发光剂标记抗体 复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成 碱性环境，化学发光剂在不需要催化剂的情况下分解、 发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生 的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比， 可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。
电化学发光剂
• 定义：指通过在电极表面进行电化学反应 而发出光的物质。
O O N N Ru N O O N N N
• 特点
N
– 反应在电极进行 – 化学发光剂：三联毗啶钌 – 电子供体为：三丙胺（TPA）
三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]2+ 特点
• ECL分析中采用[Ru(bpy)3]2+作为标记物， 其活化衍生物是[Ru(bpy)3]2+＋N羟基琥珀 酸胺酯（NHS） ，该衍生物具有水溶性 ，且高度稳定，保证电化学发光反应的高 效和稳定，而且避免了本底噪声的干扰。
三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]2+ 特点
• [Ru(bpy)3]2+衍生物与免疫球蛋白结合的分 子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免 疫活性； • [Ru(bpy)3]2+分子量小，空间位阻小 ，即 便小分子的核酸也能标记，使检测的样品 种类大大丰富，更重要的是为其检测样品 种类的开发前景提供了广阔空间。
3.2.1 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析
该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体
(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体
发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶 （HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、 H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。
3.2.1 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析
A. 吖啶酯
代表性物质：光泽精 (lucigenin)
CH3 N
+
CH3
Oxidation OH N+ CH3 .2NO3
-
N
NMA
*
O
+
LIGHT
N-METHYLACRIDONE (NMA)
Lucigenin
max = 445 nm
氧化剂：H2O2 还原剂：乳酸 尿酸 抗坏血酸
催化剂：过渡金属离子、酶
化学发光免疫分析
Contents
1 2 3
化学发光免疫的基本概念
化学发光剂和标记技术 化学发光免疫分析的类型 电化学发光免疫
4
1
化学发光免疫的基本概念
1.1 化学发光的基本原理
发光 ：是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较
低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态， 并释放光子的过程。 根据形成激发态分子的能量来源不同可分为: 光照发光、生物发光、化学发光等。
抑制剂：酚类物质对此反应有抑制作用 间接测定：能够生成H2O2的基质及相应的酶
量子产率高，易于标记， 是发展化学发光免疫分析 和DNA发光探针的重要标 记物
B.三联吡啶钌 三联吡啶钌 [RU(bpy)3]2+是电化学
发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面 可同时失去一个电子而发生氧化反应。
一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质 激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个 反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。
反应过程可简单地描述如下：
A + B C* + D C* C + h1
1.2 化学发光的种类
wenku.baidu.com
间接化学反应发光
若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子F 上，使F分子激发到电子激发态，F分子从激发态 回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。 反应过程可表示如下：
辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图
3.2.2 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析
该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体(或抗原)，在与
反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，
形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，
这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱
去磷酸根基团而发光。
3.2.2 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析
2
化学发光剂和标记技术
2.1 化学发光剂概念
在化学发光反应中参与能量转移并最终 以发射光子的形式释放能量的化合物， 称为化学发光剂或发光底物。
化学发光剂选择条件：
①发光的量子产率高；
②物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；
③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；
④其化学发光常是氧化反应的结果；
immunoassay， ECLIA
