应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析
土壤学中的土壤微生物群落分析方法
土壤学中的土壤微生物群落分析方法土壤生态系统是一种充满生机的生物体系，其中土壤微生物群落是其中最丰富和重要的组成部分之一。
土壤微生物在土壤生态系统中起着重要的作用，包括有机质分解、氮循环、生物固氮以及供给植物生长所需的营养元素等。
因此，对土壤微生物群落进行准确分析有助于了解土壤生态系统的健康和状况，为环境保护和农业生产提供有价值的参考依据。
本文将介绍土壤学中常用的土壤微生物群落分析方法。
一、DNA测序技术近年来，随着高通量测序技术的不断发展和成熟，DNA测序技术已成为研究土壤微生物群落多样性的主要手段。
目前常用的DNA测序技术包括Sanger测序、454测序、Illumina测序和PacBio测序等。
这些技术的主要区别在于读长、测序准确度、数据处理复杂度和成本等方面。
其中，Illumina测序技术是应用最广泛的测序技术之一。
该技术具有高通量、高准确度和低成本等优势，能够产生数百万到数十亿个序列，适用于研究微生物群落组成、特定功能基因的分布和微生物群落的分子进化等。
但该技术也存在一些限制，如读长短、测序偏差和寡核苷酸错误等，需要进行数据过滤和样本对比等后续分析。
二、FISH技术FISH（Fluorescence In Situ Hybridzation）是一种在原位的方法，能够直接观测微生物群落中细菌的存在和数量。
该技术使用DNA探针标记靶细胞的核酸序列，配合荧光探针进行检测和成像，可以定量测量目标细菌在样品中的丰度和空间分布。
FISH技术的优势在于高分辨率的成像和定量准确性，能够提示具体的微生物存在形态，如球形、杆状等。
三、PCR-DGGE技术PCR-DGGE（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）技术依赖PCR扩增样品中的16S rRNA基因，然后将PCR产物在含有变性剂的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，通过电泳道中的变性梯度来分离不同的微生物群落。
PCRDGGE技术解析生物制氢反应器微生物多样性
PCR -DGGE 技术解析生物制氢反应器微生物多样性邢德峰，任南琪!，宫曼丽（哈尔滨工业大学市政环境工程学院，哈尔滨150090）摘要：为了揭示发酵法生物制氢反应器厌氧活性污泥的微生物种群多样性，从运行不同时期取厌氧活性污泥，通过细胞裂解直接提取活性污泥的基因组DNA.以细菌16Sr RNA 基因通用引物F 338GC ／R534进行V 3高变异区域PCR 扩增，长约200b p 的PCR 产物经变性梯度凝胶电泳（DGGE ）分离后，获得微生物群落的特征DNA 指纹图谱.研究表明，不同时期的厌氧活性污泥中存在共同种属和各自的特异种属，群落结构和优势种群数量具有时序动态性，微生物多样性呈现出协同变化的特征.微生物多样性由强化到减弱，群落结构之间的相似性逐渐升高，演替速度由快速到缓慢.优势种群经历了动态演替过程，最终形成特定种群构成的顶级群落.关键词：变性梯度凝胶电泳；生物制氢；16Sr RNA ；微生物多样性中图分类号：X 172文献标识码：A文章编号：0250-3301（2005）02-0172-05收稿日期：2004-05-11；修订日期：2004-07-04基金项目：国家高技术研究发展计划（863）项目（2003AA 515030）；国家重点基础研究发展规划（973计划）项目（G 2000026402）；国家杰出青年科学基金项目（50125823）；黑龙江省自然基金项目（G Z03C 314）作者简介：邢德峰（1977!），男，博士研究生，主要从事环境生物技术，微生物分子生态学和废水生物处理等领域的研究.!通讯联系人A pp lication of PCR -DGGE t o Reso lve m icrobial D iversit y i n b io -H y dro g en Pro-duci n g React orX I NG D e-f en g ，REN N an-C i ，GONG M an-li（S choo l o f M un ici p al and Environ m ental En g i neeri n g ，~arb i n I nstitute o f T echno lo gy ，~arb i n 150090，Ch i na ）Abstract ：T o reveal m icrob ial d ivers it y o f anaerob ic activated s lud g e i n b io -h y dro g en p roduci n g reactor ，s lud g e i n d iff erent p eriod w ere sa m p led and t he ir g enom ic DNA o f m icrob ial comm un it y w as extracted d irectl y .A fter p urification o f t he g enom ic DNA us i n g DNAg e l recover y kit ，t he 16Sr RNA g enes （V 3re g ion ）w ere a m p lified b y us i n g t he un iversal p ri m ers （F 338GC and R534）.T he result o f a g arose g e l （2%）e lectro p hores is showt hat t he PCR p roducts w ere about 200b p .T hese a m p lified DNAfra g m ents w ere se p arated b y denaturi n g g rad ient g e l e lectro p hores is （DGGE ）w it h t he denaturant （urea and f or m a m i de ）from30%to 60%.T he p ro file o f DGGEshow t hat d iff erent s lud g e had t he d iff erent bands ’p atterns.I n t he p ro files o f DGGE ，t here ex ist som e comm on bands i n all s lud g e sa m p les ，wh ich i nd icate t hat som e ki nds o f microor g an is m s ex ist i n each p eriod.O n t he o t her hand ，t he s p ecific