双酶切连接反应全攻略

双酶切连接反应全攻略

回收 PCR 产物

PCR 扩增时，给引物两端设计好酶切位点。一般说来，限制酶的选择非常重要。尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如 BamHI、HindIII，提前看好各公司的双酶切所用公用的 BUFFER，以及各酶在公用BUFFER 里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，一般都是加 3 个保护碱基，平衡 GC 含量。

双酶切时间及其体系

需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要。我一般酶切 3 个小时，其实 1 个小时已经足够。应用大体系，如 100 微升。

纯化问题

纯化 PCR 产物割胶还是柱式，我推荐柱式。因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉。所以，PCR 产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

酶量的问题

以 TAKARA 的为例，其对 1 单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应 1 小时，将 1 μg 的λDNA 完全分解的酶量定义为 1 个活性单位（U）。而该酶浓度约为 15 单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15 μg 的 DNA，而一般从 1-4 ml 菌液提出的 DNA 约为 3 μg，而 PCR 纯化后的产物（50 体系）约为 3 μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR 产物片段=1：10，一般取前者 0.03 pmol，后者取 0.3 pmol。

pmol 为单位的 DNA 转换为为µg 单位的 DNA：（X pmoles×长度bp×650）/1 000 000（注：长度bp×650 是该双链 DNA 的分子量）所得数值即为µg，也可以直接用这个公式套：1 pmol 1000 bp DNA=0.66 μg，如载体分子量是 5380 bp，则 0.03 pmol 为0.03×5.38×0.66=0.106524 µg。

测 DNA 浓度可以在专用机子上测，注意 OD 值，一般约 1.8-2.0。另外，如果嫌麻烦，也可用 MARKER 进行估测，如 MARKER 2000，5 微升的 MARKER 每个条带约 50 ng。

连接反应

TAKARA 的连接酶说明书上的写的是过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl 的连接反应体系中，6 μg 的λDNA-Hind III 的分解物在 16℃下反应 30 分钟时，有 90% 以上的 DNA 片段被连接所需要的酶量定

义为 1 个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间 3 个小时足已。

转化

全量（10 μl）加入至100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。

42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。

加入890 μl AMP 阴性培养基，37℃振荡培养 60 分钟。

取100 μl 铺板。也可离心后余100 μl。

几个非常重要的问题

做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态。因为连接酶很容易降解。为保险起见，一般连接 3 小时，16 度。

对含有氨苄抗性的质粒铺板时，注意加氨苄时的温度。温度过高，会使克隆株无法筛选出来。我的方法是培养基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为 55-60 度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。

为验证双酶切是否成功，可做对照：酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种 BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性。如两管均成线性可初步判断双酶切成功。

做转化时，也要进行对照。设 4 个对照组：

1. 拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功。如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切。如没长出克隆，则证明双酶切成功。当然要保证感受态、培养基、连接酶都正常的情况下。

2. 酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒。

3. 设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误。

4. AMP 阴性板上用同一批感受态细胞铺板 20 微升足够，检测感受态状况。

所有的试剂切记低温保存。一步一个脚印，不要偷懒，图省事最后却更费事。注意设立对照。

经 PCR 鉴定，克隆 90%-100% 的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选 4 个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。