• 在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应， 用电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+标记Ab，通 过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在 电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定 性。 电化学发光、免疫分析检测、生物素-抗生素、固相磁 珠技术
生物发光的本质是化学发光
1.1 化学发光的基本原理
化学发光原理：伴随化学反应的光发射现象
某些物质在进行化学反应过程中，由于吸收了反应产生 的化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长 的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光 (Chemiluminescence，CL) 。
化学发光分析
2.3 发光剂的标记
A. 碳二亚胺（EDC）缩合法
B. 过碘酸钠氧化法
C．重氮盐偶联法
D. N-羟基琥珀酰亚胺活化法
2.4 影响发光剂的标记的因素
1．发光剂的选择
2．被标记蛋白质的性质 3．标记方法的选择 4．原料比 5．标记率 6．温度
3
化学发光免疫分析的类型
3.1 直接化学发光免疫分析
化学发光分析缺点
• 虽然化学发光具备很高的特异性和很小的 干扰，但化学分析本身的不特异性，制约 了整个方法的使用。
化学发光免疫分析
Chemiluminescence immunoassay (CLIA)
化学发光
敏感性高
免疫学
特异性强
简便、快速 重复性好
1.2 化学发光的种类
直接化学发光
三联吡啶钌
间接化学发光剂 酶促反应发光剂：
利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这
一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。
A．鲁米诺及其衍生物 B．AMPPD
A.鲁米诺及其衍生物
鲁米诺发光原理
B．AMPPD
〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕
1电化学反应 2化学发光 3循环
+
常用方法类型
• 固相磁性微球吸附
采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8 μm的聚苯乙烯微 粒。其特点是反应面积比板式扩大20－30倍，吸附效率 高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相， 反应速度大大加快；
• 链霉亲和素-生物素吸附
“链霉亲和素-生物素”是是具有很强的非共价相互作用的 一对化合物，具有牢固而特异的结合，应用此放大系统 ，使检测的灵敏度大大提高
• 根据化学发光反应在某一时刻的发光强度 或反应的发光总量来确定反应中相应组分 含量的分析方法，称为化学发光分析。
化学发光分析优点
• 化学发光具有荧光的特异性，同时不需要 激发光，就避免了荧光分析中激发光杂散 光的影响有很高的灵敏度， • 并且不象放射分析那样存在强烈的环境污 染和健康危害，是一种非常优秀的定量分 析方法。
碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图
分析步骤
分配样品, 磁颗粒 和试剂 孵育，使反 应物结合 在磁场中清 洗去除未结 合物质
孵育,促使 信号的产生
加入底物 产生信号
信号 检测
4
电化学发光免疫
Flow cell Oxidized
Reduced
Fe
Electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA
20世纪80年代出现，90年代用于临床检测。
发光特点：联吡啶钌
电化学
（标记物+三丙胺自由基 （催化）+三角形脉冲电 压（激发），0.01ms就
可发出稳定的光。
ECLIA
免疫学
化学发光
优点：1. 灵敏度高
（联吡啶钌再循环）， 2.检测步骤简化（游 离/结合）3.可实现多 元检测 4.可实现自动 化
电化学发光免疫分析 Electrochemiluminescence
• 激素
• 肿瘤标记物 • 内分泌功能 • 传染性疾病 • 其它
– 如VB12、叶酸、铁蛋白、肌钙蛋白、肌红蛋白、酶 、脂肪酸、维生素和药物等多种检测项目。
小结：化学分析的特点
不需要外部光源：
消除了入射光的干扰(瑞利散射和拉曼散射)。 克服了光源不稳定而导致的波动的缺点，降低了
噪声，提高了信噪比。 灵敏度高(通常可达ng级或pg级)。 线性范围宽(通常可达三个数量级)。 设备简单、分析快速、易实现自动化。
直接化学发光的机理（夹心法）
磁微粒
抗体
+
被测抗原
+ 带吖啶酯标 记物抗体
（2） 加入碱 （pH>10）
（1） 加入H2O2 （pH<10）
发光
冲洗后
3.2 化学发光酶免疫分析
化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶 如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或 抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成 固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底 物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收， 光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送 至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。
⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。
2.2 化学发光剂种类 直接化学发光剂，间接化学发光剂
直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催 化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有 产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。
