亲水相互作用色谱_高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖_吴成玲
亲水作用色谱—质谱联用法同时测定参附注射液中的14种有机酸
亲水作用色谱—质谱联用法同时测定参附注射液中的14种有机酸作者：刘瑶张娜史社坡宋青青李军宋月林屠鹏飞来源：《中国中药杂志》2016年第18期[摘要]有机酸广泛分布在植物及相关产品中，其参与多种代谢途径（如三羧酸循环），并表现出多种药理活性。
参附注射液作为广泛使用的中药注射剂，不良反应时有报道。
因而，应深入阐明参附注射液的化学组成，并制定严格的质量标准，进而保障其临床使用安全有效。
参附注射液由红参及黑顺片经现代工艺提取制备而成，有机酸为其主要成分类别之一。
该研究通过建立HTTJTC-LC-MS，同时测定参附注射液中肉桂酸、阿魏酸、4-羟基苯甲酸、乳酸、己二酸、延胡索酸、咖啡酸、琥珀酸、马来酸、丙二酸、苹果酸、莽草酸、酒石酸和金鸡纳酸等14种有机酸成分的含量。
14种有机酸类成分在HTTJTC色谱柱上均获得较好的保留和分离。
除肉桂酸（231μg·L-1）、乳酸（113μg·L-1）和丙二酸（32.5μg·L-1）外，其余11个化合物的定量限均小于10μg·L-1。
定量结果表明，苹果酸、丙二酸、奎尼酸、乳酸和肉桂酸在参附注射液中含量较高（>1.89 mg·L-1），而10批样品中均未检测到咖啡酸和己二酸。
该方法适用于参附等中药注射液中多种有机酸含量的同时测定。
[关键词]有机酸；参附注射液；多成分含量测定；亲水作用色谱法；质谱参附注射液由红参和黑顺片经现代工艺提取制备而成，具回阳救逆、益气固脱之功效，为临床常用中药注射剂。
主要用于阳气暴脱的厥脱症（感染性、失血性、失液性休克等）及阳虚（气虚）所致的惊悸、怔忡、喘咳、胃疼、泄泻、痹症等作为广泛使用的中药注射剂。
参附注射液的不良反应时有报道。
因此，应深入阐明参附注射液的化学组成，并制定严格的质量标准。
有机酸作为参附注射液的主要化学成分类别之一，在其药效作用及不良反应中均发挥了重要作用。
有机酸广泛分布于植物的根、叶、果实等部位。
亲水作用色谱分析吡啶离子液体阳离子
亲水作用色谱分析吡啶离子液体阳离子丁彩云 摘要：本研究建立了一种亲水作用色谱结合紫外检测分析吡啶离子液体阳离子的方法。
以哌啶离子液体为流动相添加剂，明显地改善了吡啶阳离子的分离效果，吡啶阳离子可在短 时间内实现良好的分离检测。
吡啶离子液体阳离子在亲水色谱柱上的保留行为符合亲水作用 色谱的特点, 并且其保留规律符合碳数规律。
采用以氨基甲酰基为功能基团的亲水相互作用 色谱柱，以 3.0 mmol/L N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐(水/乙腈, 40/60, v/v) 为流动相， 以 215 nm 为紫外检测波长，在接近室温的 35°C 下进行分析。
N-辛基吡啶阳离子、N-己基 吡啶阳离子和 N-丁基吡啶阳离子可在 10 min 内完成分离、检测。
检出限(S/N=3)分别为 0.003、 0.005 和 0.017 mg/L，7 次测定保留时间和峰面积的相对标准偏差均小于 0.4%。
关键词 ：亲水相互作用色谱；紫外检测；吡啶阳离子；离子液体离子液体是由离子组成的，在室温或接近室温下呈液态的盐类[1, 2]。
其中阳离子一 般为对称性低的有机阳离子，阴离子一般为体积较小，对称性较好的无机弱配位阴离子或有 机阴离子。
根据离子液体阳离子的化学结构不同，离子液体可以分为咪唑类、吡啶类、季铵 类和季鏻类等。
与传统溶剂相比，离子液体具有很多独特的物理化学性质，如液程宽、不挥 发、溶解能力强、不可燃、热容量大、离子导电率高、萃取能力好、相稳定性好、 热稳定 性好、水稳定性好、酸碱稳定性好等、绿色环保等特点[3-6]。
因此，其已被广泛应用于分析 化学[7-12]、环境科学[13]、有机合成[14]及电化学[15-17]等领域和成为诸多领域的研究热点。
例如， 在液相色谱中离子液体可作为流动相添加剂[18-21]和固定相[22-25]等。
随着离子液体应用范围的 不断扩大，势必会导致其流失到环境中。
因此，越来越多研究者的关注离子液体会对环境造 成的污染有多大、在自然界中的降解程度怎么样以及离子液体的生物毒性又如何等问题。
寡糖的重均分子量
寡糖的重均分子量【原创版】目录1.寡糖的定义和重要性2.寡糖重均分子量的概念3.寡糖重均分子量的测量方法4.寡糖重均分子量的应用5.寡糖重均分子量的研究进展正文1.寡糖的定义和重要性寡糖，又称低聚糖，是由 2-10 个单糖分子通过糖苷键连接而成的碳水化合物。
它们广泛存在于水果、蔬菜和动物乳汁中，具有重要的生理功能，如调节肠道菌群、增强免疫力等。
因此，研究寡糖的性质对于了解其生理作用及开发相关产品具有重要意义。
2.寡糖重均分子量的概念寡糖重均分子量（Average Molecular Weight, AMW）是指寡糖分子量的平均值，通常用克/摩尔表示。
它是衡量寡糖分子量大小的重要指标，对于研究寡糖的结构、功能和生物活性具有重要意义。
3.寡糖重均分子量的测量方法寡糖重均分子量的测量方法主要包括以下几种：（1）凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography, GPC）：这是一种常用的测量方法，基于分子大小不同，通过凝胶柱的速率不同，从而实现对寡糖分子量的分离和测定。
（2）质谱法（Mass Spectrometry, MS）：通过质谱分析，可以准确测量寡糖的分子量，但通常需要与其他方法相互验证。
（3）光散射法（Light Scattering, LS）：光散射法通过测量溶液中寡糖颗粒对光的散射程度，推算出分子量。
这种方法简便快速，但准确性相对较低。
4.寡糖重均分子量的应用寡糖重均分子量对于研究寡糖的生物活性、消化吸收、结构特征等方面具有重要意义。
此外，在生产过程中，控制寡糖的重均分子量可以提高产品质量和稳定性。
5.寡糖重均分子量的研究进展随着科学技术的发展，寡糖重均分子量的研究取得了显著进展。
例如，通过改进测量方法和仪器设备，提高了测量的准确性和效率；对于不同类型的寡糖，研究了其重均分子量与生物活性之间的关系，为开发高生物活性的寡糖产品提供了理论依据。
亲水作用色谱-串联质谱法测定稻米中的草甘膦和氨甲基磷酸残留量
基 团 ， 以直接 利用 紫外 和荧 光检测 器进 行检测 ， 难 因
此， 柱前 或 柱后 衍 生 方 法 常 用 于 改 善 Ｇ 和 ＨＰ Ｃ Ｃ Ｌ
的色谱 行为及 提 高检测 响应值 。如早期 常采用 三氟
乙酸酐 和三 氟 乙醇 等用 于 Ｇ 的柱前 衍 生 “ ， 一 Ｃ ９ 芴 基 甲 基 氯 仿 （ ＭＯ － １ 等 用 于 Ｈ Ｌ 柱 前 衍 Ｆ ＣＣ） ＰＣ 生 ¨ 结合 氮 磷 检 测 器 （ Ｄ） 荧 光 检 测 器 进 “ ， ＮＰ 或
最 大 的广谱非 选择 性 除 草 剂 ， 可有 效 防除 一 年生 与
多 年 生 的禾 本 科 、 子 叶杂 草 及 灌 木 等 双 ， ００ ２ １
年 全球 总需求 量为 ７ ７ ０～ ５万 吨左右 ， 国年需求 量 我
亲水作 用色谱 柱 、 动相 组 成 及 质谱 条 件 等 对测 定 流 灵 敏 度 、 密度 的影 响 ， 精 考察 了提取 和净 化方式 对方
法 回收率 的影 响。
达 ５万吨左 右 。虽然 草甘 膦属 于低毒 类 的有 机磷 除草剂 ， 但其 不合 理 的使 用 仍 会 导致 其 过 高 地残 留 于植物 体 中。草 甘 膦 及 其 主要 代 谢 物 氨 甲基 磷 酸
（ ｍｉｏ ｔｙ ｈ ｓ ｈ ｎｃ ａ ｉ ，Ａ Ａ） 有 与 有 ａ ｎ ｍｅｈ ｌ ｏ ｐ ｏ ｉ ｃｄ ＭＰ 具 ｐ
行定 量分 析 ， 方法 灵敏 度低 ， 但 不方 面 ， 于缺 少生 色 Ｈ Ｌ 进 另 由
１ ３ 标 准储 备液和 工作 溶液 的配 制 ． Ｇ ｙ和 Ａ Ａ标 准储 备液 ： ｌ ＭＰ 分别称 取 １ （ ０ｍｇ 精 确 至 ０ ０ ） Ｇｌ Ａ Ａ标准 品 ， 水溶 解并 ． １ｍｇ 的 ｙ和 ＭＰ 用
亲水作用色谱-电喷雾串联质谱法测定水产品中的氟苯尼考胺的残留量
