基因组编辑技术研究进展及其在植物中的应用

安徽农学通报，ＡｎｈｕｉＡｇｎ．Ｓｅｉ．Ｂｕｌｌ．２０１５，２１（１８）

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基因组编辑技术研究进展及其在植物中的应用徐华山李培德戴风美刘凯杨国才李三和闸文俊周雷陈志军方国成游艾青（粮食作物种质创新与遗传改良湖北省重点实验室／湖北省农业科学院粮食作物研究所，湖北武汉４３００６４）

摘要：基因组编辑技术是进行农作物基因功能研究和遗传改良的重要辅且ｈ．ｘ－具，目前已经成熟应用的基因组编辑技术包括ＺＦＮｓ、ＴＡＬＥＮｓ以及近几年兴起的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统。该文介绍了ＺＦＮｓ、ＴＡＬＥＮｓ及ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统的研究进展、各自的优缺点以及在植物中的应用，并对基因组编辑技术的应用前景进行了展望。关键词：基因组编辑；ｚＦＮｓ；ＴＡＬＥＮｓ；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ；６ｔ物中图分类号Ｑ７８文献标识码Ａ文章编号１００７－７７３１（２０１５）１８－１５－０５

随着现代分子生物学的飞速发展，越来越多的物种基因组测序完成，研究基因功能成为了科学家下一步的工作重心。基因组编辑技术被（Ｓｃｉｅｎｃｅ））评为２０１２年十大重要科学进展之一，利用基因组编辑技术对植物基因进行改造是进行农作物遗传改良的重要辅助手段。目前应用最多的基因组编辑技术主要包括锌指核酸酶ｚｉｎｃ—ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＺＦＮｓ）“‘２］，类转录激活因子效应物核酸酶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅｎｕｃ］ｅａｓｅｓ，ＴＡＬＥＮｓ）口训以及ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统¨１。ＺＦＮｓ是第一种由人工改造应用的核酸内切酶。由含有锌指结构域的转录因子和非特异性的核酸内切酶ＦｏｋＩ的切割结构域融合而成。尽管ＺＦＮｓ成功应用于多种生物的基因组编辑，但是设计困难、组装昂贵、耗时长、失败概率高等缺点限制了该技术的发展与应用。ＴＡＬＥＮｓ是利用类转录激活因子效应物ＤＮＡ结合结构域和非特异性的核酸内切酶ＦｏｋＩ的切割结构域融合而成的核酸内切酶。ＴＡＬＥＮｓ实现了单个蛋白质与单个核苷酸的对应，与ＺＦＮｓ相比更易组装设计，打靶效率也更高旧“。２０１３年初，基于细菌获得性免疫系统改造的由ＲＮＡ介导的全新人工核酸酶ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统出现了，与ＺＦＮｓ和ＴＡＬＥＮｓ相比，该系统只需设计和目标核苷酸对应的ＲＮＡ序列即可，操作手段更简单，效率更高，成本更低，适合普通分子生物学实验室操作，为基因组编辑提供了新的平台。本文就３种基因组编辑技术的作用原理、结构特征及使用特点等方面进行介绍，并对基因组编辑技术在植物基因编辑中的应用进行了展望。１ＺＦＮｓ、ＴＡＬＥＮｓ和Ｃ砌［ＳＰ剐Ｃａｓ系统的原理及特点Ｉ．ＩＺＦＮｓ技术锌指核酸酶（ＺＦＮｓ）是应用较早的一类基因组编辑技术。该酶的Ｎ端是锌指蛋白ＤＮＡ结合域，可以识别并结合含特定碱基序列的ＤＮＡ，Ｃ端是非特异性核酸酶ＦｏｋＩ的切割结构域。锌指蛋白根据保守结构