在碱性条件下被H2O2氧化时,发出 波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激 发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。
亲和素—糖蛋白；生物素-维生素H
ECLIA检测流程图一 （双抗体夹心的形成）
ECLIA检测流程图二 （生物素与亲和素结合）
ECLIA体系结构图
ECLIA检测流程图三 （磁珠吸引吸附于电极表面）
ECLIA检测流程图四 （电极充电启动电化学反应）
ECLIA检测流程图五 （撤消磁场冲洗磁珠）
电化学发光免疫测定示意图
A + B C* + D C* + F F* + C F* F + h2
1.3 化学发光的效率
化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学 激发效率（φCE）和激发态分子的发射效率
（φEM）。化学发光反应的发光效率、光辐射的
能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质 所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学 发光光谱和不同的化学发光效率。
ECLIA的优越性
• • • • 高度敏感，可达pg／ml或pmol水平； 特异性强，重复性好，CV＜5％。 测定范围宽，可达7个数量级。 试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长 ，达数月甚至数年。 • 操作简单，耗时短，易于自动化。 • 在对环保很重视的国家，CLIA成了取代 RIA的首选方法。
临床应用
用化学发光剂（吖啶酯或鲁米诺类）直接标记抗体 (抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应 后，形成固相包被抗体-待测抗原-化学发光剂标记抗体 复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成 碱性环境，化学发光剂在不需要催化剂的情况下分解、 发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生 的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比， 可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。
电化学发光剂
• 定义：指通过在电极表面进行电化学反应 而发出光的物质。
O O N N Ru N O O N N N
• 特点
N
– 反应在电极进行 – 化学发光剂：三联毗啶钌 – 电子供体为：三丙胺（TPA）
三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]2+ 特点
• ECL分析中采用[Ru(bpy)3]2+作为标记物， 其活化衍生物是[Ru(bpy)3]2+＋N羟基琥珀 酸胺酯（NHS） ，该衍生物具有水溶性 ，且高度稳定，保证电化学发光反应的高 效和稳定，而且避免了本底噪声的干扰。
三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]2+ 特点
• [Ru(bpy)3]2+衍生物与免疫球蛋白结合的分 子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免 疫活性； • [Ru(bpy)3]2+分子量小，空间位阻小 ，即 便小分子的核酸也能标记，使检测的样品 种类大大丰富，更重要的是为其检测样品 种类的开发前景提供了广阔空间。
3.2.1 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析
该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体
(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体
发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶 （HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、 H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。
3.2.1 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析
A. 吖啶酯
代表性物质：光泽精 (lucigenin)
CH3 N
+
CH3
Oxidation OH N+ CH3 .2NO3
-
N
NMA
*
O
+
LIGHT
N-METHYLACRIDONE (NMA)
Lucigenin
max = 445 nm
氧化剂：H2O2 还原剂：乳酸 尿酸 抗坏血酸
催化剂：过渡金属离子、酶
化学发光免疫分析
Contents
1 2 3
化学发光免疫的基本概念
化学发光剂和标记技术 化学发光免疫分析的类型 电化学发光免疫
4
1
化学发光免疫的基本概念
1.1 化学发光的基本原理
发光 ：是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较
低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态， 并释放光子的过程。 根据形成激发态分子的能量来源不同可分为: 光照发光、生物发光、化学发光等。
抑制剂：酚类物质对此反应有抑制作用 间接测定：能够生成H2O2的基质及相应的酶
量子产率高，易于标记， 是发展化学发光免疫分析 和DNA发光探针的重要标 记物
B.三联吡啶钌 三联吡啶钌 [RU(bpy)3]2+是电化学
发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面 可同时失去一个电子而发生氧化反应。
一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质 激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个 反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。
反应过程可简单地描述如下：
A + B C* + D C* C + h1
1.2 化学发光的种类
wenku.baidu.com
间接化学反应发光