亲水作用色谱-电喷雾串联质谱法测定水产品中的氟苯尼考胺的残留量刘正才;张琼;杨方;林永辉;刘素珍;苏芝娇【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2015(036)004【摘要】建立亲水作用色谱-电喷雾串联质谱测定水产品中氟苯尼考胺残留量的测定方法.样品用碱性乙酸乙酯提取,以正己烷和脂肪吸附材料去除油脂,用5 mmol/L 乙酸铵溶液(含0.2％甲酸)和乙腈作为流动相,以梯度洗脱方式在Acquity UPLC BEH HILIC柱(55 mm×2.1 mm,1.7 μm)色谱柱上分离,以电喷雾离子源正离子模式进行质谱分析,基质外标法定量.结果表明,氟苯尼考胺的质量浓度在0.1～20μg/L 范围内呈良好的线性,相关系数(r2)大于0.990.在1.0～50.0 μg/kg加标水平下,虾、黄鱼、鳗鱼、烤鳗的平均回收率为70.5％～87.7％,相对标准偏差为4.8％～11.6％,定量限为1.0 μg/kg.该方法简单、灵敏、稳定,可满足水产品中氟苯尼考胺残留量的检测和确证需要.【总页数】4页(P198-201)【作者】刘正才;张琼;杨方;林永辉;刘素珍;苏芝娇【作者单位】福建出入境检验检疫局福建省检验检疫技术研究重点实验室,福建福州 350001;福建出入境检验检疫局福建省检验检疫技术研究重点实验室,福建福州350001;福建出入境检验检疫局福建省检验检疫技术研究重点实验室,福建福州350001;福建出入境检验检疫局福建省检验检疫技术研究重点实验室,福建福州350001;福建出入境检验检疫局福建省检验检疫技术研究重点实验室,福建福州350001;福建出入境检验检疫局福建省检验检疫技术研究重点实验室,福建福州350001【正文语种】中文【中图分类】O657.63【相关文献】1.亲水作用色谱-串联质谱法测定化妆品中三聚氰胺残留量 [J], 梅少博;侯晋;张文国;倪鹏;殷烈;丁黎2.亲水作用色谱-电喷雾串联质谱法检测原料奶及奶制品中的三聚氰胺 [J], 严丽娟;吴敏;张志刚;周昱;林立毅;方恩华;徐敦明;陈鹭平3.亲水作用色谱-电喷雾串联质谱法测定生鲜牛乳及奶粉中的双氰胺 [J], 李丹妮;顾欣;严凤4.亲水作用色谱-串联质谱法测定动物源运动食品中3种氨基糖苷类抗生素的残留量 [J], 宫明明5.亲水作用液相色谱电喷雾串联质谱法测定米线中乌洛托品残留 [J], 陆春良;刘娟;刘向农因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
(分析化学)亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用
研究报告DOI :10.3724/SP.J.1096.2014.30310亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用江静1,2 应万涛*2 钱小红*21(中国人民解放军总医院,军医进修学院,北京100039)2(蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,解放军医学院,北京102206)摘 要 蛋白质的糖基化修饰在生理及病理过程中发挥着重要作用㊂由于技术条件的限制,传统的糖蛋白分析方法中,通常分别鉴定蛋白质和糖链两者的结构,而忽略了蛋白质与糖链的连接关系㊂本研究旨在以完整糖肽作为检测对象,对糖肽中肽段序列和糖链结构的同步解析㊂采用亲水相互作用色谱对完整糖肽进行分离纯化,联合生物质谱中碰撞诱导解离(CID)㊁高能诱导解离(HCD)㊁电子转移解离(ETD)等裂解模式,对完整糖肽的糖基化位点㊁糖链结构㊁肽段序列等进行全方面的解析㊂结果表明,亲水相互作用色谱中样品与填料比1∶50可有效富集糖肽,采用30%CID 能量,主要产生糖苷键断裂的碎片,为糖链的结构组成分析提供了线索;采用25%HCD 能量,在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息,并产生明确的糖肽Y1特征离子;ETD 保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂,可以提供有效的肽段序列信息㊂本研究结合亲水相互作用色谱与质谱仪中的多种碎裂方式,为完整糖肽的结构解析提供了一种快速㊁有效的研究方案㊂关键词 亲水作用色谱;串联质谱;完整糖肽;碰撞诱导解离;高能诱导解离;电子转移解离 2013⁃06⁃07收稿;2013⁃08⁃05接受本文系国家高技术研究发展计划(No.2012AA020203)㊁国际科技合作项目(No.2011DFB30370)㊁北京市科技新星计划(No.Z121107002512014)资助*E⁃mail:yingwtll@,qianxh1@ 1 引 言蛋白质的糖基化修饰是生物体内普遍存在的一种重要翻译后修饰方式[1,2],但其研究面临很多挑战㊂糖基化修饰具有多样性㊂糖基化修饰没有任何模板[3],而是由200多种糖基转移酶调控,同一蛋白质的不同位点的修饰水平不一,同一位点所携带的糖链也存在多种结构,这给分析技术和软件工具带来了巨大挑战;目前完整糖肽的分析手段有限,主要以质谱分析为主,但由于糖肽修饰的微不均一性,及在质谱中离子化困难㊁碎裂情况复杂等特点,严重制约了完整糖肽的富集和质谱分析技术的发展㊂2012年,Doerr 等[4]总结了糖蛋白质结构解析的经典研究手段,并指出主要的研究方法是先将糖链从蛋白上释放,然后分别对两者进行解析,这导致了蛋白与糖链之间联系的缺失㊂聚糖结构解析[5],可以解析大量糖链结构,却忽视了糖链的来源;蛋白部分研究[6],可以得到明确的蛋白序列及大规模糖基化位点,却丢失了糖链信息㊂Nakano 等[7]研究发现,特异位点的糖基化修饰影响生物学功能,这表明位点特异性水平的糖基化修饰研究对进一步阐释糖蛋白质的生理功能及其在病理过程中的变化具有重要意义㊂因此,开发完整糖肽水平的研究方法,保留蛋白质与聚糖之间的连接,已成为当前的研究热点㊂完整糖肽的复杂结构对分析方法的制约,需要从富集和鉴定两方面解决㊂首先是由不均一性导致的糖肽低化学计量水平,及其在质谱中离子化效率不高而受非糖肽信号抑制的问题㊂可以通过完整糖肽的富集与分离,去除非糖肽的干扰而提高糖肽的相对丰度㊂目前应用于富集糖蛋白/糖肽的方法主要有凝集素[8]㊁二氧化钛[9]㊁酰肼[10]和亲水相互作用色谱(Hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)[11]等㊂其中,HILIC 是基于富含多羟基的糖链结构的强亲水特性,而使糖肽与非糖基化肽段得以分离㊂HILIC 对不同类型的糖肽没有偏性,且能保持糖链结构的完整性,适合作为完整糖肽结构研究中的富集技术㊂其次,完整糖肽包含肽段和糖链两部分,其结构和连接方式的差异导致两者在串联质谱第42卷2014年2月 分析化学(FENXI HUAXUE ) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第2期159~165061 分析化学第42卷中的碎裂行为有较大的区别,仅采用经典的碰撞诱导解离(Collision⁃induced dissociation,CID)碎裂不能有效得到糖肽的全面信息,Wiesner等[12]指出,电子转移解离(Electron transfer dissociation,ETD)碎裂模式在蛋白质翻译后修饰研究中,可以补充CID的不足而发挥重要作用,高能诱导解离(High energy colli⁃sional dissociation,HCD)可以提供更为丰富的低分子段碎片离子信息㊂多种碎裂方式联合的方法在蛋白质组学中也已经得到有效应用[13],多种碎裂方式联合应用的方式可以为完整糖肽研究提供借鉴㊂本研究以完整糖肽作为检测对象,制作了HILIC富集装置,并联合CID,HCD,ETD等多种串联质谱碎裂方式,在解析糖链结构的同时,获取肽段序列以及糖基化位点信息,从而实现糖蛋白结构的全面解析㊂2 实验部分2.1 仪器、试剂与材料基质辅助激光解吸附电离飞行时间串联质谱仪(UltrafleXtremeMALDI⁃TOF/TOF⁃MS,德国Bruker Daltonics公司);电喷雾电离⁃线性离子阱⁃静电场轨道阱质谱仪(ESI⁃LTQ⁃Orbitrap⁃XL,美国Thermo Fisher公司);离心机㊁冷冻干燥离心机(美国Thermo Fisher公司);HILIC小柱(自制,亲水相互作用填料为博纳艾杰尔科技产品)㊂牛胎球蛋白(Fetuin)㊁核糖核酸酶B(RNase B)㊁2,5⁃二羟基苯甲酸(DHB)㊁乙腈(美国Sigma公司);肽⁃N⁃糖苷酶F(PNGase F,NEB公司);胰酶Trypsin(测序级,美国Promega公司);二硫苏糖醇(DTT,美国GE公司),碘乙酰胺(IAA,比利时Acros公司),三氟乙酸(TFA)㊁甲酸(美国Fluka公司);其它试剂均为国产分析纯,实验用水为Milli⁃Q制备的超纯水㊂2.2 