基因组学研究进展论文

TILLING技术 姓名：罗洁学号：M201071486 院系：生命科学与技术学院 摘要：TILLING技术是一种全新的反向遗传学研究方法，它提供了一种高通量，低成本，规模化和高效筛选化学诱变剂EMS诱发产生点突变的技术。本文简要介绍了TILLING技术的原理和特点，并对其在植物功能基因组学，作物品种改良和在生物进化及检测多态性中的应用作了初步探讨。 Abstract: TILLING technology is a kind of brand-new reverse genetics study method, it provides a high throughput, low cost, scalization and efficient screening chemical mutagen EMS induced produce point mutations of technology. This paper briefly introduced the TILLING technology principle and characteristics of plants, and in its functional genomics, crop cultivar improvement and in biological evolution and testing polymorphism application was discussed 关键词：TILLING技术反向遗传学点突变 前言 随着越来越多的植物的基因组测序的完成，以表型筛选为主的正向遗传学方法正逐步被反向遗传学方法替代而成为功能基因组学研究的主要方法。反义RNA抑制、RNAi和插入突变是植物中常用的用于反向遗传学研究的方法，但这3种技术均需复杂繁琐的植物转基因表达载体构建过程以及组织培养、基因转化和周期极长的转基因植物筛选过程，作为常规方法仅限应用于极少数物种[1]。 基因组靶向定位诱导损伤技术(targeting induced local lesions in genomes，简称TILLING)是美国华盛顿Hutchinson癌症研究中心以Henikoff为首的科学家发展建立的[2]。它将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR筛选技术和Li—Cor公司生产的4300DNA遗传分析系统的双色红外荧光高通量检测技术有效结合，快速有效地从化学诱变剂甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)诱变产生的突变群体中鉴定出点突变，这一全新的、高通量、低成本的反向遗传学研究方法大大地方便了植物基因组学的研究。在TILLING技术基础上发展起来的Ecotilling(ecotypic TILI ING)技术不用化学诱变，可以直接探知存在于特定群体中某个基因或基因群的多态性(等位基因)，识别单碱基突变(SNP)、小片段插入、微卫星重复等，为基因功能研究和生物进化提供重要信息[3]。 最初的TILLING是利用DHPLC对DNA池中的突变进行检测（McCallum et al., 2000a; 2000b）。为了进一步提高这个方法的效率，适应大规模筛选的要求，Colbert 等（2001）对TILLING 作了改进。他们将所获PCR 片段先用特异性识别错配碱基的内切酶酶切异源双链核酸分子，再用变性的序列胶电泳分离酶切产物，用标准的图像处理程序分析点突变的存在。有几种酶已经被用于错配碱基的特异性识别、切割，包括S1 核酸酶（Howard et al., 1999）和T4核酸内切酶Ⅶ（Youil et al., 1996）。目前，使用较多的是S1核酸内切酶家族中的CELI酶，它是一种从芹菜（celery）中分离出的植物所特有的核酸内切酶（Oleykowski et al.,1998）。CELI酶能够识别错配碱基并在错配碱基的3' 端进行切割，再用变性的序列胶（PAGE）分离酶切产物，能够将超过1kb的PCR扩增产物内的点突变定位在几个碱基对内。因此，改进的TILLING 充分运用了CELI 酶和凝胶电泳技术，从而使其成为一个低成本、高通量的筛选突变基因的技术平台。 TILLING技术的基本原理是：首先是运用化学诱变剂诱发产生一系列的点突变而获得突变群体，提取DNA并把多个待测样品DNA混合建立突变群体及其DNA池，然后利用特异性引物对特定DNA区段进行PCR扩增，通过变性和复性过程得到异质双链。