硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法糖胺聚糖（GAGs）是一类重要的多糖物质，广泛存在于动物体内和外部环境中。
在动物细胞外基质中，GAGs是一种重要的结构组分，可以影响细胞的生长、分化、迁移和信号传导等过程。
因此，对GAGs 的检测和分析具有重要的生物学和医学意义。
本文将介绍几种常用的动物源细胞外基质中GAGs的检测方法。
1. 瑞士蓝染色法瑞士蓝染色法是一种常用的GAGs检测方法。
该方法基于GAGs与瑞士蓝染料的亲和性，通过染色反应将GAGs与瑞士蓝染料结合，从而实现GAGs的检测。
该方法简单、快速、经济，适用于大量样品的检测。
但是该方法对GAGs的种类和含量有一定的限制，不能精确地定量。
2. 光学显微镜法光学显微镜法是一种直接观察GAGs的检测方法。
该方法基于GAGs的特殊结构和染色性质，在显微镜下直接观察样品中的GAGs。
该方法简单易行，不需要特殊的设备和试剂，但是对样品的处理和观察有一定的要求，不能精确定量。
3. 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法是一种高灵敏度、高特异性的GAGs检测方法。
该方法基于特异性抗体与GAGs的结合反应，通过酶标记和底物反应产生荧光或发色反应，从而实现GAGs的定量检测。
该方法可以检测不同种类和含量的GAGs，具有高灵敏度和高特异性，适用于研究GAGs的生物学和医学功能。
4. 毛细管电泳法毛细管电泳法是一种高效分离和定量GAGs的方法。
该方法基于GAGs的电荷和分子大小差异，在毛细管中通过电场分离不同种类和含量的GAGs，并通过检测器定量检测。
该方法具有高效、高分辨率和高灵敏度，可以定量检测不同种类和含量的GAGs，适用于GAGs的定量和分析。
综上所述，瑞士蓝染色法、光学显微镜法、酶联免疫吸附法和毛细管电泳法是常用的动物源细胞外基质中GAGs的检测方法。
不同的方法具有不同的优缺点，选择适合的方法可以提高检测的精度和效率，促进GAGs的研究和应用。
保健功效及检测方法
一、多糖的检测方法〔1〕粗多糖的苯酚-硫酸分光光度测定法〔2〕葡聚糖的分光光度测定法〔3〕硫酸软骨素的分光光度测定法二、皂甘类化合物的检测方法〔1〕总皂苷的分光光度测定法〔2〕绞股蓝皂苷的分光度测定法三、黄酮与甘类化合物的检测方法〔1〕总黄酮的风光光度测定法〔2〕原花青素的分光光度测定法〔3〕原花青素的铁盐催化比色测定法四、酶、激素与源性物质的检测方法〔1〕超氧化物歧化酶的氮蓝四唑测定法〔2〕超氧化物歧化酶的连苯三酚自氧化测定法〔3〕氯化高铁血红素的分光光度测定法五、其他类化合物的检测方法〔1〕总蒽醌的分光光度测定法〔2〕几丁胺糖的脱乙酰度滴定法〔3〕总三萜的分光光度测定法六、第一章概论（第3页）表1-1常见的保健食品的成效成分〔标志性成分〕、保健功能与主要来源〔第73页〕第三章保健食品中成效成分的检测方法第一节多糖的检测方法一、粗多糖的苯酚一硫酸分光光度测定法1、方法提要多糖经乙醇沉淀别离后，去除其他可溶性糖与杂质的干扰，再与苯酚一硫酸作用成橙红色化合物，其呈色度与溶液中的糖的浓度成正比，在485nm波长下比色定量。
4、测定步骤（1）样品提取：称取混合均匀的固体样品1.0〜2.0g，置于100mL容量瓶中，加水80mL 左右，与沸水浴中加热1小时〔如保健食品添加的已是多糖提取物，那么加热15min〕，冷却至室温后补加水至刻度线〔V1〕，混匀后过滤，弃去初滤液，收集余下滤液供沉淀粗多糖。
在这里必须强调的是不少保健品添加了淀粉、糊精，一定要做相应的处理，否那么结果偏高。
添加淀粉的样品需加a-淀粉酶与糖化酶〔如葡萄糖昔酶〕处理。