实验方法2.2.1 糖蛋白酶解 取适量牛胎球蛋白或核糖核酸酶B蛋白,溶解于50mmol/L NH4HCO3㊂加入适量DTT,使终浓度为10mmol/L,56℃水浴1h㊂加入IAA,使其终浓度为40mmol/L,暗处反应30min㊂加入终浓度为10mmol/L DTT封闭过量的IAA㊂按质量比1∶50加入胰酶进行酶切,37℃反应过夜㊂反应溶液置于95℃水浴10min,灭活胰酶,终止酶解反应㊂2.2.2 HILIC小柱富集完整糖肽 本实验使用由移液枪头自制的HILIC小柱富集纯化蛋白酶切混合物中的糖肽㊂首先,用80%乙腈,1%FA,冲洗活化小柱,然后,浓缩的酶切混合物,溶于50μL80%乙腈,1%FA溶液,上样于HILIC小柱㊂再用100μL80%乙腈,1%FA溶液进行脱盐,重复3次㊂最后用5%乙腈,1%FA溶液100μL洗脱,收集糖肽㊂洗脱溶液用冷冻干燥离心机旋干,-20℃保存待用㊂2.2.3 MALDI⁃TOF/TOF⁃MS分析条件 肽段或富集后的糖肽与DHB(2,5⁃二羟基苯甲酸)基质1∶1混合点靶㊂采用正离子反射模式,离子源电压20kV,脉冲离子提取电压18.8kV,离子提取延时时间110ns,激光频率2000Hz,激光能量50%,每张谱图共采集1500个激光点,校准相对误差≤5ppm㊂分析质谱图谱的软件为FlexAnalysis3.4㊂2.2.4 ESI⁃LTQ⁃Orbitrap⁃XL分析条件 HILIC小柱富集纯化得到的完整糖肽样品,溶解于50%乙腈⁃0.1%甲酸溶液中,用纳升级电喷雾离子源直接进样,采用LTQ⁃Orbitrap⁃XL质谱仪,正离子模式下扫描㊂采用碰撞诱导解离(CID);高能诱导解离(HCD);电子转移解离(ETD)等不同的碎裂方式进行碎裂,然后由Orbitrap进行检测㊂3 结果与讨论3.1 亲水相互作用色谱富集完整糖肽3.1.1 HILIC富集糖肽方法考察 本研究采用牛胎球蛋白优化HILIC小柱富集步骤㊂牛胎球蛋白由Trypsin酶切后,经PNGase F处理去除糖肽上的糖链,未经富集的Fetuin蛋白酶切产物如图1a所示㊂PNGase F去除糖链后,消除了糖链不均一性对质谱的影响,但由于样品体系的复杂性和肽段性质的差异,去糖后的糖肽在蛋白的总酶切肽段中的相对信号依然较弱㊂非糖基化肽段形成的分子离子峰1474.84对其它肽段产生了明显抑制(图1a)㊂例如,去糖后N99位的肽段[M+H]+m/z3672.7519,及N156位的肽段[M+H]+m/z1741.8247,在谱图中仅为依稀可见的两个小峰,而N176位的肽段[M+H]+m /z 3017.5538甚至难以在谱图中显现㊂基于糖肽中糖链部分的亲水性,以HILIC 填料制作的富集小柱可以用于富集并分离样品中的完整糖肽㊂蛋白质酶切混合物在高有机相溶液中上样,糖肽借助其糖链部分富含的羟基等亲水基团而保留在填料表面的水化层中,而疏水性较强的非糖基化肽段在流动相中分配系数更大而不在小柱上保留㊂继续用高有机相溶液充分清洗材料上的非特异性吸附后,由高水相溶液洗脱并收集糖肽㊂这种基于分配机制分离的色谱方法,选择合适有机溶剂含量的流动相,可以减少材料的非特异性吸附,提高富集效率㊂图1b 采用20%乙腈⁃1%甲酸溶液洗脱糖肽,图1c 采用5%乙腈⁃1%甲酸溶液洗脱糖肽,由PNGase F 处理富集后产物,经MALDI⁃TOF 质谱检测㊂图中可见,两者都可以有效的富集Fetuin 的3个N ⁃糖基化肽段㊂但在20%乙腈洗脱时,m /z 1500~2500区域内有较多非糖肽的杂峰,而在5%乙腈洗脱时,该区域中非特异性吸附引入的干扰明显减少㊂结果表明,采用5%乙腈⁃1%甲酸溶液洗脱糖肽可以进一步去除非糖肽的干扰,获得更好的糖肽富集效果㊂图1 (a)牛胎球蛋白酶切总肽段的一级质谱图;牛胎球蛋白酶切物,经亲水作用色谱柱富集,20%(b)或5%(c)乙腈洗脱产物的一级质谱图(星号标注了去糖基化后的糖肽)Fig.1 (a)Mass spectrum of fetuin peptides digests,and mass spectrum of fetuin glycopeptides enriched by hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)and then eluted by acetonitrile buffer with concentration of 20%(b)or 5%(c)(*:the deglycosylated peptides).采用移液器枪头作为HILIC 填料的载体,可以根据目标样品的多少自由选择合适量的HILIC 填料㊂合适的填料与样品比例,可以保证较好的富集效果,减少吸附损失的影响,也可以防止样品过载㊂固定填料的用量,依次提高蛋白质的上样量,即选取样品与填料质量比为1∶1000,1∶500,1∶50,1∶10时对Fetuin 蛋白的酶切产物进行富集㊂对在洗脱组分和上样流出组分的糖肽信号进行分析,以3个糖肽中信号强度最高的N156位糖肽的去除糖链后肽段[M+H]+m /z 1741.8247(序列为LCPDCPLLAPLNDSR)的相对强度作为参照,结果如图2所示㊂在样品与填料质量比为1∶10,结合组分和流出组分中的糖肽 图2 不同HILIC 填料与糖蛋白样品的比例对富集效果的影响Fig.2 Relative intensity of glycopeptides under different reaction ratio between glycoprotein and HILIC material1.洗脱组分(Elution);2.流出组分(Flow through)㊂信号都最高,因此以该条件下的糖肽信号为100%,分别计算其它条件下结合组分和流出组分中的糖肽相对强度㊂当选取样品与填料质量比为1∶1000和1∶500时,虽然流出组分中未结合的糖肽比例低于20%,但洗脱组分中的糖肽信号也小于40%㊂当样品与填料质量比为1∶50时,结合组分中糖肽得到有效的富集,而流出组分中糖肽信号仍低于20%㊂样品与填料比例为1∶10时,上样流出组分中的糖肽相对信号大幅增加,表明此时糖肽已经过载㊂因此,在制作HILIC 小柱时,采用样品与填料质量比为1∶50时富集效果显著,并能得到较好的回收率㊂3.1.2 RNase B 完整糖肽制备与纯化 RNase B 经过Trypsin 酶切,在DHB 基质辅助下,得到糖肽和肽段混合物的一级质谱图,如图3a 所示㊂由于糖基化的微不均一性,核糖核苷酶B 的同一糖基化位点含有5个不同糖链长度的高甘露糖(Mannose,Man),即在化学计量水平,一个肽段的丰度被分散到5个糖肽上㊂对于相对含量较低的糖型,受到其它肽段的161第2期江静等:亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用 干扰更为严重,而不利于质谱的选择与检测㊂经过HILIC 小柱富集后,酶切产物中的非糖基化肽段被有效的去除,仅留下5个清晰的糖肽(图3b),为肽段序列SRNLTK 上分别连接Man5,Man6,Man7,Man8,Man9等不同长度的高甘露糖糖链㊂图3 (a)RNase B 酶切总肽段富集前的一级质谱图;(b)RNase B 肽段经亲水作用色谱柱富集后的一级质谱图(*:混合在总肽段中的糖肽)Fig.3 (a)Mass spectrum of peptides mixture from RNase B and (b)Mass spectrum of RNase B peptides after HILIC enrichment;(*:the glycopeptides)HILIC 亲水相互作用富集糖肽的方法,在保证分离效果和富集效率的同时保持了糖肽的完整性㊂洗脱液为5%乙腈⁃1%甲酸溶液,可以浓缩冻干,与质谱有很好的兼容性,为后续完整糖肽的质谱鉴定提供了良好的基础㊂3.2 多重碎裂方式互补,全面解析完整糖肽3.2.1 完整糖肽在经典CID 模式下的碎裂 碰撞诱导解离(CID)是生物质谱中肽段序列分析最为常用的碎裂模式,肽段活化碰撞后主要产生b㊁y 系碎片离子而得以解析序列㊂但糖基化修饰的糖链结构分子量较大,在CID 的能量碰撞下,糖肽不能充分碎裂㊂以肽段序列SRNLTK 上连接Man5的糖肽为例,其在电喷雾离子源中双电荷离子为[M+2H]2+m /z 967.93㊂由于糖苷键稳定性比酰胺键弱,在CID 条件下优先断裂,而形成糖肽上逐一丢失单糖的二级碎裂图谱㊂改变CID 的碎裂能量,从10%至50%㊂当CID 能量为20%,糖肽母离子开始碎裂,其最强的子离子占母离子相对丰度的70%,当CID 