微生物资源的开发与利用资料

微生物资源的开发与利用

摘要：微生物资源的开发利用前景将会在解决人类社会面临的人口剧增、资源匮乏、环境恶化问题和实现可持续发展等方面发挥不可替代的作用。本文综述了微生物资源以及其开发利用过程这两个方面。

关键词：微生物资源，放线菌，开发，利用

1.引言

当今，人类的工业是建立在化石能源基础之上的，而其特点必然要导致大量不可再生资源的消耗，大量温室气体的排放以及伴随着生态环境的破坏。导致人类社会面临着人口剧增、资源匮乏、能源危机、环境恶化等一系列问题，而人类又要求不停的发展，解决这些问题的关键在于寻求一条可持续发展的道路。

生物技术正在推动着以化石能源为基础的经济向以知识经济、循环经济为主的经济结构转型，是实现人类可持续发展的关键技术。因此大力发展生物技术对经济的发展以及人类社会的发展有着巨大而深远的影响，而作为生物技术的核心技术，微生物工程技术的发展将要涉及到微生物资源的开发与利用问题[1]。

微生物资源利用的核心是在于利用其产生的生物活性物质，目前，微生物活性物质绝大部分来源于普通环境中的微生物，因此从普通环境微生物中寻找新的活性物质难度越来越大。新的基因有很大的可能产生新的生物活性物质，因此通过寻找新的基因来寻找新的生物活性物质。基于该思路，稀有放线菌、海洋微生物、极端环境微生物等过去很少触及的微生物资源已越来越受重视[2]。

2.微生物资源

2.1微生物资源的特点

环境中存在着大量的微生物, 据估计, 每克土壤样品中可含有高达1000种不同的微生物[3], 这些微生物产生多种多样的活性物质(包括酶与次生代谢产物两部分) ,

对人类有实用意义的抗生素—青霉素、链霉素、抓霉素、金霉素、土霉素、红霉素、新霉家、万古霉素、庆大霉素等都是从微生物中发现并开发出来的; 基因工程中各种工具酶几乎都来自多种不同的微生物[4]

微生物是一类物种丰富的生物资源和基因资源，迄今为止我们所分离到的微生物主要有：真菌70000多种、细菌5000多种、放线菌3000多种。而这些人类所知道的微生物估计仅占自然界存在的微生物不到10%，而被利用的还不到1%。

微生物具有很快的生长繁殖速度，有的细菌的时代时间仅仅20分钟，而且微生物可以再人工控制的条件下大规模培养，并且几乎不受地域、气候等条件的影响。

相比于动、植物品种遗传基因结构，微生物的基因组小得多，基因拷贝数比较少，比较容易进行基因操作，微生物改良易于操作，改造性能、提高产率相对容易。

微生物资源丰富，微生物资源的开发与利用不会导致微生物物种的减少和环境的破坏。部分动植物资源的不合理开发利用导致物种的减少甚至灭绝，造成严重的环境的恶化和污染问题，而微生物资源的开发利用不会存在此类问题。但我们必须注意到并引起重视的现实问题是由于环境的改变和恶化，如原始森林开发成旅游区等现象，造成的天然微生物的破坏，使得许多在该类环境中赖以生存的微生物在人类还没有认识它之前就悄悄灭绝了[1]。

微生物资源是新抗菌剂的主要来源之一,然而即使采用先进的方法, 绝大部分微生物也仍然不可培养、只能用分子指纹图谱来描述[5]。

2.2稀有放线菌

目前大部分生物活性物质来自链霉菌，所以从链霉菌中发现性的活性物质的几率已经大大降低。自20世纪50年代以来, 已从部分稀有放线菌代谢产物中得到许多已经临床应用的重要活性物质, 如红霉素B、利福霉素、庆大霉素、其它放线菌素类、安莎类、肽类、酶抑制剂等活性物质。

尽管新的种、属不断被发现, 但据估计, 目前分离到的放线菌种类, 仅为实际存在种类的0.1%~1%。因此, 放线菌还有极其丰富多样的未知种群等待人们去发现

[6]。如日本Takahashi 等[7] 报道, 从不同的环境, 利用特殊的分离方法分离到放线

菌的新种、新属,并从这些放线菌发酵产物中得到许多新结构的活性物质。

2.3海洋微生物

海洋中蕴藏着巨大的微生物资源, 据估计其数量可达0.1亿~ 2亿种。迄今为止, 人类发现的微生物大约有150多万种, 除了712万种存在于陆地外, 其余都存在于海洋之中[8]。海洋微生物主要包括真核微生物( 真菌、藻类和原虫)、原核微生物( 海洋细菌、海洋放线菌和海洋蓝细菌等) 和无细胞生物( 病毒) [9]。海洋微生物因其独特的生存环境, 能够产生许多陆地微生物所不能产生的活性物质, 这对最终解决威胁着人类健康的许多重大疾病,如恶性肿瘤、糖尿病、艾滋病等具有重要的意义。