bands i n som e s lud g e show t hat d iff erent p eriod had t he ir ow n s p ecific m icroor g an is m s.D y na m ics o f comm un it y structure and a m ount o f dom i nant p o p ula-tions w ere res p ons i b le to d iff erent p eriod.S h ift o f m icrob ial d ivers it y corres p ond to p eriod o f runn i n g reactor ，m icrob ial d ivers it y i n-creased bef ore it decreased.S i m ilarit y bet w een comm un ities g raduall y i ncreased ，s p eed o f sh ift g raduall y decreased i n success ion.F i-nall y ，m icrob ial cli m ax comm un it y m ade u p o f s p ecific p o p ulations w as f or m ed.K e y words ：denaturi n g g rad ient g e l e lectro p hores is （DGGE ）；b io -h y dro g en p roduction ；16Sri bosom al RNA ；m icrob ial d ivers it y发酵法生物制氢技术是实现生物制氢工业化生产最有前景的研究方向，由于采用的是厌氧活性污泥为菌种，因此，其反应器的运行状态和产氢效能直接取决于反应系统的微生物群落［1］.活性污泥微生物种类极其丰富，优势种群及其微生物多样性在活性污泥生态系统中发挥着重要的作用.目前在环境科学和污染防治研究领域，关于活性污泥中微生物多样性的研究越来越受到重视；而传统的纯培养分离技术研究活性污泥微生物多样性有很大的缺陷，不能获得未被培养的微生物的信息，只能分离出占活性污泥总数0.1%!1%的微生物种类［2］.而分子生物学技术如PCR -DGGE ［3］，PCR -SSCP ［4］和T -RFLP ［5］能够在分子水平上对活性污泥微生物多样性进行快速和精确的分子诊断，并可以监测未被培养的微生物种类.变性梯度凝胶电泳（DGGE ）是目前研究微生物遗传多样性和种群动态性最有力的分子生物学技术.1993年M u y Zer ［6］首次将该技术应用于微生物生态的研究.在近10年的时间里已被广泛应用于各种环境微生物生态的研究，如高温热泉［7］、湖泊［8］、海洋［9］、土壤［10］、沙丘［11］根际［12］、活性污泥［13］和生物膜［14］等.变性梯度凝胶电泳（DGGE ）主要原理是基于在含有线形浓度递增的变性剂（尿素和甲酰胺的混合物）的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，部分解链的双链DNA 分子的电泳迁移率降低；而序列不同的第26卷第2期2005年3月环境科学ENV I RONM ENTAL SC I ENCEV o l .26，N o.2M ar .，"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""2005DNA分子有着不同的解链行为，它们在凝胶的不同位置停止迁移，从而使长度相同而序列不同的DNA 片段分离［15］.由于各类微生物（如细菌和古细菌）的16S r RNA基因序列中可变区的碱基顺序有很大的差异，所以活性污泥中不同微生物的16S r RNA基因的V3区的扩增DNA片断在DGGE中能够得到分离，根据电泳条带的多寡和条带的位置可以辨别出样品中微生物的种类多少，分析活性污泥中微生物的多样性.本文从生物制氢反应器中获取厌氧活性污泥，然后直接提取出活性污泥混合菌群的基因组DNA，以PCR扩增16S r RNA基因V3区域，用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术进行分离和鉴定PCR扩增产物，从而得出生物制氢反应器厌氧活性污泥微生物种群多样性的信息.l材料和方法l.l材料（1）厌氧活性污泥样品试验采用有机玻璃连续流搅拌槽式反应器（CSTR）［16］，发酵生物制氢反应器启动所使用的污泥来源于生活污水排放沟底泥.实验废水采用废糖蜜加水稀释而成，配制时投加一定比例的农用复合肥，使废水中CODI NI P保持在1000I5I1左右.初始COD容积负荷为7.0 k g／（m3・d），~RT为6h.间隔7d从反应器取厌氧活性污泥.（2）仪器及设备低温冷冻离心机（BECKM AN A e g ra21R）；紫外分光光度仪（UN I CAM ~E!I O S）；PCR扩增仪（PE9700）；凝胶成像分析系统（B io-Rad Am p G ene）；D code TM的基因突变检测系统（B io-Rad）；电泳仪（B io-Rad Pow er Pac B asic）；透射扫描仪（UM AX A stra4000U）.l.2方法l.2.l基因组DNA的提取采用改进的化学裂解法直接从厌氧活性污泥中提取基因组DNA.（1）提取缓冲液CTAB／N aC溶液（10% CTAB，0.7m o／L N aC），在80mL~2O中溶解4.1g N aC，缓慢加入CTAB（十六烷基三乙酸溴化铵），同时加热并搅拌，定容终体积至100mL.（2）活性污泥样品处理将1g活性污泥用无菌水洗3次后，用液氮将污泥沉淀研成粉末，取100m g 污泥粉末，加入567"L的TE缓冲液重悬，加30"L 质量浓度10%SD S和3"L20m g／mL的蛋白酶K，混匀，于37C温育1h.（3）基因组DNA的抽提加入100"L5m o／L N aC，充分混匀，再加入80"L CTAB／N aC溶液，混匀，于65C温育10m i n.加入等体积的氯仿／异戊醇，混匀，12000r／m i n离心4#5m i n.将上清液转入一只新离心管中，加入等体积的酚／氯仿／异戊醇，混匀，离心5m i n，将上清液转入一只离心管中.加入0.6倍体积异丙醇，醇沉30m i n.12000r／m i n离心5m i n，弃上清，抽真空干燥后，重溶于50"L TE缓冲液.（4）DNA粗提液的测定使用紫外分光光度计对提取的DNA粗提液样品进行测定（OD260／OD280和OD260／OD230），计算所得样品DNA产量和纯度. l.2.2基因组DNA的纯化提取活性污泥DNA［13］，采用上海华舜DNA柱式胶回收试剂盒纯化DNA粗提液，将纯化后的基因组DNA作为聚合酶链反应（PCR）的模板.l.2.3基因组DNA的PCR扩增使用A pp ied B ios y ste m的G eneAm p PCR s y s-te m9700型基因扩增仪.