能量为30%时,母离子全部碎裂(图4)㊂继续提高能量至35%,40%,45%和50%,其碎裂情况基本不变㊂因 图4 母离子为[M+2H]2+m /z 967.93糖肽的CID 碎裂二级质谱图(方块为N⁃乙酰葡萄糖胺,圆圈为甘露糖)Fig.4 MS /MS spectrum of glycopeptide by collision⁃induced dissociation (CID)fragmentation,the precursorion [M +2H]2+m /z 967.93(squares,N ⁃acetylhexose⁃amine,HexNAc;circles,Hexose,Hex)此,CID 的碎裂谱图上难以得到肽段序列的信息,不能全面阐明完整糖肽的结构㊂3.2.2 完整糖肽在HCD 模式下碎裂能量的优化 在HCD 碰撞模式下,累积后的母离子将被注入HCD碰撞池中与中性氮气分子碰撞,碎裂后经C⁃Trap 送入Orbitrap 检测㊂此处仍然采用肽段序列SRNLTK上连接Man5的糖肽,m /z 967.93为检测对象㊂依次提高HCD 的碰撞能量,在20%能量下,糖肽的碎裂基本与CID 30%能量碎裂时一致㊂当HCD 能量为25%时,糖肽的谱图如图5所示㊂在低分子量区域,产生系列糖的特征离子,如m /z 204(HexNAc+H)+,m /z 366(HexNAc+Hex+H)+,以及氧鎓离子m /z 204(HexNAc+H)+继续碎裂而产生的碎片离子,例如m /z 126,138,168和186等㊂由于HCD 模式下不存在离子阱质谱仪CID 模式下的低质量端1/3质量丢失,使得上述糖碎片离子得以检测㊂在中高分子量区域,HCD 谱图得到一系列的逐一丢失单糖的Y系列碎片离子,各离子有1电荷与双电荷两种状态,故形成两组m /z 不同的离子峰㊂其中Y1(肽段+HexNAc+H)+离子峰m /z 921.45强度高,因此Y1离子和糖碎片氧鎓离子是显著的糖肽离子特征峰㊂261 分析化学第42卷图5 母离子为[M+2H]2+m /z 967.93糖肽的HCD 碎裂二级质谱图(方块为N ⁃乙酰葡萄,圆圈为甘露糖)㊂插图显示低质量端糖碎片离子Fig.5 MS /MS spectrum of glycopeptide by high energy collisional dissociation (HCD)fragmentation,the precur⁃sor ion [M+2H]2+m /z 967.93(squares,N ⁃acetylhexoseamine,HexNAc;circles,Hexose,Hex).Insert viewshowed the fragment ions of glycans in the low mass region 由图6可见,不同的HCD 碰撞能量下,糖肽的特征离子相对丰度各有不同㊂随着HCD 能量的增加,糖的特征碎片离子信号不断升高,其中可以继续碎裂的m /z 204与366离子在能量大于25%时开始降低㊂同时,双电荷状态下的Y 系列离子主要在20%~25%的中高能量下信号较高,随着能量的进一步加强,双电荷离子完全碎裂㊂1电荷的Y 碎片离子系列,在HCD 能量25%时达到高峰,但并不随能量的提高而继续增强㊂故采用HCD 能量为25%,对糖肽进行碰撞解离,其二级谱图可以得到最为充分的信息㊂图6 不同HCD 碎裂能量下,糖肽二级谱图中碎片离子的相对丰度:(a)糖的特征离子;(b)双电荷的Y 系列离子;(c)1电荷的Y 系列离子Fig.6 Relative intensity of glycopeptides′fragment ions in different HCD energy (a)carbohydrate⁃specific ions;(b)a series of Y ions doublely⁃charged;(c)a series of Y ions singlely⁃charged3.2.3 完整糖肽在ETD 碎裂中肽段序列分析 ETD 碎裂方式是将电子从一个活泼的阴离子基团转移到带正电荷的肽段上,从而诱发肽段序列碎裂产生c ㊁z 离子㊂由于ETD 的软碎裂模式,翻译后修饰的基团常得以保留,因此有利于准确识别修饰位点㊂如图7所示,m /z 967.93的Man5糖肽在ETD 谱图中,产生肽段骨架结构的碎片离子,从C3~C5及Z4~Z6两组离子中,得到该糖肽的肽段序列为SRN⁃LTK㊂从C2~C3及Z3~Z4之间,有大范围的质量跳跃,可以清晰指示糖基化位点㊂综上所述,CID 主要产生糖苷键断裂的碎片,为糖链的结构组成分析提供了线索;HCD 在低分子量361第2期江静等:亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用 图7 母离子为[M+2H]2+m /z 967.93糖肽的ETD 碎裂二级质谱图Fig.7 MS /MS spectrum of glycopeptide by electron transfer dissociation (ETD)fragmentation,the precursor ion[M+2H]2+m /z 967.93区域提供了糖链的特征离子信息,并产生明确的糖肽Y1特征离子,同时也产生部分糖苷键断裂的碎片,为糖链结构信息提供参考;ETD 保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂,可以提供有效的肽段序列信息㊂因此,联合CID㊁HCD㊁ETD 等多种碎裂方式,即可得到糖链结构㊁糖基化位点和肽段序列等糖蛋白质结构的全面信息㊂4 结 论本研究从解析完整糖肽水平入手,用自制HILIC 亲水相互作用小柱富集纯化样品中的糖肽并保持其完整性,采用LTQ⁃Orbitrap 质谱检测,联合CID㊁HCD㊁ETD 等多种碎裂方式分析糖肽结构㊂因此,本方法在有效富集糖肽的同时,获取了肽段序列以及糖基化位点信息,并且能够得到位点特异的糖型结构,为糖蛋白结构的进一步解析提供了一种简单㊁有效的方法㊂虽然不同碎裂条件下所获得的糖肽谱图均比较复杂,且糖链结构解析缺乏有效的数据库,规模化糖肽数据的解析还比较困难,但随着计算机自动化软件的进一步发展,亲水作用色谱联合多重碎裂方式的串联质谱方法将在糖蛋白质结构解析中发挥更大的作用㊂致谢 感谢波士顿大学医学院Catherine E.Costello 教授在糖肽ETD 分析中提供的帮助与指导㊂References 1 Ohtsubo K,Marth J D.Cell ,2006,126(5):855-8672 LU Zhuang,WANG Shan,DAI Jing⁃Quan,WANG Jing⁃Lan,ZHANG Yang⁃Jun,YING Wan⁃Tao,XU You⁃Xuan,QIAN Xiao⁃Hong,WU Mou⁃Tian,CAi Yun.Chinese J.Anal.Chem.,2006,34(5):591-597卢庄,王杉,代景泉,王京兰,张养军,应万涛,徐友宣,钱小红,吴侔天,蔡耘.分析化学,2006,34(5):591-5973 Rakus J F,Mahal L K.Annu.Rev.Anal.Chem.,2011,4:367-3924 Doerr A.Nature Methods ,2011,9(1):36-365 Wada Y,Azadi P,Costello C E,Dell A,Dwek R A,Geyer H,Geyer R,Kakehi K,Karlsson N G,Kato K,Kawasaki N,Khoo K H,Kim S,Kondo A,Lattova E,Mechref Y,Miyoshi E,Nakamura K,Narimatsu H,Novotny M V,Packer N H,Perreault H,Peter⁃Katalinic J,Pohlentz G,Reinhold V N,Rudd P M,Suzuki A,Taniguchi N.Glycobiology ,2007,17(4):411-4226 Pasing Y,Sickmann A,Lewandrowski U.Biol.Chem.,2012,393(4):249-2587 Nakano M,Nakagawa T,Ito T,Kitada T,Hijioka T,Kasahara A,Tajiri M,Wada Y,Taniguchi N,Miyoshi E.Int.J.Cancer ,2008,122(10):2301-23098 Zielinska D