海洋的面积占地球面积的71%。海洋独特的自然条件: 高压、低营养、无光照、局部高温、高盐等, 使得海洋微生物具有特殊的代谢途径和遗传背景, 从而具有产生特殊结构和功能活性物质的能力。据研究发现, 约27%的海洋微生物都能产生抗菌活性物质[10]; 从海洋真菌分离出的次级代谢产物70%~ 80%具有生物活性[11]。许多海洋微生物能产生新结构的活性物质。Koyama 等[12]从一株未鉴定的海洋真菌中得到一种新的二萜: Phomactin H; Robert等[13]从海洋来源的真菌Aspergillus carneus 的代谢产物中分离到7种活性化合物, 其中5种是新化合物。目前, 在海洋微生物及其代谢产物中发现了许多特异、新颖、结构多样、陆地微生物很少产生的活性物质, 有些物质的结构类型在陆生生物中从未发现过, 因此海洋微生物成为又一个具有巨大开发潜力的天然药物宝库[13]。

2.4极端环境微生物

极端环境微生物能长期生长在高温、低温、极端高酸、高碱及高盐等极端特异环境中, 必然有其独特的基因类型、特殊的生理机制, 从而产生特殊的代谢产物。

普遍认为, 已知微生物资源的种类不过占实有种类的1% ~ 10%。甚至有人认为不到

0.1%, 极端环境的微生物资源更是知之甚少, 因此极端环境是发现未知微生物资源

的理想之地[5]。

近几十年来, 极端环境微生物的研究受到广泛重视, 通过对这些极端环境条件下的微生物的研究, 发现了大量。这些未知新种属的发现为寻找新的活性物质提供

了新的资源。随着各种技术、方法的改进和突破, 将有更多的极端微生物新物种被发现, 从而大大促进微生物药物的发展。

2.5内生菌和黏细菌

自20世纪70 年代从短叶红豆杉树皮中分离出具有抗癌活性的化合物紫杉醇( 世界上第一个年销售额超过10亿美元以上抗肿瘤药物[14]) 以来, 内生真菌的分离及其代谢产物的研究普遍受到重视。

内生真菌的代谢产物普遍具有一定的抗菌作用。而据估计植物内生真菌总数超过100 万种, 因此内生真菌资源极其丰富, 是新型药物的一个重要来源。目前除紫杉醇外, 从内生真菌中已分离到多种其他活性物质。如: 从P.microspora分离到的抗真菌剂ambuic acid[15]; 从T. wilfordii中分离到的免疫抑制剂Subglutinols A 和B[16]; 从C.quercina 分离到的肽类抗真菌剂cryptocandin, 已被几家公司开发为治疗真菌引起的皮肤和指( 趾) 甲病制剂[14]。除内生真菌外, 内生放线菌的研究也引起了研究者的极大兴趣, 我国云南大学微生物研究所已率先进行了这方面的研究工作, 目前工作进展顺利, 相信这将为我国微生物药物开发出新的重要资源[2]。

粘细菌在最近20多年中作为具有生物活性的天然产物的生产者, 越来越受到重视, 因其能产生各种有生物活性的新天然产物[17]。如由粘细菌纤维堆囊菌产生的聚酮类化合物埃波霉素( epothilone) , 有很好的抗微管解聚作用, 有望成为继紫杉醇之后的抗肿瘤药物, 目前这类化合物已在美国进行Ⅱ期临床试验;Kundim 等[18]从粘细菌Cystobacter fuscus中分离到3种具有抗真菌活性的多烯酰胺类新物质。由于粘细菌来源的化合物只占微生物来源化合物总数的5%, 因此它将成为越来越重要的天然小分子的产生者[17]。

3.微生物资源的开发与利用

3.1目的菌株的获得

微生物资源开发与利用的核心问题就是千方百计地尽早找到所需的目的微生

物，这是微生物开发利用成败的关键。生物工程的主体或核心部分是微生物工程，而微生物工程的核心是性能优良、高效的微生物菌株，再好的设想没有微生物这一主体也难以实现。因此，目的菌株的获得是微生物资源开发利用的第一步，也是最关键的一步。

