腺病毒滴度测定
试验室犬的犬腺病毒2型感染疾病的诊疗防治
试验室犬的犬腺病毒2型感染疾病的诊疗防治犬腺病毒2型感染（CAV-2infectious）可引起犬的传染性喉气管炎及肺炎症状。
临床症状主要表现为持续高热、咳嗽、浆液性至黏液性鼻漏、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎。
该病多见于4月龄以下的幼犬，可造成全窝或全群咳嗽，因此又称为“犬窝咳”。
病原1974年，Rubarth最先描述了犬的传染性肝炎。
1959年，Kapsenberg分离获得病毒，称为犬传染性肝炎病毒。
1962年，Ditchfield等分离获得单纯引起呼吸道病变（喉气管炎）而不引起肝炎的腺病毒，即A26株。
前者被称为CAV-1型，后者被称为CAV-2型。
CAV-2和CVA-1同属腺病毒属，具有典型的腺病毒对称的衣壳，直径55～80nm。
基因组为双股DNA，无囊膜。
和CAV-1相比，CAV-2纤突较长，为35～37nm。
CAV-2和CVA-1均能凝集人（O型）红细胞，前者还可凝集豚鼠红细胞。
两型均不凝集犬、小鼠、兔、绵羊、马和牛的红细胞。
二者具有共同的补体结合抗原，但其生化特性和核酸同源性彼此各异，应用血凝抑制试验和中和试验可以将其加以区别。
CAV-2对酸和热的灭活作用不敏感，能抵抗乙醚、氯仿等脂类溶剂。
CAV-2在4℃和室温下保存20d，滴度未见明显下降。
但56℃20min明显下降。
流行病学CVA-2感染主要发生在幼犬，狐狸幼仔也可被感染。
CVA-2可通过呼吸道感染，病毒在无纤毛的细支气管上皮细胞，鼻黏膜、咽喉和扁桃体隐窝的表面细胞，支气管的黏膜及肺泡上皮细胞中增殖。
还能在咽喉淋巴结和支气管淋巴结增殖。
临床症状犬腺病毒2型感染潜伏期为5～6d。
临床特征表现为持续性高热（体温在39.5℃～40℃）、精神沉郁、食欲废绝、肌肉颤抖、鼻部流浆液性鼻液、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎，并有呕吐和腹泻症状出现。
之后出现阵发性干咳，后表现湿咳并有痰液，呼吸急促。
听诊有气管啰音，口腔咽部检查颌下淋巴结肿大、扁桃体肿大、咽部红肿，病状继续发展可引起坏死性肺炎。
慢病毒包装和滴度检测方案流程
慢病毒包装、滴度测定方案流程一、背景：四质粒的包装体系1.含有目的基因的转染质粒2.VSV-G：pMD2.G（包膜质粒）3.Rev：pRSV-Rev4.Gag/Pol：pMDLg/pRRE二、包装细胞：293T293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。
该细胞贴壁松散，操作时请尽量轻柔；换液时需预热培养基。
培养条件：DMEM ＋10% FBS＋1% P/S三、主要试剂1.93T培养基：高糖DMEM（含丙酮酸钠、谷氨酰胺）+ 10% FBS + GlutaMAX2.病毒收获培养基：取50 ml 293T培养基，加入0.5 g BSA（Sigma A9418）和终浓度为10-15 mM的HEPES，0.22 µm过滤。
3.无内毒素质粒抽提试剂盒4.Polybrene (10 mg/ml)：促转染试剂，提高转染效率。
四、包装步骤1.Day1:汇合度90%的10cm dishs HEK293T细胞（~ 6×107/dish）按1：1比例传代至15cm dishs，第二天细胞汇合度达到90%-95%（~1.5×108/dish），培养基为Gibico高糖DMEM培养基（含10%FBS）。
2.Day2:1)转染前2-3个小时更换培养基（含10%FBS)；2)按照以下比例配制转染试剂：Mix 1体积μlMix 2量DMEM（无FBS）1000μlDMEM（无FBS）1000μl目的基因质粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μgMix 1和Mix 2分别混合后，室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min，加入至15cm dish中。
（细胞达到汇合度90%，细胞过少会影响转染效率）。
3.Day36h-24h内更换新鲜培养基（含10%FBS），观察转染效率并拍照。
腺病毒常见问题与解答
腺病毒常见问题与解答1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？有要求。
对E1和E3双缺失的腺病毒载体，比如AdMax的Kit C、Kit D等，其总包装的外源片断要求小于8 kb。
而对于只有E1缺失或E3缺失的载体，比如Kit A、Kit B等，外源片断要求小于5 kb。
注意，外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。
2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。
根据经验，完成一个完整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012VP左右.3、如何提高腺病毒的活性？提高腺病毒的活性，关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。
纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程，如果扩增的病毒滴度高，那么纯化后就会更高的。
4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR（未翻译区）的额外的碱基会影响蛋白表达吗？UTR尽可能短一些，特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。
在起始密码子ATG 前面可以加一小段（6-9bp）的碱基序列可以增强目的基因的表达，比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。
5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞？参照文献报道是很简单的办法，也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。
Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞（包括分裂和非分裂细胞），比如肝、肌肉、神经组织等。
但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞，比如乳腺癌、白血病细胞等，感染效率较低。
6、腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意哪些问题？1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。
可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。
2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。
避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。
病毒滴度测定知识讲解
可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度。
第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1 uL ；第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0 uL；第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 uL ；依次类推…第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5 uL ；第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6 uL ；换句话说：如果在加入1E-5 uL 病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/(1E-5)=3E+5，单位为TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。