（1）以大多数细菌和古细菌的16S r RNA基因V3区通用引物扩增引物BSF338（5/-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3/）和BSR534（5/-ATT ACC GCG GCT GCT GGC-3/）（GC夹序列为：5/-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3/）.（2）PCR反应体系100"L的PCR反应体系组成如下：100n g模板、40p m o正反引物、200"m o／L d NTP s（每种10mm o／L）、10"L的10X PCR buff er（M g C2）、2.5U的!"#DNA聚合酶，无菌纯水补齐到100"L.（3）PCR反应条件采用降落PCR策略扩增，95C预变性5m i n，94C变性1m i n，65C退火1m i n，72C延伸30s，每个循环退火温度降低0.5C直至55C，30个循环，72C最终延伸8m i n.PCR反应的产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测.l.2.4变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析采用B io-Rad公司D code TM的基因突变检测系统对PCR反应产物进行分离.（1）变性梯度胶的制备使用梯度混合装置，制备8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度从30%到60%（100%的变性剂为7m o／L的尿素和40%的去离子甲酰胺的混合物），其中变性剂的浓度从胶的上方向下方依次递增.（2）PCR样品的加样待变性梯度胶完全凝固3712期环境科学后，将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽中，取PCR样品5!L和10倍加样缓冲液混合后加入上样孔.（3）电泳及染色在150V的电压下，60C电泳4h.电泳结束后，将凝胶进行银染.（4）胶图扫描将染色后的凝胶用UM AX透射扫描仪扫描后获取胶图，在凝胶两面覆上干胶膜（P rom e g a），用干胶夹定型，自然干燥后长期保存. 1.2.5DGGE的指纹图谱分析利用G el D ocu m ent3000分析软件（B io-Rad）分析DGGE的指纹图谱，通过分析样品电泳条带的数目和亮度来评估微生物多样性和种群相对数量.2结果与分析2.1厌氧活性污泥的基因组DNA提取采用冻融法和化学裂解法相结合提取厌氧活性污泥的基因组DNA.通过无菌水洗厌氧活性污泥沉淀，可以降低样品中的腐殖质等杂质的含量.通过液氮冷冻和温浴，以及溶菌酶和表面活性剂等手段尽可能使全部菌体破胞，使DNA最大限度地释放出来，从而保证获得全部细菌基因组DNA，并增加DNA提取收率.提取厌氧活性污泥基因组DNA后，经过RN ase去除RNA，然后测定其含量和纯度.提取的DNA用1%的琼脂糖，在100V电压下进行电泳.由图1所示，各时期厌氧活性污泥的细菌基因组DNA大于15kb，从不同厌氧活性污泥样品提取出的基因组DNA含量不同.由表1可知，从反应器不同运行时期获取的厌氧活性污泥，提取的DNA产量不同，从1d到29d，产量逐渐递增.1d的DNA产量最低为4.51!g／g污泥，29d最高为15.55!g／g污泥，这是由于反应器运行后生物量的增长所导致的结果.另外，从不同时期厌氧活性污泥提取的DNA 的纯度也不同，从A260／A280（核酸与蛋白质之比）和A260／A230（核酸与腐殖质等物质之比）的比值来看，22d和29d活性污泥的A260／A280的比值相对较小，这是由于微生物代谢旺盛产生了大量胞外聚合物，使DNA抽提过程不彻底所引起的.虽然DNA含量提高但是A260／A230的比值相对1d变化不大，这是由于微生物物质代谢过程中产生大量的腐殖质等物质导致.综上可见，1d的产量低纯度高，而29d虽然产量高但是纯度降低.所以，要解决产量高而带来的纯度低的问题，仍然需要改进厌氧活性污泥的DNA提取方案，在提高污泥DNA产量的同时还要达到高纯度提取.M aker：DL15000图1厌氧活性污泥基因组D N A琼脂糖凝胶电泳图谱F i g.1A g aro se g e l e lectro p ho res is o f g enom ic DNAo f d ifferen t sam p les表1污泥样品D N A的产量和纯度比较T ab le1C om p arison o f t he y ie ld and p urit y o f DNA o fd iff erent s lud ge sa m p les污泥样品／d污泥的DNA含量／!g・g-1A260／A280A260／A23014.511.3040.53487.901.3210.4831510.831.1890.6202214.631.2080.5262915.551.1120.501 2.2厌氧活性污泥的基因组DNA纯化产氢产酸的厌氧活性污泥中含有大量的腐殖质等杂质，并且在DNA提取过程中还有一些试剂是PCR扩增反应的抑制剂，直接进行PCR反应往往不能获得扩增产物.因此，在PCR反应之前，必须对厌氧活性污泥的基因组DNA粗提液进行纯化.本实验采用上海华舜DNA柱式胶回收试剂盒对厌氧活性污泥的基因组DNA粗提液进行了纯化，虽然纯化后每种厌氧活性污泥的基因组DNA产量有所损失，但纯化后的基因组DNA样品中PCR反应抑制剂的含量大大降低，从而为后续的PCR反应提供了纯度较高的DNA模板.2.3基因组DNA的PCR扩增以等量的污泥基因组DNA为模板，采用对大多数细菌和古细菌的16s r RNA基因V3区通用引物（F338GC／R534）对每个厌氧活性污泥样品的基因组DNA进行扩增，在引物F338的5 端添加GC 夹以提高扩增片断的分离效果.反应器运行不同时期的厌氧活性污泥PCR扩增结果如图2所示，经PCR反应后获得了各个时期污泥微生物的16s r RNA基因V3区的目的片断，琼脂糖凝胶电泳显示片断大小约200b p左右.采用降落PCR扩增，提高了样品的扩增特异性，降低了DGGE分析的误差.各个样品的扩增产物可以作为DGGE的样品，能够471环境科学26卷达到分离和鉴别各个厌氧活性污泥样品中微生物种类的目的.M aker：DL2000图2厌氧活性污泥样品的l6s r RNA基因V3区PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱F i g.2A g arose g e l e lectro p hores is of PCRa m p lified16s r RNA（V3）g ene o f d iff erent sa m p les2.4变性梯度凝胶电泳不同厌氧活性污泥样品的DGGE图谱如图3所示，不同厌氧活性污泥样品经过变性梯度凝胶电泳（DGGE）都可以分离出数目不等的电泳条带，且各个条带的信号强度和迁移位置不同.