获得目的菌株的主要渠道包括：向菌种保藏机构购买、自行分离获得目的菌。

目前国内外设立了许多微生物菌株的保藏机构，根据自己的开发意图，可以向有关菌株保藏机构购买实验菌株。自行分离寻找新的微生物是一项艰苦、细致的工作，建立准确、快速、简便的筛选模型，尽早淘汰非目的菌，加速筛选进程是微生物资源与利用的关键一步，筛选模型设计是微生物资源开发最活跃的领域，也是体现微生物工作者专业知识、实验技能以及头脑灵活性的一项工作，简便、有效的筛选方法，可以大大提高筛选获得目的微生物的几率。

在筛选目的微生物的过程中，要注意一菌多筛问题，这不仅增加了菌种的利用率和入选率，更重要的是有可能找到用途更大的非目的菌。同时，要注重高通量筛选（High throughput screening）、组合生化(Combinatorial Biochemistry)等新技术的使用，可以有效地提高工作效率和降低成本。[1]

3.2知识产权的保护

微生物资源开发与利用是竞争很激烈的领域，研究方案以及工作进展都是应该严格保密的内容，同时微生物资源开发包含重大的经济利益，也包含重大的投入和风险，为了保护自己的知识产权，在做好保密工作的同时，把握好申请专利的时机，及时申请专利是非常有必要的。

3.3目的菌种的改良

微生物资源的开发与利用在某种意义上讲是微生物天然功能在人工控制条件下，按照人的意志的重演和高效表达。通常获得的菌种目的物的产率都比较低，或者菌株的工艺性状有缺陷，如生长慢、斜面菌种的孢子少等等，需要对菌种进行改良。菌种改良的方法主要有传统的随机诱变法和基因工程手段等。传统的随机诱变法使菌种在理化因素处理以后发生基因突变，存优去劣，这是目前普遍采用的方法。

尽管这种方法与基因工程技术相比存在很大的盲目性、工作量大等不足，但其容易

实施，易见成效，目前对于工业微生物菌株改造而言，仍然是最有效的方法，当前发酵工业使用的优良的微生物菌株多数仍然是通过随机诱变手段获得的。

另一种菌种的改良途径就是基因工程技术的应用，通过研究目的物基因的结构及基因调空、表达方式，进行基因重组，使之高效表达，达到改良菌种提高目的物产量的目的，基因工程技术育种更具有目的性。人们所以重视基因工程技术是因为它可以像工程设计一样，在基因水平上采用与工程设计十分类似的方法按照人类的需要进行设计，按设计方案创建出具有某种新的性状的微生物菌株，并能使之稳定地遗传给后代。技术人员在掌握菌株代谢特性的基础上，可以充分发挥自身的聪明才智，构建目的菌的遗传基因改造思路，这样就有效地提高了获得优良菌株的几率。

目前基因工程技术已变成构建新型菌株的常规技术，在未来微生物资源开发与利用方面必将会发挥巨大的作用。

3.4菌株培养的优化、放大实验及工程化

优良的菌株性能是微生物工程技术的核心，而合理的培养基组成和控制条件是优良的菌株性能得以充分发挥的基础。微生物发酵过程是由一系列复杂的生物转化过程构成的，发酵过程机理复杂，受到众多因素的影响，目的产物的生产水平除受微生物菌株内部代谢机理、调控机制等影响外，还要受到外界环境(培养基组成、温度、pH值、溶解氧等)的影响。选育获得高产菌株以及菌株的生化特性确定以后，研究确定合理的培养基组成和适宜的发酵控制条件就成为实现规模化生产的关键。

放大实验或中试是微生物资源开发研究中非常重要的一个环节，其主要目的就是对前期实验室结果在发酵罐体系中进行验证和进一步探索确定生产过程的控制参数，对工艺条件进行优化、调整，使控制参数更接近于生产实际。发酵技术的放大问题涉及到的因素很多，多数情况下并不是简单的容积放大问题，但归纳起来发酵过程放大主要包括发酵条件的研究与确定和设计满足这些过程条件的生物反应器两个基本问题[19]。

微生物资源的开发利用工程化技术研究是决定其是否可以产业化的关键，工程化研究的主要原则是产业化过程中易于实现的原则，也就是实验室研究、放大实验研究结果在规模化生产中的再现，实施从原料到产品低成本、高效率生物转化的过程，主要包括产业化生产技术路线、装备及过程控制技术的确定等。

4.总结

人类大规模开发利用微生物资源的历史不长，但已取得了令人瞩目的成果，微生物资源开发利用的潜力仍然很大，前景十分广阔，任务也相当艰巨。随着微生物资源开发与利用研究的不断深入和新技术的发展，微生物资源的开发利用前景将会无法估量，微生物药物、微生物新型代谢产物、微生物治理环境污染等领域的发展，在解决人类社会面临的人口剧增、资源匮乏、环境恶化问题和实现可持续发展方面必将发挥不可替代的作用。

参考文献

［1］刘建军.浅谈微生物资源的开发与利用问题[ J ].山东食品发酵.2012,116:3-7.