域的不同可以分为Ｃ：Ｈ：型、Ｃ。型和Ｃ。型，研究应用比较多的是ｃ：Ｈ：型。这种锌指蛋白由３０个氨基酸构成并围绕锌离子折叠成１３１３，１结构，Ｏｔ螺旋插入ＤＮＡ双螺旋中可以特异识别ＤＮＡ序列上的３个连续碱基并与之结合阻”１。人工合成的锌指核酸酶由可以特异性识别ＤＮＡ序列的锌指蛋白和非特异性的核酸内切酶ＦｏｋＩ组成。锌指蛋白结构域通常含有３～４４＂－锌指结构，每个锌指结构可以特异性识别ＤＮＡ上的３个连续碱基，因此每个锌指核酸酶通常可以特异性识别９。１２ｂｐ的ＤＮＡ序列。锌指核酸酶与靶ＤＮＡ结合后，ＦｏｋＩ便在结合位点进行剪切造成ＤＮＡ断裂。如果切割时存在同源序列，则会发生ＤＮＡ同源重组修复（ＨＲ），不存在同源序列时则以非同源末端连接（ＮＨＥＪ）的方式进行ＤＮＡ修复，造成基因缺失、突变或碱基插入…。１“。目前锌指蛋白的设计和筛选方法主要有以下几种：一是利用ＳａｎｇａｍｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司的专利设计锌指核酸酶，该方法效率高，特异性强，可以商业化订制，但是价格比较昂贵。二是利用开放平台ＯｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅｄＰｏｏｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（０ＰＥＮ）设计锌指核酸酶，该方法免费向公众开放，但是构建过程需２～３个月，费时费力。后来Ｊｏｕｎｇ等又开发了上下文依赖组装（ｃｏｎｔｅｘｔ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｓ．

ｓｅｍｂｌｙ，ＣｏＤＡ）方法，可以在网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｓ．ｏｒｓ／）上直接设计构建，但是报道显示该方法的成功率并不太高…３。１．２ＴＡＬＥＮｓ技术随着重复可变双残基（ｒｅｐｅａｔｖａｉｌ．ａｂｌｅｄｉ—ｒｅｓｉｄｕｅｓ，ＲＶＤｓ）与核苷酸对应关系的破解，类转

基金项目：“９７３”计划项目（“水稻优良品种的分子设计研究”分子设计和多基因组装研究，２０１３ＣＢＡｌ４０５）；“８６３”计划项目（“水稻抗褐飞虱分子设计与高产、优质抗褐飞虱水稻新品种培育”子课题，２０１２ＡＡｌ０１１０１）；农业部农业科研杰出人才及其创新团队项目“水稻分子与细胞工程育种”。作者简介：徐华山（１９８１一）。男，山东兖州人，助理研究员，研究方向：水稻遗传育种。收稿日期：２０１５—０９—０９

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录激活因子效应物核酸酶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ—ｌｉｋｅｎｕ．