添加糊精的样品需加糖化酶〔如葡萄糖昔酶〕处理。
处理的原那么是将这类非活性多糖的碳水化合物全部酶解成单糖或低聚糖，再用乙醇沉淀所需的活性多糖以达到别离的目的。
1）添加淀粉或淀粉+糊精的样品：可取50mL样品提取液置于100mL具塞锥形瓶中，冷却至60℃以下，加1mL10%淀粉酶液〔Singma公司的液状淀粉酶可直接加0.1〜0.2mL〕和0.5mL0.2M磷酸盐缓冲液，加塞，至55℃〜60℃酶解1小时，再加适量的糖化酶〔如葡萄糖昔酶〕〔约为样液体积的1%〕于60℃以下再水解60min后取出〔用电业检验是否水解完全，如不完全可延长水解时间至酶解液加碘液不变蓝色为止〕，于电炉上小心加热至沸〔灭酶〕，冷却，定容，过滤，取滤液沉淀粗多糖。
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法糖胺聚糖（GAGs）是一类多糖物质，广泛存在于动物组织的细胞外基质中。
它们在维持细胞外基质结构和功能、参与细胞信号传导、细胞增殖和分化等生物学过程中起着重要作用。
在许多疾病中，GAGs 的合成、代谢和降解出现异常，因此对GAGs的检测具有重要的临床和生物学意义。
本文将介绍动物源细胞外基质中GAGs物质的检测方法。
1. 琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法是一种常用的GAGs分离和定量方法。
该方法基于GAGs的不同电荷密度和分子大小，在琼脂糖凝胶中进行电泳分离。
首先将细胞外基质样品经过酸水解或酶解处理，将GAGs水解成单糖和糖酸，然后通过琼脂糖凝胶电泳将其分离。
根据GAGs在琼脂糖凝胶中的迁移距离和标准品的比较，可定量测定样品中GAGs的含量。
该方法简单易行，但需要对样品进行水解处理，同时对不同类型的GAGs分离效果有所不同。
2. 高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种高分辨率、高灵敏度的分离和定量方法。
该方法基于GAGs的不同结构和化学性质，在反相或离子交换柱上进行分离。
首先将细胞外基质样品经过酸水解或酶解处理，然后通过HPLC将其分离，根据峰面积或峰高度定量测定样品中GAGs的含量。
该方法分离效果好，灵敏度高，但需要对样品进行水解处理，同时需要使用昂贵的仪器和试剂。
3. 酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种高灵敏度、高特异性的GAGs 检测方法。
该方法基于GAGs与特定抗体的结合，在酶标板上进行检测。
首先将细胞外基质样品或GAGs标准品加入到抗体涂层的酶标板中，然后加入特定的检测抗体，再加入酶标记的二抗，最后通过底物反应检测信号。
根据标准品的反应曲线和样品的光密度值，可定量测定样品中GAGs的含量。
该方法灵敏度高，特异性好，但需要使用昂贵的试剂和仪器。
4. 质谱法质谱法是一种高分辨率、高灵敏度的GAGs检测方法。
该方法基于GAGs的质量和分子结构，在质谱仪上进行分析。
多糖含量测定的方法综述
多糖含量测定的方法综述多糖是生命体中常见的一类生物大分子，包括淀粉、糖原、纤维素、半乳糖等。
多糖的含量测定是生物学、医学、食品科学等研究领域中基础而重要的实验技术，已经形成了成熟的测定方法体系。
本文将综述多糖含量测定的方法，包括光度法、比旋光度法、甘氨酰胺检测法、酚硫酸法、酸水解法、Kjeldahl法等。
一、光度法光度法是多糖含量快速测定方法之一，它基于不同种类的多糖对于不同波长光的吸收度的不同。
目前多数测定方法都采用酚-硫酸法，它是一种标准化测定方法。