如果有突变发生，那么形成的异质双链中将含有错配碱基。利用特异性的核酸内切酶识别错配碱基的异质双链并在错配处切开双链，最后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。如果发现阳性结果，则再在混合的样品中逐一检测，最后确定阳性样本。 1 TILLING技术路线 TILLING技术先用化学诱变剂诱发产生一系列的点突变，再用设计的特异性引物进行PCR扩增，而后将PCR扩增产物变性和退火形成异源双链核酸分子，再用特异切割错配的内切酶CELl酶切，最后变性处理后采用双色聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳检测分析[4]。包括S1核酸酶和T4核酸内切酶Ⅶ在内的几种酶已用于碱基错配的特异性识别和切割，其中应用较多的是S1核酸内切酶家族中的CELl酶[5]。这个过程中起重要作用的CELl酶是从芹菜中分离的植物特有的核酸内切酶，它能够识别单碱基错配并在错配碱基的3 端进行切割，酶切产物经变性PAGE胶分离，能将超过1 kb的PCR产物内的点突变定位在几个碱基对内[6]。TILLING的具体操作步骤是[7]：⑴ EMS（Ethyl Methane Sulfonic acid）处理种子，诱导产生一系列点突变；⑵将种子培养，获得第一代突变个体（M1）；⑶ M1 植株自花授粉，产生第二代植株（M2）；⑷ M2 植株抽提DNA 存放于96 孔微量滴定板，并保留M2代种子；⑸将多个96孔板的DNA 样本合并到一个96孔板内（最多可合并8 个）得到DNA池；⑹根据目标基因序列设计一对特异性引物进行PCR 扩增，两个引物分别用700nm和800nm荧光染料标记；⑺ PCR扩增片段变性、退火，从而得到野生型和突变型所形成的异源双链核酸分子；⑻用特异性识别并切割错配碱基的核酸内切酶剪切异源双链核酸分子；⑼酶切产物用变性的聚丙烯酰胺（DPAGE）凝胶电泳分离，然后用标准的图象处理程序分析电泳图象，获得突变池；⑽利用相同方法从突变池中筛选突变个体；⑾突变个体PCR片段测序验证；⑿突变表型鉴定 1.1 TILLING技术中的引物设计 根据目标基因序列设计特异引物，是TILLING分析的一个重要步骤，引物设计的好坏直接影响TILLING筛选的结果。Taybr和Greene专门为拟南芥TILLING 项目研究开发了CODDLE程序[8]。CODDLE不仅能识别各种形式的序列信息，按输入的碱基序列产生基因模型和蛋白质保守区域模型，还能列出EMS诱导植株产生有害突变的可能范围，当1 kb左右的区段被选中后，系统将会根据最有可能突变成为高频率终止密码子的区域或进化保守区域设计引物[9]。设计完成后，研究人员可用Primer3程序对C0DDI E列出的候选引物加以选择口，然后在MWGBiotech订购引物。TILL ING引物设计的前提条件是要知道自己想研究基因的序列信息，其基因序列信息可以是基因组序列，也可以是cDNA序列[10]。在应用Ecotilling于生物进化研究和检测多态性时，可以选择非编码区设计引物来获得更多的信息[11]。 1.2 TILLING技术中点突变的检测 点突变通常存在检测困难的问题，这也是TILLING应用上的关键障碍。Collhert等将LI—C0R 4300 DNA遗传分析系统的双色红外荧光检测技术引入TILLING中，大大提高了筛选效率[12]。由于杂质、干扰分子在红外光区几乎不发光，用红外荧光检测不仅背景非常低，灵敏度也很高。而TILLING实验过程中由于核酸外切酶活性会导致一些信号丢失，因此应用红外检测技术提高灵敏度对于TILLING检测非常重要。相对常用的可见光检测，红外荧光检测具有背景低、灵敏度高的优点。此外，结合红外荧光引物后，该检测方法还具有另一个优点——宽广的线性范围。这一特点使得强信号和弱信号能够同时被分辨，当野生型条带的信号强，突变型条带信号弱时，LI—CORDNA分析系统也能够轻松识别突变。应用TILLING技术时，获得未经修改的图像原始数据对于检测的灵敏度和准确性都很重要。如果检测系统在检测时对荧光数据已经进行了处理，很可能会过滤掉大部分甚至是全部的突变信息。将红外荧光检测技术与TILLING技术结合后，可以同时获得两张真实的电泳图像，分别在700 nm和800 nm通道采集，这两个通道检测波长相距100 nm，几乎无光谱重叠的干扰，保证TILLING分析中每个突变碱基的准确识别及整个检测的灵敏度。