F,Gnad F,Wisniewski J R,Mann M.Cell ,2010,141(5):897-907461 分析化学第42卷9 Palmisano G,Lendal S E,Engholm⁃Keller K,Leth⁃Larsen R,Parker B L,Larsen M R.Nat Protoc ,2010,5(12):1974-198210 Zhang H,Li X J,Martin D B,Aebersold R,Aebersold R.Nat Biotechnol.,2003,21(6):660-66611 Zauner G,Deelder A M,Wuhrer M.Electrophoresis ,2011,32(24):3456-346612 Wiesner J,Premsler T,Sickmann A.Proteomics ,2008,8(21):4466-448313 Shen Y,Tolic N,Xie F,Zhao R,Purvine S O,Schepmoes A A,Moore R J,Anderson G A,Smith R D.J.Proteome Res.,2011,10(9):3929-3943Characterization of Intact Glycopeptides by a Combination of Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography and Multiple Fragmentation Tandem Mass SpectrometryJIANG Jing 1,2,YING Wan⁃Tao *2,QIAN Xiao⁃Hong *21(Chinese PLA General Hospital ,Chinese People′s Liberation Army Postgraduate Medical School ,Beijing 100039,China )2(State Key Laboratory of Proteomics ,Beijing Proteome Research Center ,Beijing Institute of Radiation Medicine ,Beijing 102206,China )Abstract Glycosylation of proteins plays a significant role in physiological and pathological processes.The general strategy to characterize the glycoprotein is to release the glycans from proteins,and then analyze them separately.However,the traditional methods suffer from inherent limitations since the relationship between proteins and glycans is neglected.Here we developed an integrated approach for intact glycopeptides analysis.Glycopeptides were first enriched selectively by home⁃made hydrophilic interaction liquid chromatography (HILC)tips,and then analyzed by mass spectrometry.We applied multiple fragmentation methods including collision⁃induced dissociation (CID ),high energy collisional dissociation (HCD )and electron transfer dissociation (ETD)for comprehensive characterization of glycosylation.The results showed that the best ratio of sample vs material for glycopeptide enrichment was 1∶50;CID with 35%collision energy cleaves glycosidic bonds,which was useful for glycan composition identification;HCD with 25%collision energy provided low mass diagnostic ions specific to glycan fragmentation,and also the specific Y1fragment ion of glycopeptide;ETD cleaved peptide backbone,yielded peptide sequence and helps to assign glycosites.This work indicates that HILIC enrichment and multiple fragmentation techniques may be an effective way to characterize glycopeptides for the simultaneous elucidation of peptide sequence,glycosite and glycan structures.Keywords Hydrophilic interaction liquid chromatography;Tandem mass spectrometry;Intact glycopeptides;Collision⁃induced dissociation;High energy collisional dissociation;Electron transfer dissociation (Received 7June 2013;accepted 5August 2013)This work was supported by the National High Technology Research and Development Program of China (No.2012AA020203)561第2期江静等:亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用 。
婴配乳粉中2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖含量离子色谱法检测
第41卷2024 年 3 月应用化学CHINESE JOURNAL OF APPLIED CHEMISTRY第3期405⁃414婴配乳粉中2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N -新四糖含量离子色谱法检测詹胜群 葛城* 周荣杰 周钧（澳优乳业（中国）有限公司， 长沙 410200）摘要 研究了离子色谱法同时测定婴配乳粉中2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N -新四糖的含量及影响因素。
采用离子色谱柱分离，脉冲安培检测器检测和外标法定量分析等方法。
通过对不同净化方式、酶解处理和洗脱条件等过程进行考察和优化，比较确定色谱条件和前处理条件对分离的影响，并就线性范围进行探讨。
结果表明，优化后的方法线性关系良好， R 2＞0.999； 方法精密度好， 相对标准偏差（n =7）＜2.7%； 方法准确度好，2′-岩藻糖基乳糖回收率为95.97%~103.38%，乳糖-N -新四糖回收率为100.09%~104.01%。
该方法能对婴配乳粉中的2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N -新四糖同时测定， 操作简单， 具有良好的准确度和精密度， 可为婴配乳粉质量监控方法提供参考。