该方法基于多糖与酚和浓硫酸反应，生成紫色物质，该紫色物质在450nm处有最大吸收。
该方法测定范围广泛，适用于淀粉、糖原、低聚糖等多糖的快速测定。
但该方法需要有高浓度的硫酸，操作过程中有安全隐患，同时准确测定也需要考虑到可能存在的干扰物。
比旋光度法是一种在多糖含量测定领域中常用的测量技术。
该技术旨在通过测定糖溶液旋光度来测定其中的多糖含量。
比旋光度法测得的含量可以较为准确地反映样品中的多糖含量。
该方法广泛应用于果蔬、谷物、草药、保健食品等多种食品、药材的多糖含量快速测定。
但该方法需要使用较为昂贵的比旋仪，同时操作门槛较高，需要具备专业操作技能。
三、甘氨酰胺检测法甘氨酰胺检测法是一种新近开发的多糖含量测定方法，该方法还可以用于多糖含量的快速筛查。
该方法通过加入一种叫做8-羟基喹啉的酶标物质，使多糖和甘氨酰胺通过酶反应形成发光信号。
该方法测定时间极短，仅需几分钟钟便可出结果，同时也具有较高的准确性，目前已经在多糖含量测定领域中得到广泛应用。
四、酚硫酸法五、酸水解法酸水解法是通过在酸性介质的条件下将多糖分解成糖分子来测定其中多糖含量的方法。
该方法需要将样品加入酸性介质（通常是1M或2M的硫酸或盐酸），经过一定时间的加热水解后，将水解后的糖分离出来，通常通过糖谱法、高效液相色谱等方法来分析其中的单糖成分，从而得到多糖含量。
在样品加入酸性介质以前，其它组分（如蛋白质、脂肪等）需先去除，否则将干扰多糖水解产物的分析。
多糖含量测定的方法综述
多糖含量测定的方法综述多糖是一类广泛存在于动植物组织、细胞膜和微生物中的生物大分子，包括淀粉、纤维素、壳多糖、低聚糖等。
多糖在食品工业、医药工业、生物学研究等领域中有着广泛的应用。
因此，准确测定多糖含量是非常重要的。
目前，多糖含量测定的方法较多，本文将就其中常用的几种方法进行综述。
一、显色法显色法是测定多糖含量的一种简单、快速、经济的方法，可用于多种类型的多糖测定，包括淀粉、纤维素和壳多糖。
目前较为常用的显色法有三种：碘溶液显色法、酚硫酸显色法和亚硫酸还原显色法。
1.碘溶液显色法碘溶液显色法是测定淀粉和其他含碘能力的多糖的一种显色方法。
将待测物溶解于适当的溶液后加入碘溶液，多糖与碘发生空间结合，形成蓝黑色的复合物，比较准确地测定多糖含量。
测定过程：将待测样品溶解于适量的溶液中，加入适量的碘液，快速均匀搅拌，停留一段时间后读取吸光度。
测定时要注意，碘液应无色，且溶液的pH应在中性范围内，若PH超过范围会影响显色结果。
2.酚硫酸显色法酚硫酸显色法是测定纤维素含量的一种经典方法。
此法中，棕红色的多糖酚硫酸复合物会与多糖发生结合，从而产生蓝色的复合物。
本方法操作简单，准确性高，但对硫酸和酚的用量要求较高。
测定过程：取一定量的待测样品加入酚硫酸溶液，并适当加热。
混合搅拌直至均匀，并冷却。
最后度光密度，多糖含量与光密度成正比。
亚硫酸还原显色法在测定多糖含量时具有灵敏度和准确性。
此法中，亚硫酸会还原多糖羟基上的羟基，从而产生醛基，醛基与邻近的氨基酸或蛋白质结合，形成紫色复合物。
测定过程：将待测样品适当溶于适量的溶液中，加入亚硫酸溶液，并充分混合，之后再加入苯胺溶液混合反应，最后测定吸光度，获得样品中多糖的含量。
二、光化学检测法光化学检测法是一种新的多糖含量测定方法，在光学和化学技术的基础上，通过样品与化学反应后的荧光强度进行多糖含量测定。
光化学检测法可用于测定淀粉、葡聚糖、甘露聚糖等糖类物质的含量。
测定过程：将待测样品加入适当的试剂中进行混合均匀，之后将其迅速放入反应器中，启动荧光检测仪测定荧光强度。
分光光度法测定肥料中壳聚糖的含量
分光光度法测定肥料中壳聚糖的含量1 方法原理肥料中壳聚糖经水解后生成氨基葡萄糖，与乙酰丙酮和对二甲基苯甲醛生成红色化合物，在525nm波长处用分光光度计测定。