根据变性梯度凝胶电泳（DGGE）对具有相同大小而不同DNA 序列的片断分离原理，可以得知5个时期厌氧活性污泥的PCR产物中含有十几种不同序列的DNA片断，它们是一些特异微生物种类的16s r RNA基因V3区的DNA片断，每个独立分离的DNA片断原理上可以代表一个微生物种属.电泳条带越多说明生物多样性丰富，条带信号越强，表示该种属的数量越多，从而确定不同活性污泥中所含有的微生物的种类和数量关系，得出其中微生物多样性的信息.反应器运行初期1d时，微生物多样性较低，随着时间的推移，8d时生物多样性达到最大，15d后生物多样性开始降低，到29d时生物多样性基本保持不变.在反应器运行过程中，厌氧活性污泥微生物群落结构和种群数量存在明显的演替过程，优势种群的功能地位处于动态变化中，直到形成了顶级优势群落.“!”和“"”标记位置的条带分别为不同时期微生物群落中的优势种群，这些种群在群落演替过程中发挥着重要的作用.其中“"”标记条带为某一群落的特征带，其代表的优势种群是特定生态条件下微生物群落的特征种属.在微生物群落结构的演替过程中，DGGE指纹图谱显示存在许多共同的种属，如图中“#”标记条带为共同带，在反应器运行过程中一直存在.这些现象可以说明反应器从接种污泥到稳定运行过程中，一些种属的微生物一直存在，并且在微生物群落的物质和能量代谢中发挥着作用，是一些生态幅比较广泛的种属.不同时期的厌氧活性污泥中既存在着共同的微生物种属，同时也存在着各自独特的微生物种属，微生物种属之间通过协同和竞争作用，形成了特定生态位的群落结构.#标记条带为共同带；!和"标记条带为特征带图3不同厌氧活性污泥样品的DGGE分离图谱F i g.3DGGE p ro file o f d iff erent sa m p les2.5DNA指纹图谱分析由于影响DGGE分辨率的因素很多，所以实际上每个条带也可能是多个微生物的DNA片断.可见通过指纹分析可能由于分辨率的问题降低了群落多样性，但是仍然能够很好的分析群落多样性.通过软件对DGGE指纹图谱进行UPGM A聚类分析，图4结果显示，1d的微生物群落优势种属为14种，其群落结构与其它时期群落结构的相似性最低，由此可见反应器在运行时初期群落演替迅速.8d时微生物群落多样性达到最大，优势种群比较多，微生物优势种属达到20种.22d和29d时微生物群落结构相似程度较高为88.2%，群落演替进程缓慢，结构组成逐渐趋于稳定.厌氧活性污泥经过驯化过程，微生物数量和优势种群增加，29d时微生物多样性显著要高于1d，微生物优势种属达到17种，既存在原有种属消亡，也有新种属的增长.在演替过程中，微生5712期环境科学物多样性增加后又逐渐降低，群落结构之间的相似性逐渐升高，演替过程由迅速到缓慢，形成了稳定的群落类型.3结论（1）在生物制氢反应器运行中，厌氧活性污泥微生物群落经历了明显的演替过程，群落结构和优势种群数量具有时序动态性，微生物多样性呈现出协同变化的特征.（2）DGGE的DNA指纹图谱显示，在微生物群落结构的演替过程中，各个群落都存在特征带，其代表的优势种群是特定生态条件下微生物群落的特征图4DGGE图谱UPGM A聚类分析F i g.4C luster anal y s is of DGGE b y UPGM A种属.同时，从接种污泥到反应器稳定运行过程中，也存在共同带，一些种属的微生物一直存在，并且在微生物群落的物质和能量代谢中发挥着作用，是一些生态幅比较广泛的种属.不同时期的厌氧活性污泥中既存在着共同的微生物种属，同时也存在着各自独特的微生物种属，微生物种属之间通过协同和竞争作用，形成了特定生态位的群落结构.（3）在演替过程中，微生物多样性增加后又逐渐降低，群落结构之间的相似性逐渐升高，演替速度加快后减慢，直到形成稳定的群落类型.参考文献：［1］D ebabrata D，V eZiro lu T N.~y dro g en p roduction b y b io lo g ical p rocesses：a surve y o f literature［J］.int.J.~y dro g en Ener gy，2001，26：13!28.［2］Am ann R i，LudW i g W，S ch le if er K~.Ph y lo g enetic i dentifica-tion and i n s itu detection of i nd ivi dual m icrob ial ce lls W it hout cul-tivation［J］.M icrob io l R ev.，1995，59（1）：143!169.［3］D ieZ B，Pedr s-A li c，M arsh T L，et al.A pp lication o f dena-turi n g g rad ient g e l e lectro p hores is（DGGE）to stud y t he d ivers it yof m ari ne p icoeukar y otic asse m b la g es and com p arison of DGGEW it h ot her m o lecular techn i C ues［J］.A pp l.Environ.M icrob i-o l.，2001，67（7）：2942!2951.［4］F rank S，Christo p h C T.A neW a pp roach to utiliZe PCR s i n g le strand conf or m ation p o l y m or p h is mf or16Sr RNA g ene based m i-crob ial comm un it y anal y s is［J］.A pp l.Environ.M icrob io l.，1998，64：4870!4876.［5］Gvre s L，D aae F L，T orsvi k V，et al.CharacteriZation o f m i-crob ial d ivers it y i n h yp er sali ne environ m ents b y m e lti n g p rofilesand reassociation ki netics i n com b i nation W it h ter m i nal restrictionfra g m ent len g t h p o l y m or p h is m（T-RFLP）［J］.M icrob.E co l.，2003，46：291!301.