［2］张炳火，方亮，李汉全等.微生物资源研究开发进展[ J ].国外医药抗生素分

册.2006,27(4):233-235.

［3］阎冰, 洪葵, 许云, 等.宏基因组克隆—微生物活性物质筛选的新途径[ J ].微生物学通报, 2005 ,32 (1 ) :113-117.

［4］周德庆. 微生物学教程[ M ].北京: 高等教育出版社, 1993 : 6-8.

［5］Keller M, Zengler K. Tapping into micr obial diversity [ J ] . Nat Rev Micro Biol, 2004, 2: 141-150.

［6］刘志恒, 姜成林. 放线菌现代生物学与生物技术[ M ] .北京: 科学出版社, 2004, 244.

［7］Takahashi Y, Omura S. Isolation of new actinomycete strains for the screening of new bioactive compounds [ J ] . J Gen Appl Microbiol, 2003, 49 ( 3) : 141-154.

［8］李艳华, 张利平. 海洋微生物资源的开发与利用[ J ]. 微生物学通报, 2003, 30( 3) : 113- 114.

［9］相建海. 海洋生物学[ M] . 北京: 科学出版社,2003.

［10］刘雪莉, 钱伯初.日本海洋天然活性物质研究简况[ J ] .中国海洋药物, 1997, 61 ( 1) :

45-49.

［11］刘全永, 胡江春, 薛德林. 海洋微生物生物活性物质研究[ J ] .应用生态学报, 2002, 13 ( 7) : 901-905.

［12］Koyama K, Ishino M, T akatori K, et al. Phomactin H, a novel diterpene from an

unidentified marine-derived fungus[ J ] . Tetrahedron Lett, 2004, 45: 6947-6948.

［13］Robert J, Capon A, Colin S A, et al. Aspergillicins A- E:five novel depsipeptides from the marine derived fungus Aspergillus carneus [ J ] . Org Biomol Chem, 2003, 1:1856-1862.

［14］Strobel G A.Endophytes as sources of bioactive products [ J ] .Microb Infect, 2003, 5:

535-544.

［15］Li J Y, Har per J K, Grant D M, et al. Ambuic acid, a highly functionalized cyclohexenone with antigungal activity from Pestalotiopsis spp.and Monochaetia sp [ J ] . Phytochemistry,2001, 56 ( 5) : 463-468.

［16］Lee J, Lobkovsky E, Pliam N B. Subglutinols A & B:immunosuppressive compounds from the endophytic fungus- Fusa ium subglutinans [ J ] . Org Chem, 1995, 60:7076-7077.

［17］Ger th K, Pr adella S, Perlova O, et al. Myxobacteria: proficient producers of novel natural products with various biological activities - past and future biotechnological aspects with the focus on the genus Sorangium [ J ] . J Biotech,2003, 106: 233-253.

［18］Kundim B A, Itou Y. Novel antifungal polyene amides from the myxobacterium Cystobacter fuscus : isolation, antifungal activity and absolute structure determination [ J ] .Tetrahedron, 2004, 60: 10217-10221.

［19］S. Parekh，V .A. Vinci，R. J. Strobel．Improvement ofmicrobial strains and fermentation processes[J]．Appl. Microbiol.biotechnol.，2000，54(3):287-301.

菌种诱变方法

微生物诱变育种的方法摘要:介绍了几种常用的物理诱变和化学诱变育种方法的原理、特点以及成功案例等,为微生物诱变育种提供了一个总体的方法框架。关键词:诱变; 微生物育种微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以选育优质、高产的微生物菌株十分重要。微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。作为育种途径之一的诱变育种一直被广泛应用。目前，国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。 1 物理诱变 1.1紫外照射紫外线照射是常用的物理诱变方法之一，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰260nm，因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。紫外辐射的作用已有多种解释，但比较确定的作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体[1]。二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对，所以可能导致突变甚至死亡[2]。马晓燕[3]等以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌株马克斯克鲁维酵母菌株ZR-20，比优化前的酒精产率提高10.5%，较出发菌株提高了68%。顾蕾[4]等通过紫外诱变红酵母ns-1原生质体，获得类胡萝卜素产量明显提高的突变株，其生物量、色素产量分别为6.15g/L、6.41mg/L，分别比原始菌株提高了67.6%、54.1%。紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到，且出现正突变的几率较高，酵母菌株的诱变大多采用这种方法。 1.2电离辐射 γ-射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用，可直接或间接地改变DNA结构。其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键。其间接效应是能使