ｃｌｅａｓｅｓ，ＴＡＬＥＮｓ）的研究与应用进入快速发展阶段，成为新的主流基因组编辑Ｔ具“：与ＺＦＮｓ类似，ＴＡＬＥＮｓ也由特异性蛋白与非特异性核酸酶Ｆｏｋｌ２个部分组成，特异性蛋白负责识别目标ＤＮＡ序列并引导Ｆｏｋｌ对ＤＮＡ进行切割，造成ＤＮＡ断裂，断裂的ＤＮＡ通过ＨＲ或ＮＨＥＪ机制进行修复。ＴＡＬＥ蛋白来源于黄单胞杆菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ，这是一种对农业生产有较大危害的植物病原菌。ＴＡＬＥ蛋白的Ｎ端含有ＩＩＩ型分泌信号肽，Ｃ端包含核定位信号（Ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ，ＮＬＳ）以及转录激活结构域（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ，ＡＤ），中间是决定特异性的ＤＮＡ识别结合结构域…４。ＤＮＡ识别结合结构域由多个重复氨基酸单元串联组成，每个单元含有３４个氨基酸。每个重复单元的氨基酸序列几乎一致，仅第１２和１３位可变，这２个可变氨基酸残基称为重复可变双残基（ｒｅｐｅａｔｖａｒｉａｂｌｅｄｉ—ｒｅｓｉｄｕｅｓ，ＲＶＤｓ），每个重复单元可识别结合１个核苷酸，特异性就由ＲＶＤｓ决定。研究发现共有４种ＲＶＤｓ，每种ＲＶＤｓ特异识别结合１种核苷酸，其中ＮＩ（天冬酰胺和亮氨酸）识别碱基Ａ．ＮＮ（２个天冬酰胺）识别碱基Ｇ或Ａ，ＮＧ（天冬酰胺和甘氨酸）识别碱基Ｔ，ＨＤ（组氨酸和天冬氨酸）识别碱基Ｃ。因此ＲＶＤｓ的类型、数目及顺序决定了ＴＡＬＥＮｓ识别ＤＮＡ序列的特异性“’”］。由于ＲＶＤｓ与核苷酸对应关系比较简单，每个ＲＶＤｓ特异识别结合１种核苷酸，因此与ＺＦＮｓ相比，ＴＡＬ—ＥＮｓ的可作用靶位点十分广泛。每个ＴＡＬＥＮｓ大约包含２０个左右的重复单元，组装过程比较复杂，目前其组装方法主要有以下３种：标准的限制性酶切和连接组装法、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ组装法及固相组装法１７－ＣＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ组装法花费少、构建周期短、工作量小，是目前应用最为广泛的组装方法，该方法利用ＩＩＳ型核酸酶创造多粘性末端，一次反应即可轻松连接多达１０个重复单元。目前ＴＡＬＥＮｓ技术已经在多种植物如烟草、水稻、短柄草及拟南芥中得到广泛应用。１．３Ｃ砒ＳＰＲ／Ｃａｓ系统继ＺＦＮｓ和ＴＡＬＥＮｓ之后，针对ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统的研究与应用逐渐增多。与ＺＦＮｓ和ＴＡＬＥＮｓ相比，作为后起之秀的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统在基因组编辑方面载体构建简单，花费更少，技术难度也更低。ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）是指成簇的规律间隔短同文重复序列，Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）是指与ＣＲＩＳＰＲ相关的蛋白。ＣＲＩＳＰ刚Ｃａｓ系统由ＣＲＩＳＰＲ序列和Ｃａｓ蛋白组成，其中ＣＲＩＳＰＲ序列由一些高度保守的重复序列和间隔序列相间排列组成，Ｃａｓ蛋白是ＣＲＩＳＰＲ序列附近相关基因编码的蛋白酶，具有核酸酶活性，可对ＤＮＡ序列进行切割，造成ＤＮＡ双链断裂”ｊＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统是细菌自身的一套免疫系统。当噬菌体或其他病毒入侵后，宿主ＣＲＩＳＰＲ系统识别外源ＤＮＡ中特定的前间隔序列（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ）和前间隔序列邻近序列（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆｓ，ＰＡＭｓ）。宿主将这一新的间隔序列整合进入ＣＲＩＳＰＲ系统，插入在前导序列和原先第一个重复序列之间。当同一噬菌体或病毒再次侵染时，ＣＲＩＳＰＲ序列在前导序列引导下转录出前ｃｒＲＮＡ，前ｃｒＲＮＡ接着被加工成小ｃｒＲＮＡ。这些ｃｒＲＮＡ与反式激活ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ—ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｃｒＲＮＡ，ｔｒａｃｒＲＮＡ）形成一种复合ＲＮＡ结构。复合ＲＮＡ结构识别外源ＤＮＡ中的ｓｐａｃｅｒ序列引导Ｃａｓ蛋白复合体对外源ＤＮＡ序列进行切割，从而保护宿主免受侵害。ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统共分３个类型，Ｉ型和ＩＩＩ型均需多个Ｃａｓ蛋白参与形成复合体，ＩＩ型仅需Ｃａｓ９蛋白即可，使用更方便，因此目前研究应用比较多的是ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统…”２…。２０１２年，Ｊｉｎｅｋ等”…对Ⅱ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统进行了优化，发现将ｃｒＲＮＡ和ｔｒａｃｒＲＮＡ整合成一条单一引导ＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ—ｇｕｉｄｅＲＮＡ，ｓｇ

ＲＮＡ）仍能高效引导Ｃａｓ９蛋白对

ＤＮＡ进行切割。２０１３年，Ｃｏｎｇ等。］利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统对人和小鼠细胞进行了内源基因的定点敲除。ＺＦＮｓ和ＴＡＬＥＮｓ需构建不同的融合蛋白来识别不同的ＤＮＡ序列，操作过程比较繁琐，花费较大，ＣＲＩＳＰ刚Ｃａｓ系统针对不同ＤＮＡ序列只需设计不同的引导ＲＮＡ即可，无需构建蛋白。目前ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统已经在烟草、拟南芥、高粱、水稻和小麦等多种植物基因编辑中得到广泛应用。１．４小结ＺＦＮｓ、ＴＡＬＥＮｓ和ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统是目前应用最广泛的基因组编辑工具，３种工具各具特点，研究者可根据具体情况选择。ＺＦＮｓ、ＴＡＬＥＮｓ和ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统作用原理见图１，特点比较见表１。

Ｃ－）抛

（ｂ）ＹＡＩ．．ＥＩ乜

图１ＺＦＮｓ、ＴＡＬＥＮｓ和ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统原理示意表１ＺＦＮｓ、ＴＡＬＥＮｓ和ＣⅪＳＰ刚Ｃ躯系统特点比较

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