关键词 母乳低聚糖；离子色谱；2′-岩藻糖基乳糖；乳糖-N -新四糖；婴配乳粉中图分类号：O657.7 文献标识码：A 文章编号：1000-0518（2024）03-0405-10母乳低聚糖（HMOs ）是一种多功能聚糖，是人乳中的第三大成分［1］，其结构主要由5种基本单糖组成： 葡萄糖（Glucose ， Glc ）、半乳糖（Galactose ， Gal ）、N -乙酰葡糖氨（Nacetylglucosamine ， GlcNAc ）、岩藻糖（Fucose ， Fuc ）和N -乙酰神经氨酸（N -Acetylneuraminic acid ， NeuAc ），通常由半乳糖和葡萄糖与其它一种或多种单糖聚合形成多种结构［2］。
HMOs 对于婴幼儿的生长健康有着重要的意义，除了可预防感染、过敏以外，还能促进肠胃发育、增强自身免疫、预防糖尿病和心血管疾病［3-5］等。
碰撞诱导解离和高能碰撞解离方式在褐藻胶寡糖结构分析中的比较和应用
碰撞诱导解离和高能碰撞解离方式在褐藻胶寡糖结构分析中的比较和应用宋妮;张秀丽;王聪;吕志华;任素梅【摘要】利用组合式高分辨质谱仪(LTQ Orbitrap XL)对均一褐藻胶寡糖,包括甘露糖醛酸寡糖和古洛糖醛酸寡糖进行二级质谱分析,比较了常规的碰撞诱导解离(CID)和高能碰撞解离(HCD)在寡糖结构分析中的差异,并应用HCD技术分析甘露糖醛酸寡糖和古洛糖醛酸寡糖的结构差异.研究发现,HCD可避免CID中的1/3效应,而且可以提供更多的糖环断裂碎片信息,如2.55A2 (m/z 291)、2.44A(m/z 235、411)、2,5A脱水(m/z 101、277、453)以及Z2脱羧碎片(m/z 307、483、659)等,进一步验证了Z2脱羧碎片是区别甘露糖醛酸与古洛糖醛酸的特征碎片.同时,HCD能够提供丰富的裂解碎片信息,这为褐藻胶寡糖的结构解析提供了依据.%Alginate homooligosaccharides including oligomannuronate (M) and oligoguluronate (G) with degree of polymerization from 2 to 7 were analyzed by linear ion trapOrbitrap mass spectrometer (LTQ Orbitrap XL) using collision induced dissociation (CID) and high energy collision induced dissociation (HCD).First of all,comparison of CID MS/MS and HCD MS/MS of either M or G was conducted.Taking the trimannuronate (M3) as an example,CID MS/MS showed the m/z 369,193 and 175 ions were assigned to C2/Y2,C1/Y1 and B1/Z1,respectively,which were formed due to single glycosidic bond cleavage,while HCD MS/MS caused cleavage of all glycosidic bonds and showed weak A-type ions,such as 0,2A (m/z309,485),2,5A (m/z 291,467) and 0,4A3 ions (m/z 471).Interestingly,an internal M produced a Zint-CO2 ions at m/z 307,which was unique andfound only in HCD MS/MS.Furthermore,CID MS/MS and HCD MS/MS ofM3 and triguluronate (G3) were executed.For CID,M3 and G3 did not show significant difference,and they gave identical glycosidic bond cleavage ions C1 (m/z 193),B1 (m/z 175) together with the dehydrated and decarboxylated ions (m/z 157 and m/z 131).These results suggest that it is impossible to differentiate the two residues at a nonreducing terminal of M3 and G3 by CID.However,a significant difference was observed in HCD spectra for M3 and G3.It was found that besides decarboxylation fragment m/z 307,debris 2,4A3 (m/z 411),2,5A3 (m/z 467) and 0,4A3 (m/z 471)were found in M3,whereas these ions were not found in HCD MS/MS of G3,thus demonstrating that HCD MS/MS can be used to differentiate M3 and G3.In the CID MS/MS of pentamannuronate (M5),fragment ions 0,2A3 (m/z 837),0,4A3 (m/z 823) and 2,5A3(m/z 819) was foundapparently,however,HCD displayed rich fragment ions in the low mass region,which should be ascribed to the characteristics of high-energy dissociation of HCD.For heptamannuronate (M7) and heptaguluronate (G7),doubly charged protonated species were collected as parent ions for CID and HCD.HCD MS/MS provided more fragment ions than CIDMS/MS,especially,Zint-CO2 ion (m/z 307,483,659,835 and 1 011) signal was apparently showed in M7 HCD spectra.Taken together,this work demonstrates that HCD MS/MS provides rich product ions and has no low mass cut off.The fragment ions in HCD spectra have high mass accuracy and resolution.These characteristics of HCD spectra complement thepower of CID and allow easy spectrametric interpretation and high confidence in structural elucidation for alginate oligosaccharides.