微生物资源的开发与利用

微生物资源的开发与利用摘要：微生物资源的开发利用前景将会在解决人类社会面临的人口剧增、资源匮乏、环境恶化问题和实现可持续发展等方面发挥不可替代的作用。本文综述了微生物资源以及其开发利用过程这两个方面。关键词：微生物资源，放线菌，开发，利用 1.引言当今，人类的工业是建立在化石能源基础之上的，而其特点必然要导致大量不可再生资源的消耗，大量温室气体的排放以及伴随着生态环境的破坏。导致人类社会面临着人口剧增、资源匮乏、能源危机、环境恶化等一系列问题，而人类又要求不停的发展，解决这些问题的关键在于寻求一条可持续发展的道路。生物技术正在推动着以化石能源为基础的经济向以知识经济、循环经济为主的经济结构转型，是实现人类可持续发展的关键技术。因此大力发展生物技术对经济的发展以及人类社会的发展有着巨大而深远的影响，而作为生物技术的核心技术，微生物工程技术的发展将要涉及到微生物资源的开发与利用问题[1]。微生物资源利用的核心是在于利用其产生的生物活性物质，目前，微生物活性物质绝大部分来源于普通环境中的微生物，因此从普通环境微生物中寻找新的活性物质难度越来越大。新的基因有很大的可能产生新的生物活性物质，因此通过寻找新的基因来寻找新的生物活性物质。基于该思路，稀有放线菌、海洋微生物、极端环境微生物等过去很少触及的微生物资源已越来越受重视[2]。 2.微生物资源 2.1微生物资源的特点环境中存在着大量的微生物, 据估计, 每克土壤样品中可含有高达1000种

不同的微生物[3], 这些微生物产生多种多样的活性物质(包括酶与次生代谢产物两部分) , 对人类有实用意义的抗生素—青霉素、链霉素、抓霉素、金霉素、土霉素、红霉素、新霉家、万古霉素、庆大霉素等都是从微生物中发现并开发出来的; 基因工程中各种工具酶几乎都来自多种不同的微生物[4] 微生物是一类物种丰富的生物资源和基因资源，迄今为止我们所分离到的微生物主要有：真菌70000多种、细菌5000多种、放线菌3000多种。而这些人类所知道的微生物估计仅占自然界存在的微生物不到10%，而被利用的还不到1%。微生物具有很快的生长繁殖速度，有的细菌的时代时间仅仅20分钟，而且微生物可以再人工控制的条件下大规模培养，并且几乎不受地域、气候等条件的影响。相比于动、植物品种遗传基因结构，微生物的基因组小得多，基因拷贝数比较少，比较容易进行基因操作，微生物改良易于操作，改造性能、提高产率相对容易。微生物资源丰富，微生物资源的开发与利用不会导致微生物物种的减少和环境的破坏。部分动植物资源的不合理开发利用导致物种的减少甚至灭绝，造成严重的环境的恶化和污染问题，而微生物资源的开发利用不会存在此类问题。但我们必须注意到并引起重视的现实问题是由于环境的改变和恶化，如原始森林开发成旅游区等现象，造成的天然微生物的破坏，使得许多在该类环境中赖以生存的微生物在人类还没有认识它之前就悄悄灭绝了[1]。微生物资源是新抗菌剂的主要来源之一,然而即使采用先进的方法, 绝大部分微生物也仍然不可培养、只能用分子指纹图谱来描述[5]。 2.2稀有放线菌目前大部分生物活性物质来自链霉菌，所以从链霉菌中发现性的活性物质的几率已经大大降低。自20世纪50年代以来, 已从部分稀有放线菌代谢产物中得到许多已经临床应用的重要活性物质, 如红霉素B、利福霉素、庆大霉素、其它放线菌素类、安莎类、肽类、酶抑制剂等活性物质。尽管新的种、属不断被发现, 但据估计, 目前分离到的放线菌种类, 仅为实