稀释计数法滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293 T 细胞消化计数后稀释至1×100 000/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备10 个孔。
放入37℃，5% 二氧化碳培养箱中培养。
第二天加病毒在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5mL EP 管，每管加入90 μL 培养液，往第一个管中加入10 μL 病毒原液，混匀后，吸取10 μL 加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10—0.00000001）。
吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入100 μL 完全培养液，利于细胞的生长。
第四天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
利用293T细胞扩增腺病毒操作步骤
利用293T细胞扩增腺病毒CCL22操作步骤（1）在100mm培养皿或75cm2培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106 293T细胞。
（2）取0.5ul首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释应得到的MOI值约为5。
（3）移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3次，37℃ CO2孵箱中培养90分钟。
（4）加入9ml DMEM5%。
（5）再培养72小时，这时在10ml溶液中大约有5×109~5×1010个病毒颗粒，进行MOI测定以估计病毒颗粒。
注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。
收集细胞，600×g离心5分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积（一般为原始体积的1/10即1ml）病毒保存溶液重悬细胞。
-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。
（6）-20℃/37℃冻融3次。
（7）转入15ml无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10分钟，收集上清冻存于-20℃或-80℃。
（8）3个175cm2培养瓶中各加入107 293T细胞进行培养。
（9）将3ml细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混匀。
移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃动混匀3次，37℃CO2孵箱中培养90分钟。
此时MOI值约为25。
（10）加入DMEM5%至30ml。
（11）再培养48~72小时。
此时10ml培养液病毒量约为3×1010~3×1011。
若需要，进行MOI测定以估计病毒滴度。
注：此时如果病毒量已足够，则可立即进入病毒滴定步骤。
600×g离心5分钟收集细胞，弃上清，加入1/10原始体积的溶液重悬细胞。
-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，进行病毒滴定。
（12）移入50ml离心管中，台式离心机上最大速率离心10分钟，取出上清保存。
病毒感染细胞实验整体流程及原理
成都百美科生物QQ7742053病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒成都百美科生物QQ77420531.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
知识分享：腺相关病毒（AAV）表达系统
知识分享：腺相关病毒（AAV）表达系统【维真⽣物】提供AAV现货和AAV包装服务，已助⼒多位客户在顶级期刊发表⽂章。
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腺相关病毒安全操作规范1. 请在BL2⽣物安全⼆级⽣物安全柜中操作病毒。
2. 操作病毒和转染细胞时，请务必穿着实验服，佩戴⼝罩和⼿套。
3. 请⼩⼼操作，避免产⽣⽓雾或飞溅。
被病毒污染的超净⼯作台，请⽴即⽤70%⼄醇加1% SDS溶液擦拭⼲净。
接触病毒的枪头、离⼼管、培养板、培养液请使⽤新鲜配制的10％漂⽩粉进⾏消毒操作后丢弃。
4. ⽤显微镜观察细胞感染情况时，请先拧紧培养瓶或盖紧培养板，⽤70%⼄醇擦拭培养瓶外壁后，显微镜下观察拍照。
观察完毕，请⽤70%⼄醇再次擦拭显微镜实验台。
5. 离⼼病毒时，应使⽤密封性好的离⼼管，或⽤封⼝膜封⼝后进⾏离⼼，请尽量使⽤组织培养室内的离⼼机。
6. 实验完毕脱掉⼿套后，请⽴即⽤肥皂和⽔清洗双⼿。
个⼈保护措施1. 使⽤⼀次性⼿套。
2. 在注射病毒或是其后的解剖时，使⽤⼀次性⼿术服或是相当的⾐物，如果是感染细胞时，可以穿着实验服。
3. 佩戴护⽬镜或是⾯罩。
4. 所有的操作应当是在 Class II ⽣物安全柜中进⾏。
如果实验条件不能满⾜，则应当在空⽓稳定的空间中操作，减少操作时间和病毒与外界接触的时间。
不慎接触病毒时的急救1. 病毒飞溅或是⽓溶胶与⼈体接触–眼，⽪肤或是粘膜⽤⼤量清⽔冲洗眼睛或是其他接触的部位⾄少15 分钟。
腺病毒包装的原理和具体步骤及方法
腺病毒包装的原理和具体步骤及方法
腺病毒包装
1 特点：
1.1 几乎可以感染所有类型的细胞。
1.2 可以获得复制缺陷型（E1和E3缺失）的腺病毒。
1.3 病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效地进行增殖。
1.4 腺病毒载体感染宿主的范围比较广。
1.5 感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。
2原理：
腺病毒（Adenovirus，Ad）是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
3 腺病毒包装简要流程
3.1 含有目的基因的腺病毒穿梭载体的构建和质粒纯化提取。
注：客户也可以提供构建好的重组腺病毒穿梭载体。
3.2 穿梭载体与腺病毒骨架质粒重组及鉴定。
3.3 重组腺病毒质粒的酶切线性化。
3.3 线性化的重组腺病毒质粒转染包装细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
3.4 腺病毒扩增并纯化。
3.5 分装，- 80 oC保存。
3.6 滴度测定及无菌检测。
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测定腺病毒滴度（PFU）
空斑(Plaque)是病毒诱导的细胞裂解形成的点状物，可以通过显微镜和肉眼观察。
空斑形成单位(Plaque-forming unit, PFU)是单位体积的病毒形成的空斑数，是代表有活性的病毒粒子的浓度单位。
PFU测定方法如下：
293细胞铺于60 mm dish，24h后细胞密度接近100%后加入不同稀释度的病毒，37℃感染4~8h后，铺8 ml低熔点胶（10%FBS，1.25% Agarose）。
培养9~11天后对空斑进行计数来计算腺病毒滴度。
注：腺病毒滴度还可以通过观测荧光蛋白（若有）或者通过目的基因的WB、免疫荧光或免疫组化等方法测定。