2 试剂与材料盐酸溶液：1+1氢氧化钠溶液：200g/L碳酸钠溶液：c（1/2Na2CO3）=0.5mol/L乙酰丙酮溶液：取乙酸丙酮2.0ml，加入碳酸钠溶液至50ml，置冰箱中备用，应于使用前一日配置。
盐酸氨基葡萄糖标准溶液：ρ（盐酸氨基葡萄糖）=0.100mg /ml。
称取105℃干燥至恒重的盐酸氨基葡萄糖0.5g（准确至0.0002g），置500ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，移取10.00nl，至100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀。
无醛乙醇对二甲基苯甲醛溶液：称取对二甲基苯甲醛0.8g，加无醛乙醇15ml及盐酸溶液15ml，摇匀。
3 仪器设备一般实验室仪器和设备分析天平分光光度计4 分析步骤4.1 试验溶液的制备称取试样1g（准确至0.0002g）于100ml容量瓶中，加入5ml盐酸溶液，加塞，摇匀，于100℃水解6h，冷却，用氢氧化钠溶液中和至中性，用水稀释至刻度，摇匀，备用4.2 求标准曲线方程式（绘制标准曲线）移取盐酸氨基葡萄糖标准溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml分别置于具塞试管中，用水稀释至5.00ml，各加入乙酰丙酮溶液1.00ml，摇匀，于100℃水浴中（1min后加盖）静置25min，取出，用冰水迅速冷却后，加入无醛乙醇3.00ml，于60℃水浴中静置10min后，再加入对二氨基苯甲醛溶液1.00ml，用力振摇后，由60℃水浴中静置1h，取出立即用冷水冷却至室温。
在波长525nm处，用1cm比色皿，以试剂空白为参比液，测其吸光值。
根据测得的数据求关于吸光值和氨基酸葡萄糖质量的标准曲线方程式（绘制标准曲线）。
4.3 试样的测定移取试验溶液（4.1）1.00ml置于具塞试管中，按4.2中“用水稀释至5.00ml”，及其后面的步骤进行。
糖胺聚糖的分析测定方法
糖胺聚糖的分析测定方法刘义;钱和【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2005(24)5【摘要】糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)又名粘多糖(Mueopolysaeehride)、酸性粘多糖(Acid／Acidic Mucopolysaccharide)、硫酸粘多糖(Sulphuric Mucopolysaccharide)、硫酸酯多糖(Sulphate Polysaccharide)、结缔组织多糖(Connective Tissue Polysaccharide)等，它在许多生物学、生理学和病理学过程中起着重要作用，已引起世界医药界的广泛关注，人们已经在利用外源性糖胺聚糖的生物活性研制有效药物防治某些疾病方面取得了很大进展。
糖胺聚糖的功能与其结构密切相关，关于多糖结构和功能关系的研究已经成为生命科学最前沿的领域之一，许多先进的仪器分析方法和生物技术已被应用到多糖的结构分析中。