微生物资源开发与利用

水产饲料微生物添加剂的主要菌种及其作用机理刘国迪生物工程2班20082720 水产饲料微生物添加剂因具有安全、环保、无副作用和抗病、促生长等特点，而受到广大学者的重视，并已从微生态学理论、作用机理、菌种的筛选及应用等多方面进行了大量的研究，取得了可喜的成果。作为抗生素类添加剂的替代品，水产饲料微生物添加剂在国内外都已得到广泛的应用，取得了非常理想的效果，是最有前途的水产饲料添加剂之一。水产饲料微生物添加剂属于微生态制剂或益生素的范畴。其研制开发以水产动物微生态学(包括微生态平衡理论，微生态失调理论，微生态营养理论和微生态防治理论)为理论依据，选用鱼虾类水产动物正常有益微生物菌种经培养、发酵、干燥、加工等特殊工艺而制成含有活菌并用于水产动物的生物制剂或活菌制剂。它是单一或复合的菌株，它能添加在水产养殖体系中或是直接用于水产动物。通过减少或者去除病原菌，提高宿主原有菌群特性，维持肠道微生物平衡，或通过提供维生素、蛋白质、酶、有机酸等物质，调节宿主免疫机能，降解饲料，达到防病、促生长、提高宿主存活率的目的。一、水产饲料微生物添加剂的主要菌种及其特性理想的水产饲料微生物添加剂的菌种一般应具备如下条件： 1、具有良好的安全性。所用菌种不会使人和动物致病，不与病原微生物在自然条件下产生杂交种。 2、易于培养，繁殖速度快。 3、有良好的定植能力，在低pH值和胆汁中可以存活，并能植入肠粘膜。 4、在发酵过程中能产生酸和过氧化氢等物质。 5、能合成对大肠杆菌、弧菌、气单胞菌等水产动物肠道致病菌的抑制物而不影响自己的活性，有利于促进宿主的生长发育及提高抗病能力。 6、应是宿主应用部位的常在菌，最好来自水产动物自身肠道中。 7、在整个制备和保存过程中能保持生命活力，经加工后存活率高，混入饲料后稳定性好。 8、有利于降低水产动物排泄物及残饵对水体环境的污染。目前用于水产饲料微生物添加剂的菌种主要是芽孢杆菌类、乳酸菌类、酵母菌类三大类。芽孢杆菌类(Racillus)用于饲料添加剂的芽孢杆菌是一种需氧的非致病菌。它在肠道或贮藏过程中都以内生孢子的形式存在，不消耗饲料养分，可保持饲料的质量。进入肠道后，在肠道上部迅速复活，复活率接近100%。它能使空肠内的pH值下降，氨浓度降低，并消耗大量的氧，维持肠道厌氧环境，抑制病菌的生长，维持肠道正常生态平衡，并有平衡和稳定乳酸菌的作用。它能产生活性很高的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多种氨基酸。芽孢杆菌抗逆性强，具有耐高温、耐酸碱、耐挤压等特点，可耐受颗粒饲料加工的影响。根据李卓佳等(2002年)对筛选的5株有益芽孢杆菌对温度、对虾饲料制粒工艺流程和pH值的耐受性试验表明，在对虾饲料中添加5株芽孢杆菌，经过整个生产工艺流程，制粒后饲料中芽孢杆菌存活95%，烘干后饲料中芽孢杆菌存活93%，损失率仅为5%和7%。将5株芽孢杆菌经低pH值2.2-4.6处理1小时，接种在pH值7.2的培养基上可以良好生长。另据有关资料报道，地衣芽孢杆菌内生芽孢可耐受121℃高温4-5分钟而保持活性。

微生物资源开发与利用实验指导(定)

微生物资源开发与利用实验指导适用于森林资源保护与游憩专业北京林业大学森林保护学科二零零二年8月实验一培养基的配制及灭菌培养基是人工配制的适于微生物生长、繁殖或保存的营养基质。培养基的种类繁多，但一般应具备以下几个条件：1.含有适宜的碳源、氮源、无机盐类、生长因素等营养成分；2.含有适量的水分；3.适宜的酸碱度。根据培养基的成分来源不同可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基。环境微生物学中，常用废水或废水补加少量氮、磷等无机盐来培养微生物，可认为是天然培养基或半合成培养基。根据培养基的物理性状可分为液体、固体和半固体培养基。液体培养基中加一定量的凝固剂（常加琼脂 1.5—2%）。溶化冷凝后即成固体培养基。半固体培养基含琼脂0.2—0.5%。某些工农业生产废渣及生活废渣可视为天然的固体培养基。根据培养基的特殊用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。选择培养基在环境微生物学中应用较广，它是根据待培养微生物的特殊营养要求或生物特征而设计的培养基，利用这种培养基可将所需要的微生物从环境混杂的微生物中分离出来。如以石油作碳源的培养基可以分离到降解石油的微生物；以纤维素为唯一碳源的培养基可以分离到纤维素分离菌。本实验介绍培养基配制及灭菌的一般原则和方法步骤。培养基配制的方法和步骤 1.称量：先按配方计算培养基各成分的需要量，称量时用1/100粗天平即可。在烧杯或搪瓷杯中先放少量水，依次加入培养基各组分，溶解后补足至所需的总水量。对于肉膏之类