［6］M u y Zer G，D e W aal E C，U itterli nden A G.P rofili n g o f com-p leX m icrob ial p o p ulations b y denaturi n g g rad ient g e l e lec-tro p hores is anal y s is o f p o l y m erase chai n reaction-a m p lified g enescod i n g f or16S r RNA［J］.A pp l.Environ.M icrob io l.，1993，59：695!700.［7］F erris M J，M u y Zer G，W ard D M.D enaturi n g g rad ient g e le lectro p hores is p ro files o f16Sr RNA-defi ned p o p ulations i nhab it-i n g a hot s p ri n g m icrob ial m at comm un it y［J］.A pp l.Environ.M icrob io l.，1996，62（2）：340!346.［8］A ra y a R，T an i K，T aka g i T，et al.B acterial activit y and com-m un it y com p os ition i n strea m W ater and b io fil m from an urbanriver deter m i ned b y fluorescent in sit u h y bri d iZation and DGGEanal y s is［J］.FEM S M icrob io l E co l.，2003，43：111!119.［9］S ch f er~，S ervais P，M u y Zer G.S uccess ional chan g es i n t heg enetic d ivers it y o f a m ari ne bacterial asse m b la g e duri n g confi ne-m ent［J］.A rch M icrob io l.，2000，173：138!145.［10］M ller A K，W ester g aard K，Christensen S，et al.T he d ivers i-t y and f unction o f so il m icrob ial comm un ities eX p osed to d iff erentd isturbances［J］.M icrob.E co l.，2002，44：49!58.［11］K oW alchuk G A，G erards S，W o ldendro p J W.D etection and characteriZation f un g al i nf ections o f Amm o P hila arenaria（M ar-ra m g rass）roo ts b y denaturi n g g rad ient g e l e lectro p hores is o fs p ecificall y a m p lified18S r DNA［J］.A pp l.Environ.M icrob i-o l.，1997，63（10）：3858!3865.［12］Y an g C~，C roW le y D E.Rh iZos p here m icrob ial comm un it y structure i n re lation to root location and p lant iron nutritional sta-tus［J］.A pp l.Environ.M icrob io l.，2000，66（1）：345!351.［13］W en-T so L，O n-Ch i m C，~erbert~P F an g.M icrob ial comm u-n it y d y na m ics duri n g start-u p o f aci do g en ic anaerob ic reactors［J］.W at R es.，2002，36：3203!3210.［14］Zhan g T，~erbert~P F an g.Ph y lo g enetic d ivers it y of a SRB-rich m ari ne b io fil m［J］.A pp l M icrob io l B iotechno l.，2001，57：437!440.［15］M u y Zer G，Sm alla K.A pp lication o f denaturi n g g rad ient g e le lectro p hores is（DGGE）and te m p erature g rad ient g e l e lec-tro p hores is（TGGE）i n m icrob ial eco lo gy［J］.A nton ie V anL eeu W enhoek，1998，73：127!141.［16］任南琪.有机废水发酵法生物制氢设备［P］.中国专利：CN92114474.1，1992.671环境科学26卷。
利用nestedPCR_DGGE技术分析江苏啤酒大麦真菌群落结构
2. 1 总 DNA 的提取 DNA 的提取在 PCＲ-DGGE 分析复杂样品微生物
群落结构中至关重要，所提 DNA 的质量直接影响后 续的 PCＲ 操作和 DGGE 分离效果，而对于富含多糖 类物质的大麦，其总 DNA 的提取更为困难和关键。 本文比较了 9 种不同的提取方法，原位提取方法得到 的啤酒大麦总 DNA 得率总体比异位提取高，其中方 法 1 与方法 3 所提 DNA 得率最高，可能是提取到的 植物 DNA 较 多 所 致。 方 法 8 得 到 的 啤 酒 大 麦 总 DNA 得率最低，仅为 2. 4 μg / g 大麦（ 图 1） 。
摘 要 为了探索真菌群落对啤酒大麦麦芽的影响，首先要了解啤酒大麦真菌群落结构。文中采用 9 种不同方 法提取了啤酒大麦总 DNA，利用嵌套聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（ nested PCＲ-DGGE） 技术，分析了啤酒 大麦真菌群落结构，明确了啤酒大麦中优势真菌种属信息。不同 DNA 提取方法，nested PCＲ-DGGE 分析结果有 显著差异。啤酒大麦中的主要真菌为 Cochliobolus sativus、Alternaria alternata、Fusarium sporotrichioides、Coniothyrium fuckelii、Aspergillus sp. 和 Saccharomyces cerevisiae 等子囊菌门真菌以及 Sporobolomyces roseus、Cryptococcus magnus 和 Entorrhiza fineranae 等担子菌门真菌。该研究丰富了对啤酒大麦真菌群落结构的认识，同时也证明 nested PCＲ-DGGE 技术是一种能够快速有效地研究啤酒大麦真菌群落结构的技术。 关键词 啤酒大麦，DNA 提取，Nested PCＲ-DGGE，真菌群落结构