【期刊名称】《质谱学报》【年(卷),期】2017(038)005【总页数】8页(P551-558)【关键词】组合式高分辨质谱仪(LTQ Orbitrap XL);褐藻胶寡糖;碰撞诱导解离(CID);高能碰撞解离(HCD)【作者】宋妮;张秀丽;王聪;吕志华;任素梅【作者单位】中国海洋大学医药学院,海洋药物教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学医药学院,海洋药物教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学医药学院,海洋药物教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学医药学院,海洋药物教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学医药学院,海洋药物教育部重点实验室,山东青岛266003【正文语种】中文【中图分类】O657.63Abstract: Alginate homooligosaccharides including oligomannuronate (M) and oligoguluronate (G) with degree of polymerization from 2 to 7 were analyzed by linear ion trap-Orbitrap mass spectrometer (LTQ Orbitrap XL) using collision induced dissociation (CID) and high energy collision induced dissociation (HCD). First of all, comparison of CID MS/MS and HCD MS/MS of either M or G was conducted. Taking the trimannuronate(M3) as an example, CID MS/MS showed the m/z 369, 193 and 175 ions were assigned to C2/Y2, C1/Y1 and B1/Z1, respectively, which were formed due to single glycosidic bond cleavage, while HCD MS/MS caused cleavage of all glycosidic bonds and showed weak A-type ions, such as 0,2A (m/z 309, 485), 2,5A (m/z 291, 467) and 0,4A3 ions (m/z 471). Interestingly, an internal M produced a Zint-CO2 ions at m/z 307, which was unique and found only in HCD MS/MS. Furthermore, CID MS/MS and HCD MS/MS of M3 and triguluronate (G3) were executed. For CID, M3 and G3 did not show significant difference, and they gave identical glycosidic bond cleavage ions C1 (m/z 193), B1 (m/z 175) together with the dehydrated and decarboxylated ions (m/z 157 and m/z 131). These results suggest that it is impossible to differentiate the two residues at a nonreducing terminal of M3 and G3 by CID. However, a significant difference was observed in HCD spectra for M3 and G3. It was found that besides decarboxylation fragment m/z 307, debris 2,4A3 (m/z 411), 2,5A3 (m/z 467) and 0,4A3 (m/z 471) were found in M3, whereas these ions were not found in HCD MS/MS of G3, thus demonstrating that HCD MS/MS can be used to differentiate M3 and G3. In the CID MS/MS of pentamannuronate (M5), fragment ions 0,2A3 (m/z 837), 0,4A3 (m/z 823) and 2,5A3 (m/z 819) was found apparently, however, HCD displayed rich fragment ions in the low mass region, which should be ascribed to the characteristics of high-energy dissociation of HCD. For heptamannuronate (M7) and heptaguluronate (G7), doubly charged protonated species were collected as parent ions for CID and HCD. HCD MS/MS provided morefragment ions than CID MS/MS, especially, Zint-CO2 ion (m/z 307, 483, 659, 835 and 1 011) signal was apparently showed in M7 HCD spectra. Taken together, this work demonstrates that HCD MS/MS provides rich product ions and has no low mass cut off. The fragment ions in HCD spectra have high mass accuracy and resolution. These characteristics of HCD spectra complement the power of CID and allow easy spectrametric interpretation and high confidence in structural elucidation for alginate oligosaccharides.Key words： linear ion trap-Orbitrap mass spectrometer (LTQ Orbitrap XL); alginate homooligosaccharides; collision induced dissociation (CID); high energy collision induced dissociation (HCD)褐藻胶是一种直链的多糖类化合物，结构单元是β-(1→4)连接的D-甘露糖醛酸(M)和α-(1→4)连接的L-古洛糖醛酸(G)，其在人类疾病、植物生长和抑菌等方面具有生物活性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
10 0 -10 -20 -30 18 20
22 24 t （ min ）
26
28
30
图1 Fig． 1
酰胺基亲水相互作用色谱柱 30℃ 条件下所得透 Chromatograms of hyaluronic acid （ HA ） obtained on
明质酸分离谱图 amidehydrophilic interaction liquid chromatography（ HILIC） column
2． 2． 2
（ 250 mm×4． 6 mm， 5 μm，日本 COSMOSIL 公司） ； 酰胺基HILIC 色谱柱（ 250 mm×4． 6 mm， 5 μm， 北京 30 min 内流动相 B 从 90% 降到 35% 进行梯度洗脱； 两性 华谱新创公司） ， 柱温 30℃ ， 流速 0． 5 mL / min， HILIC 色 谱 柱 （ 100 mm × 2． 1 mm，5 μm， 离子 （ ZIC ） 德 国 Merck 公 司 ） ， 柱 温 30℃ /85℃ ， 流速 0． 3 mL / min， 25 min 内流动相 B 从 90% 降到 35% 进行梯度洗脱； 二醇基HILIC 色谱柱 （ 150 mm × 3 μm LUNA，加拿大 Phenonenex 公司 ） ， 25 min 内流动相 B 从 2． 0 mm， 柱温 30℃ ， 流速 0． 3 mL / min， 90% 降到 35% 进行梯度洗脱。 寡糖的质谱分 析 氮 气 用 作 雾 化 气， 雾 化 压 力 为 30 Pa。 喷 雾 电 压 为 3． 5 kV， 氮气流速为 8 L / min， 干燥过程中温度为 350℃ 。碎片电压为 100 V。 在 m / z 100 ～ 2000 的范围内进行全离子流扫 2． 2． 3 描。所有数据都在负离子模式下进行采集 ， 经 Mass Hunter 工作站下处理。