【总页数】4页(P46-49)【作者】刘义;钱和【作者单位】江南大学食品学院,国家教育部功能食品工程研究中心,江苏,无锡,214036;江南大学食品学院,国家教育部功能食品工程研究中心,江苏,无锡,214036【正文语种】中文【中图分类】Q538【相关文献】1.糖胺聚糖分子质量测定方法综述 [J], 臧恒昌;董芹;王凤山;刘爱华2.近红外光谱分析技术用于糖胺聚糖分析的展望 [J], 臧恒昌;孙春晓3.硫酸软骨素药效成分糖胺聚糖含量分析研究 [J], 薛洪宝;梁丽丽;常华兰;田天;顾文杰;刘志祥;宫文武4.合浦珠母贝糖胺聚糖泡腾片制备工艺优化及其质量分析 [J], 张磊;王锦旭;杨贤庆;魏涯;杨少玲5.合浦珠母贝糖胺聚糖泡腾片制备工艺优化及其质量分析 [J], 张磊; 王锦旭; 杨贤庆; 魏涯; 杨少玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法动物源细胞外基质（ECM）是组成组织和器官的关键成分之一，它包含多种生物大分子，如蛋白质、多糖和糖蛋白。
其中，糖胺聚糖是一类重要的多糖物质，它们在细胞外基质中发挥着重要的生物学功能。
本文将介绍几种常见的检测糖胺聚糖物质的方法。
一、显微镜观察显微镜观察是最常用的糖胺聚糖物质检测方法之一、通过染色或荧光标记等方式，可以直接观察细胞外基质中的糖胺聚糖分子。
目前，常用的染色方法有甲苯胺蓝（toluidine blue）染色和伊红（Safranin O）染色等。
这些染料可与糖胺聚糖分子结合，形成特定的颜色，从而能够在显微镜下直接观察到。
二、糖胺聚糖定量分析检测1.二氧化硫比色法(SO2-4比色法)二氧化硫比色法是一种常用的糖胺聚糖定量分析方法。
该方法是基于糖胺聚糖的特性，与孟骥反应，生成带有特征吸收峰的染料。
该染料的吸光度与糖胺聚糖的含量成正比，可以通过分光光度计测定吸光度，并用标准曲线法计算待测样品中糖胺聚糖的浓度。
2.硫酸铜比色法硫酸铜比色法是一种常用的糖胺聚糖含量测定方法。
该方法是通过硫酸铜与糖胺聚糖发生反应，生成浅蓝色络合物，并通过测定紫外光谱吸收峰的变化来定量糖胺聚糖的含量。
该方法简单易行，对样品的要求较低，适用于不同类型的糖胺聚糖物质。
三、免疫检测免疫检测是一种常用的糖胺聚糖检测方法，基于糖胺聚糖与特异性抗体的结合反应。
通过使用特异性的抗体，可以将糖胺聚糖物质从样品中分离出来，并形成可观察的免疫复合物。
常用的免疫检测方法有免疫组化染色和酶联免疫吸附测定法（ELISA）等。
免疫组化染色方法：在这种方法中，使用特异性的抗体和二抗，将糖胺聚糖与荧光标记或酶标记的二抗结合，然后通过显微镜观察并分析成像结果。
这种方法可以提供对糖胺聚糖分子在细胞外基质中的定位和表达水平的信息。
ELISA方法：这是一种高效的糖胺聚糖定量方法。
通过将样品中的糖胺聚糖与特异性的抗体结合，形成抗原-抗体复合物，然后使用酶标记的二抗来检测这些复合物。
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第22卷,第6期光 谱 实 验 室V o l .22,N o .62005年11月Ch inese J ou rna l of S p ectroscopy L abora tory N ovem ber ,2005硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法①联系人,手机:013093031549;E 2m ail :xlberry @sohu .com作者简介:熊双丽(1977—),女,四川省眉山市人,在读博士研究生,从事碳水化合物与生物技术的研究。
收稿日期:2005205225熊双丽① 金征宇(江南大学食品科学技术学院 江苏省无锡市江南大学食品学院糖油楼210 214036)摘 要 利用硫酸化糖胺聚糖和阿利新蓝在酸性环境下形成可溶复合物直接比色测定硫酸化糖胺聚糖。
配制1.1m g mL 酸性染料于15%磷酸22%硫酸溶液中,取一定量糖胺聚糖与之混合,在490nm 处比色测定。