污水处理过程中微生物群落结构的分析
污水处理过程中微生物群落结构的分析引言随着城市化和工业化的发展，无处不在的污水污染成为严重的环境问题。
污水处理技术是解决污染的关键方法之一。
而污水处理过程中微生物群落结构的分析是研究污水处理效果的重要方法。
本文将从微生物群落的组成、分布与演替、影响因素、研究方法等方面进行分析。
微生物群落的组成污水处理过程中的微生物群落主要由细菌、真菌、古菌、原生动物和病毒等各种微生物组成。
其中，细菌是污水处理过程中数量最多的微生物，其数量约占总微生物数的90%以上。
细菌的主要种类包括好氧菌、厌氧菌、化能菌和氧化菌等。
古菌、真菌、原生动物和病毒等微生物数量相对较少，但同样具有重要的生态功能。
微生物群落的分布与演替微生物群落在污水处理过程中呈现出显著的分布和演替特征。
污水处理过程中主要包括细菌生物膜法、生物流化床法、活性污泥法等，每种处理方法所形成的微生物群落结构有所不同。
在细菌生物膜法中，细菌主要附着在生物膜上，其中硝化菌和反硝化菌负责氨氧化和脱氮反应。
在生物流化床法和活性污泥法中，细菌主要在床层和粘性悬浮颗粒中存在，其中好氧菌、厌氧菌和化能菌等起到重要作用。
微生物群落的影响因素污水处理过程中微生物群落结构除了受处理方法的影响外，还受到环境因素的影响。
主要包括温度、pH值、溶解氧浓度、有机负荷、氮、磷、微量元素等因素。
其中，温度和溶解氧浓度是影响微生物活动的重要因素，高温和低氧会导致微生物数量的减少和活性的下降。
有机负荷、氮、磷等物质是污水处理的主要目标，但过高或过低的浓度也会对微生物群落结构造成影响。
微生物群落研究方法微生物群落结构研究的主要方法有培养法、PCR-DGGE法、高通量测序和荧光原位杂交等。
其中，培养法是传统的微生物分类鉴定方法，虽然易于操作，但对微生物的分离效果受到限制。
PCR-DGGE法能够准确地分离微生物群落中的不同种类，但对于微生物种群的定量研究有一定的限制。
高通量测序技术能够对微生物群落结构进行高通量和高质量的测定，但需要较高的经费和技术支持。
PCR-DGGE技术分析合生素对肉仔鸡盲肠菌群结构的影响
摘
要 ： 验研究合生素对 肉仔鸡 盲肠 微生物 区系 的影 响。选择 １日龄 肉仔鸡 ４０只 ， 试 ５ 随机分成 ５个处理 ， 分
别饲喂基础 日粮 、 基础 日粮 ＋抗生素 、 基础 日粮 ＋ 益生 素 、 基础 日粮 ＋益生元 、 基础 日粮 ＋合生素 ， 每个 处理 ３ 个重复 ， 每个重复 ３ ０只鸡 。在 ２ ，２日龄每 个重 复选择 ２只鸡 ， １４ 无菌 采集 盲肠 内容 物 ， 提取 细 菌基 因组 总 Ｄ Ａ，Ｃ Ｎ Ｐ Ｒ扩增 １ ｓ Ｄ Ａ Ｖ ６ Ｎ ３区， 增产物经变性梯度凝 胶 电泳 （ Ｇ Ｅ 后分 析细 菌群落 结构 的变化 。结果 ｒ 扩 Ｄ Ｇ ） 表 明， ２ ，２日龄 ， 在 １４ 日粮添加合生 素处 理组试验 鸡盲肠 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ条带 数均 高于其他 处理 组 ， 合生 素组试 验鸡 盲肠 内容物菌群 多样 性高于其他试验组 。序 列分析发现 肉仔鸡盲肠 中特 异条带主要来 源于不 可培养 的拟杆 菌属 、 普雷沃 氏菌属 、 梭菌 目细菌和其他 大量 种属关系未知 的细 菌。 关键词 ： 合生素 ； Ｇ Ｅ； Ｄ Ｇ 肠道 菌群 ； 肉仔鸡 ； 盲肠
ｃ ｉｋ ｎｓｏ ａ ｈ ｒｐｌｃ ｔ ｒ ａ ｏ ｙ ｓ ｌｃ ｅ ｎ ｉｌｄ，ｔ ｅ ａ ｏ ｔｎｔ ｒ ｔ ｒｌｌ ｏ ｌｃｅ ｈｃ ｅ ｆｅ ｃ ｅ ｉ ａｅ ｗｅ ｅｒ ｎｄ ｍｌ ｅ ｅ ｔ ｄ ａ ｄ ｋ ｌｅ ｈｅｃ ｃ ｌｃ ｎｅ ｓｗｅｅ ｓｅ ｉｅｙｃ ｌｅ ｔｄ，ａ ｏ ａ ｅ— ｎｄ ｔｔ ｃ ｌ ｌ ｌｌ ｒＤＮＡ ｒ ｍ ｈ ｅ ａ ｉ ｅ ｔ ｒ ｘ ｒｃ ｅ ｎｄ ｐ ｒｆｅ ｏ ＣＲ— ｕａ ｆｏ ｔ ｅｃ ｃ ｌｄ ｇ ｓａ ｗｅ ｅｅ ｔａ ｔｄ ａ ｕ ｉ ｄ ｆ ｒＰ ｉ ＤＧＧＥ ，ｔ ｅ ｉ ｅｓｔ ｆｍｉ ｒｂｉｔ ｓａ ｌ ｚ ｄ ｈ ｎ ｄ ｖ ｒｉｙｏ ｃ ｏ ｏ ａｗａ ｎａｙ ｅ ａｔｒ ＤＧＧＥ． Ｔ ｅ ｕ ｔ ｈ ｗｅ ｈ ｈｉｋ ｎ ｅ ｔ ｙ ｉｔｃ ｈｏ ｄ ａ ｈｉｈ ｒｂａ ｔｒａ ｉｅ ｓｔ ｎｄ ｍｏ ｅ ＤＧＧＥ ｆｅ ｈｅ ｒ ｓ ｌｓ ｓ ｏ ｄ ｔｅ ｃ ｃ ｅ ｓ ｆｄ ｗｉｈ ｓ ｎｂｏ ｉｓ ｓ ｗｅ ｇ ｅ ｃｅ ｉ ｄｖ ｒｉｙ ａ ｒ ｌ ｂ ｎ ｏ ａ ｅ ｔ ｔ ｅ ｒ ａｍｅ ｔ ｎ ａ ｎ ４ ａ ｄｓｃ ｍｐ ｒ ｄ ｗｉｈ ｏ ｈ ｒｔｅ ｔ ｎ ｓｏ ｄ ｙ２１ａ ｄ ２． Ｔ ｅ ｓ ｅ ｉ ｃｔ ａ ｄ ｆｃ ｃ ｌｗｅ ｅ ｆｏ ｕ ｃ ｔ ｅ ｃｅｏ ｄ ｈ ｐ ｃｆ ｉｙ ｂ ｎ ｓ ｏ ｅ ａ ｒ ｒ ｍ ｎ ｕｌ ｉ ｕｒ ｄＢａ ｔｒ ｉ — ａｅ ｌｓ，ｕ ｃ ｈｕｒｄ Ｐｒｖ ｔｌａ ｅ ｅ，ｕ ｕｔ ｒ ｄ Ｃ ｏ ｔｉ ｉ ｅ ｎｄ ｐ ｅ ｔ ｆｕ ｕｌｕ ｅ ｃ ｅｉ ｔ ｏ ｌｓ ｉ ｃ ｔｏ ｎｕ ｅ ｅ ｏｅｌｃ ａ ｎｃ ｌｕ ｅ ｌｓｒｄａｌｓ ａ ｌ ｎｙ ｏ ｎｃ ｔ ｒ ｄ ｂａ ｔｒａ ｗｉｈ ｕｔｃａ ｓｆ ａ ｉｎ． ｌ ｉ Ｋ ｅ ｏ ｄｓ：ｓ ｎ ｉ ｔｃ ； ＤＧＧＥ ；ｉ ｔ ｉａ ｃｏ ｏ ａ；ｂｒ ｉ ｒ；ｃ ｃ ｌ ｙｗ ｒ ｙ ｂ ｏｉ ｓ ｎ ￣ ｔｎ ｌｍｉ ｒｂｉｔ ｏｌ ｅ ｅ ａ
泥坑浓香型白酒窖泥中微生物群落结构与多样性分析
摘要本文采用Illumina PE250测序法对浓香型新窖泥、老窖泥和品质较好的老窖泥中微生物群落结构与多样性进行研究。
结果表明:从门水平结构分析,厚壁菌门与子囊菌门分别为浓香型白酒窖泥的优势细菌与优势真菌;从属水平结构上分析,新窖泥的优势菌属是乳酸菌属,优势真菌属是单端孢属;老窖泥与品质较好的老窖泥优势菌属是乳酸菌属,优势真菌属是青霉属。
不同窖龄、不同质量的窖泥微生物结构多样性具有显著差异。