粘、胶状物，可盛在小烧杯或表面皿内称量，以便用水移入培养基中。蛋白胨等极易吸潮物质，在盛取时应动作迅速。某些无机盐类如磷酸盐和镁盐相混合时易产生沉淀，必要时应分别灭菌后再混合。此外，生长因素及微量元素等成分因用量极少，可预先配成较浓的储备液，使用时按要求取一定量加入培养液中即可。 2.溶化：各成分必须溶解在培养液中。最好溶解一种组分后，再加第二种，有时需要加热使其溶解。如果配方中有淀粉，则应先将其用少量冷水调成糊状，再兑入其他已溶解的成分中，边加热边搅拌，至完全融化即溶液由混浊转为清亮后，补水至所需总量。溶化琼脂时，应注意控制火力使不至溢出或烧焦，并要不断搅拌。因加热过程中水分损耗较多，最后应补足至原体积。根据需要，有时需将溶化后的培养基用脱脂棉或纱布过滤，已使培养基清亮透明。 3.调pH值：以10% HCI或10% NaOH调节培养基至所需pH值。一般用广泛pH试纸矫正，必要时亦可用酸度计。调时需注意逐步滴加，勿使过酸或过碱而破坏培养基中某些组分。 4.分装：将矫正pH后的培养基按需要趁热分装于三角瓶或试管内，以免琼脂冷凝。分装时应注意勿使培养基粘附于管口与瓶口部位，以免沾染棉塞而滋生杂菌或影响接种操作。可以通过下边套有橡皮管及管夹的普通漏斗进行分装。分装量视需要而定。一般分装入三角瓶以不超过其容积的一半为宜。分装试管时，斜面培养基以试管高度的1/5左右为宜，半固体培养基以试管高度的1/3左右为宜。 5.加棉塞：试管和三角瓶口需用棉花堵塞，主要目的是过滤除菌，避免污染。做棉塞所用的棉花应是普通长纤维棉花，不要用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水变湿而滋长杂菌。棉塞制作方法有多种，主要的要求是不宜过松或过紧，应宜塞拔方便而又不易脱落为准。正确的棉塞其头部应较大，约有1/3在试管外，2/3在试管内（示范），试管以内部分不应有缝隙。 6.灭菌：在装培养基的三角瓶或试管的棉塞外面包一层牛皮纸，即可灭菌。应用铅笔注明培养基名称、配制日期等。如制斜面培养基时，灭菌后趁热将试管斜放（示范），注意勿使培养基沾染棉塞。如制平板培养基时，灭菌后待培养基温度降至50℃左右时以无菌操作将培养基倒入无菌培养皿内，每皿约15-20ml，平放冷凝即成平板培养基，简称平板。若制半固体深层培养基，灭菌后垂直放置，冷凝即成。二、灭菌与消毒灭菌指杀死或消灭所有微生物体。消毒则是指破坏或消灭病原微生物，只能杀死微生物的营养细胞，而不能杀死全部芽孢。灭菌与消毒的方法很多，可概分为物理和化学的两类。如湿热灭菌、间歇灭菌、煮沸消毒、干热灭菌、紫外线灭菌和化学灭菌与消毒等。实验室常用的方法介绍如下。高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌是一种湿热灭菌法。在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时，湿热的穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触冷凝成水时，又可放出热量，使温度迅速升高，从而增加灭菌效力；另一方面，随着压力增高，达到饱和蒸汽时所具有的温度也高。这样，高压蒸汽灭菌时微生物体受热、湿及压力的作用而被杀死。由于高压蒸汽灭菌具有灭菌效果好，适用面广的特点，因此，是实验室最常用的消毒灭菌方法。适于消毒在高温高压下不易分解变压的培养基。将配制好的培养基放入高压蒸汽灭菌锅中，使其压力增至15磅后/吋2(相当于121℃)。维持半小时。即可达到灭菌目的。高压蒸汽灭菌器分为立式，卧式及手提式等几种。但原理都是相同的，使用时必须注意以下几点： 1.使用前必须首先注意将器内加入足够的水。 2.将需要灭菌的器物放在灭菌器中，将盖密闭，打开气门。 3.加热，待器内冷空气完全排除后（蒸汽从气门有力地冲出），才可关闭气门，因为空气本身有压力，如不完全赶出，则压力表上所指示的压力便不准确，达不到灭菌要求。 4.当压力上升到所需要的指标后，开始计算时间，灭菌过程中保持压力不变。 5.达到需要灭菌时间后，停止加热，使器内压力自然下降，如欲使压力下将快些，可将气门稍稍打开，使蒸汽徐徐放出（愈慢愈好），切勿将气门立即全部打开放气，不然因器内压力骤然降低，引起瓶内和管内的培养基沸腾外溢，沾污棉塞，不但增加以后操作的困难，而且培养基也易污染。