第 43 卷 2015 年 8 月
分析化学 （ FENXI HUAXUE）
研究报告
第8 期 1198 ～ 1202
DOI： 10． 11895 / j． issn． 02533820． 150228
Chinese Journal of Analytical Chemistry
亲水相互作用色谱 - 高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖
A 寡聚糖分 聚糖分离谱图（ B） 色谱柱 85℃ 条件下所得 HA 寡聚糖分离谱图（ C） 色谱柱 85℃ 条件下所得 CS离谱图 Fig． 2 HA / chondroitin sulfate A（ CSA） oligosaccharides obtained on the zwitterionic （ ZIC ） HILIC column． （ A ） Chromatogram of HA oligosaccharides obtained on ZICHILIC column at 30℃ ； （ B ） ZICHILIC column at 85℃ ； and （ C） ZICHILIC column at 85℃
2
2． 1
实验部分
仪器与试剂 Agilent 1260 Infinity 液相色谱仪串联四级杆 / 飞行时间（ Q / TOF ） 质谱（ 6540， 美国 Agilent 公司） 。醋 A（ CSA） 和 HA（ 美国 Sigma 公司） ； 乙腈（ 德国 Merck 公司） ； 软骨素 ABC 酶（ Chondroiti酸铵、 硫酸软骨素nase ABC， 北京艾德豪克国际技术有限公司） ； 低分子量肝素： 依诺肝素为美国药典标准品（ USP） 。
dp20 dp24
15.0 t (min)
17.5
20.02Biblioteka .525.025.5
5 -5 -15 -25 -35 2.5
C
dp2 dp4 dp6 dp8 dp10 dp12
A232 (mAU)
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0 t (min)
17.5
20.0
22.5
25.0
25.5
图2
HILIC 色谱柱所得 HA / 硫酸软骨素 A 寡聚糖分离谱图。（ A） 色谱柱 30℃ 条件下所得 HA 寡 两性离子-
2． 2 2． 2． 1
实验方法
CSA 寡糖 分别取 2． 0 mg HA 和 CSA 样品溶于 400 μL 酶解缓冲液 酶水解制备 HA 寡糖、 （ 10 mmol / L 磷酸盐缓冲液， pH 6． 8 ） ， A 样品配制成 5 mg / mL 溶液， 将 HA 和 CS分别加入软骨素酶 ABC 5 mU， 置于水浴箱中 37℃ 反应 4 h。酶解液高温灭活然后离心， 上清液备用。 HILIC） 流动相 A 为 5 mmol / L 醋酸铵溶液， 寡糖的高效液相亲水相互作用色谱分析 （ HPLC95% 乙腈溶液， HILIC 色谱柱 流动相 B 为 5 mmol / L 醋酸铵紫外检测器设置为 232 nm 在线检测。氨基-
3
3． 1
结果与讨论
HILIC 色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分析 氨基15］ HILIC 色谱柱已被用于糖胺聚糖二糖分析［15］， 在文献［ 中， 氨基但该法以高浓度不挥发性缓冲
因此无法与质谱联用， 而且对于寡糖的分离和分析并没有直接的报道 。 本实验使用氨 盐作为流动相， HILIC 色谱柱进行糖胺聚糖的寡糖分析 ， 基结果表明， 即使在高浓度醋酸铵缓冲盐的条件下， 寡聚糖仍 然无法被完全洗脱（ 谱图未显示） ， 而据经验 100 mmol / L 以上的挥发性盐已经对质谱检测造成了影响 。 造成这种现象可能是该氨基柱中树脂表面键合的 氨基基团与糖胺聚糖寡糖结合作用太强， 而挥发
与含有较少负电荷的 HA 的寡聚糖产生适当的相互作用， 并能够有效分离 HA 寡糖。 3． 3 两性离子（ ZIC） HILIC 色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分析 HILIC 色谱柱分别对 3 种糖胺聚糖类寡糖进行了分析。结果表明， HA 寡糖在聚合 本实验使用 ZIC度 2 ～ 28 的范围内达到较好分离， 如图 2A 所示， 其中质谱结果确认了它们的聚合度 （ 图谱未显示 ） 。 ZICHILIC 的两性离子基质使得 HA 寡聚糖达到了更高的分辨率。 然而 HA 的每一个寡糖都分裂成了 16 ， 17 ］ ， 两个峰， 这是由寡糖还原端产生的 α和 β构型共存导致的 （ 图 2A ） 。根据文献［ 增加柱温可以 减少或消除这种现象。因此， 本实验中将柱温升高到 85 "C ， 每个 HA 寡糖在常温下出现的双峰完全消
质素（ KS） 。糖胺聚糖类与蛋白质相互作用的特异性取决于糖胺聚糖种类 、 大小、 糖组成、 电荷密度和序 ［4 ， 5 ］ 2! 。相对于糖胺聚糖的其它结构特征 ， SO4 的数量 （ 电荷密度 ） 对于调节生物学功能来说具有更 列等
［9 ］ ! 。糖胺聚糖所含 SO2 。糖胺聚糖类寡糖经常 4 数目多少大体排序为 HP＞DS ≈ CS ≈ HS＞HA 被作为模型， 用于研究糖胺聚糖结构与活性的关系 。针对不同糖胺聚糖构效关系研究、 糖胺聚糖酶活力
0531 接受 20150321 收稿； 2015本文系国家自然科学基金（ No． 81473179 ） 资助 * Email： liujianfen888@ 163． com； z_zhang@ suda． edu． cn
第8 期
吴成玲等： 亲水相互作用色谱高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖
1199
3． 4
吴成玲
1
1
刘建芬
* 2
2
张真庆
* 1
（ 苏州大学药学院，苏州 215123 ）
（ 协和制药， 石家庄 050083 ）
摘
要
建立了亲水相互作用 液相色谱质谱联用分析糖胺聚糖类复杂样品的方法 。 在高分辨质谱联用条
件下， 流动相 5 mmol / L 醋酸铵缓冲溶液可有效使用 。在此基础上， 对不同的色谱柱进行了筛选 。 其中， 氨基 亲水相互作用色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分离效果不佳； 酰胺基亲水相互作用色谱柱仅适用于透明质酸寡 糖的分析， 可以有效分离聚合度 2 ～ 20 的透明质酸寡糖； 在较高温度下， 两性离子基质的亲水相互作用色谱柱 可以对聚合度 2 ～ 30 的透明质酸寡糖和聚合度 2 ～ 12 的硫酸软骨素寡糖有效分离； 而二醇基亲水相互作用色 谱柱对透明质酸（ 聚合度 2 ～ 30 ） 、 硫酸软骨素（ 聚合度 2 ～ 20 ） 以及肝素（ 聚合度 4 ～ 20 ） 都适用， 并呈现出较 好的分离效果。本研究比较了不同类型的亲水相互作用色谱结合高分辨质谱对不同聚合度 、 不同电荷密度的 糖胺聚糖寡糖的分离特点， 建立了相应的高效分离和分析方法 。本方法有较高的分辨率和质谱适用性 。 关键词 亲水相互作用色谱； 四极杆 / 时间飞行质谱； 糖胺聚糖； 寡糖
A232 （ mAU ）
30 20
dp2 dp4 dp6 dp8 dp10 dp12 dp14 dp18 dp20 dp16
性盐的离子强度太弱， 无法对寡糖进行洗脱， 因此 HPLCMS 。 不能进行 分析 3． 2 分离 HILIC 色 谱 柱 分 别 对 HA、 CSA 采用 酰 胺 基HA 寡聚糖能够得到很 和 HP 进行分析， 结果表明， 好的分离， 如图 1 所示。 根据相应质谱结果 （ 图谱 未显示） ， 色谱图中每个峰得到了准确的归属。 其 中 HA 寡聚糖在聚合度 2 ～ 20 的范围内能够得到 A 与 HP 很好的分离。然而在使用此色谱柱对 CS寡糖混合物进行分离时， 在合理的缓冲盐浓度范 围内无法有效洗脱寡糖 （ 谱图未显示 ） 。该色谱柱 能够 树脂表面的酰胺基团具有较弱的离子作用， HILIC 色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的 酰胺基-
IPＲP 方法有较好的分辨率， 而且所使用的挥发性离子对试剂可以用于质谱， 但是它们通常残留在离子 源和毛细管中， 从而降低了质谱的灵敏度和分辨率