该法简单、快速,重复性好,勿须加热、长时间平衡和高级设备,不受非硫酸化糖胺聚糖如透明质酸和其他大分子阴离子如DNA 等物质的影响,也不受其他小分子阴离子和单糖的影响,该法可用于体液糖胺聚糖和商品化透明质酸质量的监测。
关键词 硫酸化糖胺聚糖,阿利新蓝,分光光度法。
中图分类号:O 657.32 文献标识码:B 文章编号:100428138(2005)06212942041 前言糖胺聚糖为具有抗血栓、抗病毒、治疗关节炎等多种生物活性,其产品用途广泛,涉及药品、食品、化妆品等,对其含量测定和成分鉴定一般采用己糖醛酸、氨基己糖监测,或者总糖胺聚糖与染料(如阿利新蓝、二甲基甲基蓝)形成不溶或者可溶复合物进行比色测定。
阿利新蓝是中心具有铜原子憎水体系的四价阳离子性染料[1],本文利用强酸性条件下阿利新蓝只与硫酸化糖胺聚糖相互作用的机理,建立了硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法,是一种快速、简便、准确的分析检测方法。
2 实验部分2.1 仪器与试剂TU 21900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。
阿利新蓝8GX (北京莱博生物材料有限公司);硫酸软骨素C ,透明质酸(美国Sigm a 公司);肝素;牛血清蛋白,生化纯;硫酸、磷酸、硫酸钾、半胱氨酸、氯化钠、乙酸钠等均为分析纯。
实验用水均为去离子水。
染液配制:1.1m g mL 酸性染料溶液——110m g 阿利新蓝8GX 溶于15%磷酸22%硫酸中,定容至100mL ;硫酸软骨素钠、透明质酸钠和肝素钠标准溶液:1m g mL 水溶液。
3 结果与讨论3.1 吸收波长的确定空白管加水0.l mL ;实验管分别取硫酸软骨素(ChS )0、20、40、60ΛL 、透明质酸(HA )和肝素(H ep )100ΛL (1m g mL ),加水至0.1mL ,再加阿利新蓝染液1.5mL ,于400—800nm 可见光区扫描如图1,结果显示阿利新蓝染料溶液空白和透明质酸2阿利新蓝复合物的最低吸收波长皆为490nm ,两者光谱曲线一样,证明透明质酸在此条件下不与阿利新蓝染料溶液作用,而硫酸软骨素2阿利新蓝复合物、肝素2阿利新蓝复合物最低吸收波长改变,移至500nm 处附近,为了消除500nm 处染液空白的吸收,选择490nm 进行硫酸化糖胺聚糖含量的测定。
3.2 硫酸化糖胺聚糖的测定分别取硫酸软骨素、透明质酸和肝素0、10、20、40、60ΛL ,加水至0.1mL ,再加阿利新蓝染液1.5mL ,于490nm 比色。
结果如图2,硫酸软骨素和肝素在强酸性条件下与阿利新蓝形成可溶性复合物,其颜色随浓度的升高而加深,在0—80Λg 范围内呈线性关系,但是,糖胺聚糖主链由各种糖醛酸和各种氨基半乳糖组成,因具体糖胺聚糖总类不同,糖主链和取代基(硫酸基和羧基等)结构不同,曲线稍微有差异。
透明质酸在强酸性条件下,不与阿利新蓝形成可溶性复合物[2]。
3.3 阿利新蓝复合物稳定性和重复性探讨从图3可以清晰看出5m in 内阿利新蓝2糖胺聚糖复合物形成完全,5—140m in 范围内稳定,以后吸光度缓慢增加,所以时间对测定的结果基本没有影响,实验结果表明该测定方法重现性好。
3.4 其他物质的影响分别测定硫酸钾、半胱胺酸、氯化钠、牛血清蛋白、葡萄糖、半乳糖、N 2乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等对硫酸化糖胺聚糖的影响,结果如表1,结果显示酸性条件下,葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、牛血清蛋白、半胱氨酸、N 2乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖等单糖对测定无影响,ED TA 、乙酸钠等阴离子对测定也无影响,氯离子和硫酸根离子在低浓度时,无影响,含量过高时会轻度干扰可溶性复合物的稳定性,引起吸收值的减小。