若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子F 上，使F分子激发到电子激发态，F分子从激发态 回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。 反应过程可表示如下：
辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图
3.2.2 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析
该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体(或抗原)，在与
反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，
形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，
这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱
去磷酸根基团而发光。
3.2.2 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析
2
化学发光剂和标记技术
2.1 化学发光剂概念
在化学发光反应中参与能量转移并最终 以发射光子的形式释放能量的化合物， 称为化学发光剂或发光底物。
化学发光剂选择条件：
①发光的量子产率高；
②物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；
③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；
④其化学发光常是氧化反应的结果；
immunoassay， ECLIA
• 在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应， 用电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+标记Ab，通 过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在 电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定 性。 电化学发光、免疫分析检测、生物素-抗生素、固相磁 珠技术
生物发光的本质是化学发光
1.1 化学发光的基本原理
化学发光原理：伴随化学反应的光发射现象
某些物质在进行化学反应过程中，由于吸收了反应产生 的化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长 的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光 (Chemiluminescence，CL) 。
化学发光分析
2.3 发光剂的标记
A. 碳二亚胺（EDC）缩合法
B. 过碘酸钠氧化法
C．重氮盐偶联法
D. N-羟基琥珀酰亚胺活化法
2.4 影响发光剂的标记的因素
1．发光剂的选择
2．被标记蛋白质的性质 3．标记方法的选择 4．原料比 5．标记率 6．温度
3
化学发光免疫分析的类型
3.1 直接化学发光免疫分析
化学发光分析缺点
• 虽然化学发光具备很高的特异性和很小的 干扰，但化学分析本身的不特异性，制约 了整个方法的使用。
化学发光免疫分析
Chemiluminescence immunoassay (CLIA)
化学发光
敏感性高
免疫学
特异性强
简便、快速 重复性好
1.2 化学发光的种类
直接化学发光
三联吡啶钌
间接化学发光剂 酶促反应发光剂：
利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这
一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。
A．鲁米诺及其衍生物 B．AMPPD
A.鲁米诺及其衍生物
鲁米诺发光原理
B．AMPPD
〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕
1电化学反应 2化学发光 3循环
+
常用方法类型
• 固相磁性微球吸附
采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8 μm的聚苯乙烯微 粒。其特点是反应面积比板式扩大20－30倍，吸附效率 高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相， 反应速度大大加快；
• 链霉亲和素-生物素吸附
“链霉亲和素-生物素”是是具有很强的非共价相互作用的 一对化合物，具有牢固而特异的结合，应用此放大系统 ，使检测的灵敏度大大提高
• 根据化学发光反应在某一时刻的发光强度 或反应的发光总量来确定反应中相应组分 含量的分析方法，称为化学发光分析。
化学发光分析优点
• 化学发光具有荧光的特异性，同时不需要 激发光，就避免了荧光分析中激发光杂散 光的影响有很高的灵敏度， • 并且不象放射分析那样存在强烈的环境污 染和健康危害，是一种非常优秀的定量分 析方法。
碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图
分析步骤
分配样品, 磁颗粒 和试剂 孵育，使反 应物结合 在磁场中清 洗去除未结 合物质
孵育,促使 信号的产生
加入底物 产生信号
信号 检测
4
电化学发光免疫
Flow cell Oxidized
Reduced
Fe
Electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA
20世纪80年代出现，90年代用于临床检测。
发光特点：联吡啶钌
电化学
（标记物+三丙胺自由基 （催化）+三角形脉冲电 压（激发），0.01ms就
可发出稳定的光。
ECLIA
免疫学
化学发光
优点：1. 灵敏度高
（联吡啶钌再循环）， 2.检测步骤简化（游 离/结合）3.可实现多 元检测 4.可实现自动 化
电化学发光免疫分析 Electrochemiluminescence
• 激素
• 肿瘤标记物 • 内分泌功能 • 传染性疾病 • 其它
– 如VB12、叶酸、铁蛋白、肌钙蛋白、肌红蛋白、酶 、脂肪酸、维生素和药物等多种检测项目。
小结：化学分析的特点
不需要外部光源：
消除了入射光的干扰(瑞利散射和拉曼散射)。 克服了光源不稳定而导致的波动的缺点，降低了
噪声，提高了信噪比。 灵敏度高(通常可达ng级或pg级)。 线性范围宽(通常可达三个数量级)。 设备简单、分析快速、易实现自动化。