关键词浓香型白酒;窖泥;微生物多样性;结构组成中图分类号TS201.3文献标识码A 文章编号1007-5739(2021)03-0203-04DOI :10.3969/j.issn.1007-5739.2021.03.078开放科学(资源服务)标识码(OSID ):Microbial Community Structure and Diversity in Luzhou-flavor Liquor Cellar MudLIANG Huan 1XU Changfeng 2*TANG Weibin 2REN Yueming 2ZHU Lining 3(1School of Biological Science and Engineering,Hebei University of Economics and Business,Shijiazhuang Hebei 050200;2School of Biological Science and Engineering,Xingtai University,Xingtai Hebei 054001;3Hebei Fenglaiyi Wine Co.,Ltd.,Ningjin Hebei 055550)Abstract In this paper,Illumina PE250sequencing method was used to study the microbial community structure and diversity in Luzhou-flavor new cellar mud,old cellar mud and good quality old cellar mud.The results showed that,from the perspective of phyla level,Firmicutes and Ascomycetes were the dominant bacteria and fungi in luzhou-flavor liquor cellar mud respectively;the dominant bacteria were Lactobacillus and the dominant fungi were Trichothecene in the new cellar mud from the analysis of the genus level.The dominant bacteria was Lactobacillus and the dominant fungi was Penicillium in the old cellar mud and good quality old cellar mud.There were significant differences in microbial structure diversity of pit mud with different ages and qualities.Keywords Luzhou-flavor liquor;cellar mud;microbial diversity;structural composition泥坑浓香型白酒窖泥中微生物群落结构与多样性分析梁欢1许长峰2*唐伟斌2任月明2朱立宁3(1河北经贸大学生物科学与工程学院,河北石家庄050200;2邢台学院生物科学与工程学院,河北邢台054001;3河北凤来仪酒业有限公司,河北宁晋055550)浓香型白酒具有独特的酿造工艺,混有特殊的窖香风味,深受人们喜爱[1]。
应用PCR—DGGE研究铜冶炼厂附近根际土壤微生物生态变化
ａａａ ｉ ｅｖ ｅ ｌ ｉ ｒｉ ｓｈｒ ｓｉ ａ ｅｒａｅ ｏ ｐｒｄｔ ｔｅ ｏｔ ｌｎ ｌ ｔ Ａ ｏｇｔｅｅ ｌｎ ， ｅｉ ｒ ａ ｅ ｅｔ ｖｉｂｌ ｏｈ ａｙｍ ｔ ｓｎ ｈ ｏｐ ｅｅ ｏ ｓ ｓ ｃｅｓｄｃｍ ａｅ ｎｒ （ ｐａ ） ｍ ｎ ｓ ａｔ Ｖ ｔ ｅｉ ｈｄｔ ｓ ｌ ｉ ｆ ｙ ｔ ａ ｚ ｌｗ ｄ ｏｈ ｃ ｏ ｏ ｎ ． ｈ ｐ ｓ ｖ ａ ｈｂ
ｅ ｅ ｔ ｎ ｄ ｃ ｅ ｓ ｎ ｅａ ａｌ ｉ ｔ ｆ ｅ ｖ ｔ ｓｉ ｈ ｚ ｓ ｈ ｒ ． Ｔ ｅ ｇ ｎ ｍｉ Ｄ ｆ ｃ ｏ ｅ ｒ ａ ｉｇ ｔ ｖ ｉ ｌ ｙｏ ａ ｍｅ ａ ｒ ｉ ｐ ｅｅ ｈ ｅ ｏ ｃ ＮＡ ａ ｓ ｘ ｒ ｃｅ ｎ ｕ ｆ ｄ ｆ ｍ ｉ ｅ ｅ ｔ ｈ ｚ — ｈ ｂ ａ ｉ ｈ ｙ ｌ ｎ ｏ Ｗ ａ ｏ ｅ ｔａ ｔｄ ａ ｄｐ ｒｉ ｏ ｄ ｆ ｒ ｎ ｉ ｓ ｌ ｉ ｅ ｒ ｒ ｏ
关性 ， Ｅ Ｔ 而 Ｄ Ａ提取态的 ｃ ｕ和 ｚ 则 与 Ｓ ａｎｎ指数有显著性 的负相关 性 ， ｎ ｈ ｏ ｎ 其相关系数为 ０９ ３ ， Ｄ Ａ提取态 的 ｃ ． ＥＴ ５９ ｕ还与 Ｓ ａ — ｈｎ
ｎｎ ｏ 指数呈极显著性 的负相关 ， 其相关 系数 为 ０９ ３１ ． 。 ９
中温大曲在发酵和贮存过程中微生物群落结构分析
中温大曲在发酵和贮存过程中微生物群落结构分析唐贤华;田伟;张崇军;周文;舒学香【摘要】通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术解析中温大曲在不同发酵期和贮存期的微生物群落结构,获得表征中温大曲细菌和真菌群落结构的DGGE指纹图谱.结果表明,中温大曲细菌有19种,其中芽孢杆菌属(Bacillus)和乳酸菌属(Lactobacillus)均属于优势菌群;真菌共13种,其中根霉属(Rhizopus)和酵母属(Saccharomyces)均属于优势菌.大曲微生物总体的变化趋势是发酵开始时微生物数量较少,发酵中期(4～8 d)微生物数量达到顶峰,大量细菌和真菌旺盛繁殖,发酵后期(12 d)微生物群落逐渐减少并趋于稳定;贮存期内,微生物的种类的趋于平稳,数量变化较大.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2019(038)006【总页数】6页(P113-118)【关键词】中温大曲;细菌;真菌;聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳【作者】唐贤华;田伟;张崇军;周文;舒学香【作者单位】四川工商职业技术学院,四川都江堰 611830;中国测试技术研究院,四川成都 610021;四川工商职业技术学院,四川都江堰 611830;四川工商职业技术学院,四川都江堰 611830;四川工商职业技术学院,四川都江堰 611830【正文语种】中文【中图分类】TS261.1我国传统白酒的酿造是依靠大曲中菌系的繁殖代谢而进行的[1]。
参与酿酒发酵的微生物种类很多，包括细菌、霉菌、酵母菌等。
追踪其来源，主要是大曲发酵过程中网罗自然界的微生物，因而通过研究大曲中的微生物，了解大曲中微生物数量、种类和分布规律，从而明白白酒的发酵原理是很有必要的[2-5]。
中温大曲是清香型大曲酒的糖化发酵剂，由于其发酵最高品温一般在50℃以下，故称中温大曲。
大曲的质量与培养、贮存过程有着密切的关系，主要体现在微生物的差异上，不同时期曲坯的微生物结构和数量有显著区别，影响着糖化酶、液化酶和蛋白酶等多种酶类以及有机酸等代谢产物的生成[6]。
DGGE分析微型真核浮游生物遗传多样性及其与环境因子的相关性