表1 阿利新蓝与其他物质相互作用样品名OD 490①氯化钾(50Λmo l )0.000氯化钾(200Λmo l )0.000氯化钾(50Λmo l )0.000氯化钠(200Λmo l )0.001±0.001乙酸钠(200Λmo l )0.000硫酸钾(50Λmo l )0.000硫酸钾(100Λmo l )0.000ED TA (50Λmo l )0.000葡萄糖(50Λmo l )0.000葡萄糖醛酸(50Λmo l )0.000半乳糖醛酸(50Λmo l )0.000N 2乙酰氨基葡萄糖(50Λmo l )0.000牛血清蛋白(100Λg )0.000半胱氨酸(50Λmo l )0.000 ①490nm处的吸光度图3 阿利新蓝及阿利新蓝2糖胺聚糖 复合物的稳定性观察5921第6期熊双丽等:硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法3.5 体液的检测为探讨该方法是否适合于生物体液糖胺聚糖测定,取正常人尿液和正常大鼠血清,加入0,10, 20,30Λg纯的硫酸软骨素,计算回收率,如表2。
表2 体液中糖胺聚糖回收率测定硫酸软骨素添加量(Λg)50ΛL尿中糖胺聚糖含量(Λg)回收率(%)20ΛL血清中糖胺聚糖含量(Λg)回收率(%)05.25±0.33-3.07±0.21-1013.98±0.4287.8711.28±0.2382.102025.36±0.75100.5520.29±0.5186.113032.37±0.9890.4032.98±0.5999.70 从表中看出,尿液和血清中硫酸软骨素回收率分别为87.87%—100.55%和82.10%—99.7%,血清值差异比尿液大,这可能是因为血清中有大量糖蛋白等物质存在,在强酸性条件下,一些血清蛋白质带上正电荷,与硫酸软骨素相互作用,减少硫酸软骨素与阿利新蓝染料结合的几率,干扰测定,而尿液相应物质少,所以干扰少。
因为一般正常尿液中糖胺聚糖主要以硫酸软骨素形式存在,本文以硫酸软骨素C为标准,测定尿液中硫酸软骨素含量为0.101m g mL。
3.6 讨论阿利新蓝结构为中心具有铜原子平面四面体憎水体系的四价阳离子性染料,所以呈蓝色,不同于其他单价阳离子染料,允许它在不同的pH环境下能够与糖胺聚糖类阴离子聚合物相互作用。
糖胺聚糖主链由各种糖醛酸和各种氨基半乳糖组成,因具体糖胺聚糖总类不同,糖主链(糖醛酸、氨基半乳糖)和取代基(硫酸基、羧基等)结构不同,典型的硫酸化糖胺聚糖硫酸软骨素含有羧基和硫酸基,硫酸软骨素类硫酸化多糖双糖分子上硫酸酯基团和羧基在水中存在离解平衡。
在强酸性条件下只有硫酸基带负电荷,首先与阿利新蓝发生静电作用形成可溶性复合物,在一定范围内随浓度升高颜色变深而符合郎伯比耳定律,透明质酸分子中没有硫酸基,在此条件下不与阿利新蓝形成可溶性复合物。
所以本文根据强酸性条件下,阿利新蓝只与硫酸化糖胺聚糖相互作用的机理,建立了硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法,是一种快速、简便、准确的分析检测方法。
不受非硫酸化糖胺聚糖如透明质酸和其他大分子阴离子如DNA等物质的影响,也不受其他小分子阴离子和单糖的影响。
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