通过PCR反应得到的异源核酸双链分子在碱基错配处被切断，由于两个剪切片断采用不同的荧光染料标记，如果真的发生了突变，双色检测时将在野生型条带下面出现两个突变条带，分别位于700 nm和800 nm电泳图的同一泳道。同时，这两个突变条带的分子量之和应该等于野生型条带的分子量，因而双色检测能够有效排除假阳性点突变，准确度很高。 1.3 TILLING技术中突变体及表型的鉴定 一旦在一个DNA池中检测到了一个突变，那么就要对这个DNA 池中每一个单株的DNA 样品进行筛选。单株的DNA样品可以排列在一个8×8的微量滴定板中，每一个DNA池对应一排(8个)DNA样品。用一个有8个吸头的移液器将阳性DNA 池对应的8 个DNA 样品转移至一个新的微量滴定板（8×12）中。因此每块板可以对12 个阳性的DNA 池中的所有单株进行筛选。利用UNIX程序（pick）可以方便的将要筛选的每一块96孔板的每一行与阳性DNA池对应起来，并能以表格的形式将结果输出。为了能够检测出突变，每一个单株的DNA样品中等量混入野生型DNA样品。然后用与筛选DNA池同样的方法筛选突变个体，包括PCR 扩增，CELI酶切，凝胶电泳，Grab、Photoshop 等软件分析。筛选结果能将突变位点定位在几个碱基对内。用这种两次筛选的方法，筛选1kb左右的目标片段，每块胶大约可以筛选750kb的基因组序列（1kb×8个单株DNA×96孔）。每个96孔DNA池相当于768个单株，平均可筛选到7个点突变。通过GelBuddy／SAGA软件分析所获得的电泳图像，在混合池里发现了突变，再检测混合池里的单株，最后通过测序来确定突变单株。获得突变序列之后，可以通过在SIFT和PARSESNP软件上预测确定了的突变类型。随后可以对获得的错义突变和基因截短型损伤两个突变类型后期突变表型的确认。第一种快速的方法是鉴定两个独立有害突变位点的个体，将二者杂交，分析后代的基因型。在每个含有非等位基因的个体中，均会发现一个属于两个亲本之一的突变表型，而将不等位的突变单独归类；第二种就是将突变体与野生型杂交，观察突变是否与表型在F2代共分离，F2代的突变体检测可以采用TILLNG和dCAPS标记；第三种方法就是通过用目的基因进行转化看能否使突变体的表型得以恢复，从而将表型与目的基因联系起来[11]。 2 TILLING技术的核心与特点 2.1 TILLING技术的核心 由上可见，如何有效识别异源双链中错配碱基是TILLING技术的核心。从芹菜里提取的核酸酶CEL I是被认为具有高度特异性识别错配碱基的真核剪切酶，它可以识别双链DNA中错配的碱基，但对各种错配碱基切割偏爱程度并不完全一样，表现为C/C≥C/A~C/T≥G/G> A/C～A /A~T/C>T/G~G/T~G/A~A/G>T/T[13] .CEL I的最佳pH值为中性，具有274个氨基酸残基，分子量约31．44kDa,切割时需要Zn2+参与，同时Mg2+对其有效的切割3’端错配核甘酸也具有帮助[14]。CEL I不仅能识别错配碱基并能在错配碱基的3’端进行切割，再用变性的序列胶(PAGE)分离酶切产物，能够将超过1 kb的PCR扩增产物内的点突变定位在几个碱基对内。CEL I的引入是TILLING广泛应用的基础，大大地提高了TILLING的工作效率[15]。 在TILLING中，引物设计的好坏直接影响着对突变筛选的结果，所以在确立所要筛选的目标区段后，如何根据目标序列设计引物就成为TILLING的一个重要方面。幸运的是在拟南芥TILLING项目(Arabidopsis TILLING project，ATP)研究开发了CODDLE(codons optimized to discover deleterious)程序(http：／／www．proweb．org／coddle)，该程序能够识别各种形式的序列信息，并能根据输入的碱基序列产生基因模型和蛋白质保守区域模型，能够列出EMS诱导植株产生有害突变的可能范围，当1 000 bp左右的区段被选中后，系统就会根据最有可能突变成为高频率终止密码子的区域或进化保守区域设计引物，结合其他引物设计程序(如Primer3或Primer5)可对CODDLE列出的候选引物进行选择[16]。 点突变的检测和突变体的鉴定是TILLING的另一个核心内容。通常点突变很难被检测，要求