ＤＧＧ Ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｐ ｉ ｃ ｏ ｅ ｕ ｋ ａｒ ｙ ｏ ｔ ｅ ｓ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｄ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ａ ｎ ｄ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｈ ｉ ｐ
ｗｉ ｔ ｈ ｅ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏ ｎ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｓ ／ ｕ Ｑ ｉ ａ ｎ ｇ ， Ｚ Ｈ Ａ Ｏ Ｙ ｕ ｅ ， Ｌ Ｉ Ｙ ｕ ｈ ｕ ａ ， ＷＥ Ｉ Ｚ ｉ ｍ ｉ ｎ （ Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｏ ｆ Ｌ ｉ ｆ ｅ
ｃ ｏ ｒ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｅ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏｎ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｓ ｏ ｆ Ｄａ ｑｉ ｎ ｇ Ｈｏｎ ｇ ｑ ｉ ｒ ｅ ｓ ｅ ｒ ｖ ｏ ｉ ｒ ．ＤＧ ＧＥ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｉ ｎ ｄ ｉ ｃ ａ ｔ ｅ ｄ ｔ ｈａ ｔ ｔ ｈ ｅ
第４ ４ 卷 第８ 期
２ ０ １ ３ 年８ 月
东
北
农 业
大
学 学
报
４ ４ （ ８ ） ： ７ ０ － ７ ５
Ａｕ ｇ ． ２ ０ １ ３
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｎｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ａ ｓ ｔ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｈ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
ｗ ａ ｔ ｅ ｒ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｅ ｓ ｏ ｆ Ｈ ｏ ｎ ｇ ｑ ｉ ｒ ｅ ｓ ｅ ｖ ｒ ｏ ｉ ｒ ｓ ｈ ｏ ｗｅ ｄ ｈ ｉ ｇ ｈ ｌ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｆ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｄ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ（ ３ ０ ｉ ｎ ｄ ｅ ｐ ｅ ｎ ｄ ｅ ｎ ｔ Ｏ Ｔ Ｕ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ） ．ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｗ ｅ ｒ ｅ ｖ ａ ｒ ｉ ｏ ｕ ｓ Ｄ Ｇ ＧＥ ｆ ｉ ｎ ｇ ｅ ｒ ｐ ｒ ｉ ｎ ｔ ｓ ａ ｍｏ ｎ ｇ ｓ ｅ ａ ｓ ｏ ｎ ｓ ．Ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ Ｓ ｈ ａ ｎ ｎ ｏ ｎ ｉ ｎ ｄ ｅ ｘ ｓ ｈ ｏ ｗ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｈ ｉ ｇ ｈ ｅ ｓ ｔ Ｓ ｈ ａ ｎ ｎ ｏ ｎ ｉ ｎ ｄ ｅ ｘ ｗ ａ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｅ ｓ ｏ ｆ ｓ ｕ ｍｍ ｅ ｒ （ ａ ｖ ｅ ｒ ａ ｇ ｅ Ｓ ｈ ａ ｎ ｎ ｏ ｎ ｉ ｎ ｄ ｅ ｘ ｗａ ｓ ２ ． ５ ８ ） ， ｆ ｏ ｌ ｌ ｏ ｗ ｅ ｄ ｂ ｙ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｅ ｓ ｏ ｆ ａ ｕ ｔ ｕ ｍｎ（ ａ ｖ ｅ ｒ ａ ｇ ｅ Ｓ ｈ ａ ｎ ｎ ｏ ｎ ｉ ｎ ｄ ｅ ｘ ｗａ ｓ ２ ． １ ７ ） ， ｗ ｈ ｉ ｌ ｅ ｔ ｈ ｅ ｌ ｏ ｗ ｅ ｓ ｔ ｗ ａ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｅ ｓ ｏ ｆ ｓ ｐ ｒ ｉ ｎ ｇ （ ａ ｖ ｅ ｒ ａ ｇ ｅ Ｓ ｈ ａ ｎ ｎ ｏ ｎ ｉ ｎ ｄ ｅ ｘ ｗ ａ ｓ １ ． ８ ５ ） ．Ａ ｌ ｓ ｏ ，ｔ ｈ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｄ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ
PCR-DGGE技术分析塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构
Ｏ ５后 由于 葡萄 糖 的加入 增加 到 １ ７二 级滤 池 出水 中葡 萄糖 的加 入， 强了 系统 内微 生物 的活 性， 而三 级滤池 砂 石和 青石 层细 菌条 带变 ．， ２ ．． ２ 加 从 亮变 多 ． 克 隆测序 和 系统 发 育树 分 析， 式蚯 蚓生 态 滤池 内的微 生物 多为 单细 胞 菌属 、假 单细 胞 菌属 、革 兰 氏 阴性菌 属和 不可 培 养杆 经过 塔 菌属 ， 同细菌 条 带在 不 同级滤 池 内差异 变化 明显． 不 关键 词 ：Ｐ Ｒ Ｄ Ｅ Ｃ － ＧＧ ；蚯 蚓 生态 滤池 ；微 生物 群落 ；指 数 ；菌属
中 图分 类号 ：Ｘ ０ ７５ 文 献标 识码 ：Ａ 文 章编 号 ：１０— ９ ３２ １）４ ０ ９— ６ ０ ０ ６２ （０ １０－ ５７ ０
Ｒｅ ｅ ｒ ｈ ｏ ｃ ｏ ｅ ｃ ｍ ｍｕ ｉｙ ｉ ｏ ｒ ｅ ｒ ｈ ｒ ｅ ｏ ｏ ｙ ｆｌ ｒ ｂ ＣＲ・ ｓ ａ ｃ ｎ ｍｉ ｒ ｂ ｏ ｎ ｔ ｎ ｔ ｗｅ ａ ｔ ｗｏ ｍ ｃ ｌ ｇ ・ ｔ ｙ Ｐ ｉ ｅ ＤＧＧＥ．ＧＵＯ ｅ — ｏ ｇ ．ＺＨＥＮＧ Ｆ ｉｈ ｎ
中国环境科学
２ １，１４ ：５ ７ ６ ２ ０ １ （） ９ ～ ０ ３
Ｃ ｉａ ｎ ｉ ｎ ｎａ Ｓ ｉｎｅ ｈｎ Ｅ ｖｒ ｍｅ ｔｌ ｃ ｃ ｏ ｅ
ＰＲＤ Ｇ Ｃ — Ｇ Ｅ技术分析塔 式蚯蚓 生态滤池微生物群 落结构
郭 飞宏 ‘ ， 郑 正 ， 张继 彪 （． １ 南京大学环境学院， 污染控制与资源化研究国家重点实验室， 江苏 南京 ２０９ ； １０３