重组质粒的酶切鉴定及PCR实验1

重组质粒的酶切鉴定及PCR实验

崔文强201300140012生态

同组者：陈斌郝书平

摘要 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是1986年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。本次实验旨在通过学习和掌握酶切和PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。

关键词酶切；重组质粒；插入片段；PCR

1.引言

将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA 的大小，这就是重组质粒酶切鉴定。

接着进行PCR检验，PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。反应过程由高温变性，低温退火和延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。

2.实验材料和方法

2.1实验材料

PRC扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，移液器，0.2ml薄壁PCR管，凝胶成像仪，模板pUC19重组质粒，寡核苷酸引物（上游引物M13F，下游引物M13R），TaqDNA聚合酶（TaKaRa，-20℃贮存），dNTPs（TaKaRa，-20℃贮存），10×PCR反应缓冲液（TaKaRa，-20℃贮存）

高速离心机，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，微量移液器，手套，记号笔，TAE电泳缓冲液(10×)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)，DNA相对分子质量标准物DNA Marker k／Hin dⅢ，DL5000。

2.2实验方法

2.2.1重组质粒的酶切、电泳检测

对于电泳显示插入片段在2.0kb以上的重组质粒，采用HindⅢ酶切进行验证。

大片段或高产量的重组质粒推荐的反应体系（10μl体系）如下：

表1质粒酶切反应体系

成分体积（μl）*4

dd H2O 6.2 26

10×Buffer（含Mg2+） 1.0 4

Re-Puc19 2.0

HindⅢ（15U/μl）0.8 3.2

共计10.0 8μL/tube

轻弹混匀后，短暂离心，于37℃孵育1.5hr后，保存于 -20℃，备电泳检测。

取酶切产物10 ul，加入2 ul 10×loading buffer，混匀后点样。

取重组质粒2 ul，加入4μL dd H2O，1 ul 10×loading buffer，混匀后点样。

以λ DNA/HindIII为Marker，点样顺序如表2。100V恒压电泳约40min。电泳结束EB 染色10min，水洗后紫外灯下观察实验结果。

表2重组质粒酶切上样顺序

泳道 1 2 3 4 …15 16 17 18

样品Λ/Hin d

ⅢpUC19/H

in dⅢ

Rp1-1 rp1-1

Hin dⅢ

Rp7-1 Rp7-1

Hi ndⅢ

pUC19/H

in d

Λ/Hin d

Ⅲ

样量μL 10 5 10 10 10 10 5 10

作用M对照对照对照M对照

2.2.2重组质粒的PCR验证

对于电泳显示插入片段在2.0kb以下的重组质粒，采用PCR进行验证。引物此次重组用到的载体是pUC19，限制性内切酶为Hind Ⅲ，所以选择Hind Ⅲ酶切位点两侧一定距离的序列制作引物。由于载体pUC19上两引物间序列的长度是150bp，所以PCR扩增产物的长度（bp）=150+插入片段的长度。实验中首先建立反应体系：

表3 PCR 引物

引物名称 引物序列5’ 3’ 引物长度(mers) Tm(℃) M13F(-47) CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC GAC 24 64.7 M13R(-48)

GAGCGGATAACAATTTCACACAGG

24

57.9

表4 PCR 反应体系

建立体系后将加好样的PCR 管进行标记，放入PCR 仪中，设定反应基本参数如表5所示

表5 PCR 反应程序

项目 温度/℃ 时间 预变性 94 3min 变性 94 30s 复性 58 30s 延伸 72 75s 终延伸 72 10min 保存

4

2hr

（1） 预变性：让DNA 双链充分解离,然后第一次退火过程时候引物可以尽量多的结

合到模版上面这主要是为了保险起见，使模板DNA 的二级结构充分打开。

（2） 变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA 。 （3） 复性：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系

中引物DNA 量大大多于模板DNA ，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间互补的机会较少。

（4） 延伸：在DNA 聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及镁离子存在的条件下 ，

5＇-→3＇的聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。

（5） 终延伸：循环完成后 使PCR 反应完全以提高扩增产量，在用普通Taq 酶进行

PCR 扩增时在产物末端加A 尾的作用，可以直接用于TA 克隆的进行。

PCR 结束之后对产物进行电泳检测，用1%的琼脂糖凝胶电泳：20ulPCR 产物中加3.0ul 10×loading buffer ，混合均匀，取5ul 点样，上样顺序如表6。以DL2000和DL5000为Marker 。100V 恒压电泳约40min 。电泳结束EB 染色10min ，水洗后紫外灯下观察实验结果。

编号 组分 加量（ul ） 1 dd H2O

13.2 2 10×Buffer （含Mg2+） 2.0 3 dNTP （2.5 mM each ） 1.6 4 M13F （10μM ） 1 5 M13R （10μM ） 1 6 模板（1-10ng/μl ） 1.0 7 Taq 酶（5u/μl ） 0.2 总体积

20.0

25cycles