微生物资源的开发与利用

对人类有实用意义的抗生素—青霉素、链霉素、抓霉素、金霉素、土霉素、红霉素、新霉家、万古霉素、庆大霉素等都是从微生物中发现并开发出来的; 基因工程中各种工具酶几乎都来自多种不同的微生物[4] 微生物是一类物种丰富的生物资源和基因资源，迄今为止我们所分离到的微生物主要有：真菌70000多种、细菌5000多种、放线菌3000多种。而这些人类所知道的微生物估计仅占自然界存在的微生物不到10%，而被利用的还不到1%。微生物具有很快的生长繁殖速度，有的细菌的时代时间仅仅20分钟，而且微生物可以再人工控制的条件下大规模培养，并且几乎不受地域、气候等条件的影响。相比于动、植物品种遗传基因结构，微生物的基因组小得多，基因拷贝数比较少，比较容易进行基因操作，微生物改良易于操作，改造性能、提高产率相对容易。微生物资源丰富，微生物资源的开发与利用不会导致微生物物种的减少和环境的破坏。部分动植物资源的不合理开发利用导致物种的减少甚至灭绝，造成严重的环境的恶化和污染问题，而微生物资源的开发利用不会存在此类问题。但我们必须注意到并引起重视的现实问题是由于环境的改变和恶化，如原始森林开发成旅游区等现象，造成的天然微生物的破坏，使得许多在该类环境中赖以生存的微生物在人类还没有认识它之前就悄悄灭绝了[1]。微生物资源是新抗菌剂的主要来源之一,然而即使采用先进的方法, 绝大部分微生物也仍然不可培养、只能用分子指纹图谱来描述[5]。 2.2稀有放线菌目前大部分生物活性物质来自链霉菌，所以从链霉菌中发现性的活性物质的几率已经大大降低。自20世纪50年代以来, 已从部分稀有放线菌代谢产物中得到许多已经临床应用的重要活性物质, 如红霉素B、利福霉素、庆大霉素、其它放线菌素类、安莎类、肽类、酶抑制剂等活性物质。尽管新的种、属不断被发现, 但据估计, 目前分离到的放线菌种类, 仅为实际存在种类的0.1%~1%。因此, 放线菌还有极其丰富多样的未知种群等待人们去发现 [6]。如日本Takahashi 等[7] 报道, 从不同的环境, 利用特殊的分离方法分离到放线菌的新种、新属,并从这些放线菌发酵产物中得到许多新结构的活性物质。

微生物资源开发与利

土壤微生物资源开发与利用摘要:从土壤微生物生态和资源开发利用、土壤生物化学、生物固氮、土壤微生物多样性和应用现代生物技术手段实现土壤微生物资源的生理活性物质的开发研究及其产业化等方面,阐述了我国土壤微生物研究成就,今后在这一领域的研究和发展方向,主要涉及到微生物资源的认识、特点、开发与利用步骤以及微生物资源开发利用的重大研究课题等内容。关键词：土壤微生物；资源；开发利用；前景展望前言：微生物是一类重要的自然资源。微生物资源的开发利用已产生了巨大的社会和经济效益。微生物生产的青霉素是20世纪重大的发明之一,她带动了其它抗生素及生物活性物质的寻找和发现,促使抗生素工业的形成。目前全世界青霉素的年产量达5万吨左右。制剂产值约40亿美元。青霉素和其他抗生素对人类保健事业的贡献,无论怎样形容都不为过。我们很难想象,没有青霉素类药物,世界将是什么样子。但是,我们不能不看到,对微生物资源的重要性的认知远远不及对动植物资源那样普及,保护微生物资源的意识更是和者甚寡。 1.中国土壤生物学的主要研究内容与进展 1.1土壤微生物多样性土壤具备微生物生活所需的各种条件,是微生物生活和繁殖的良好场所。土壤中广泛分布着数量众多的微生物,重要的类群有细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物。土壤微生物多样性包括物种多样性、遗传多样性和生态系统多样性,其与土壤中的主要生态过程与功能密切相关。中国的土壤微生物学多样性研究早期主要借助于平板培养方法,通过对微生物区系分析反映土壤微生物与土壤肥力之间的关系Biolog微平板法是20世纪90年代建立起来的一套用于研究土壤微生物群落结构和功能多样性的方法,这种方法是根据微生物对单一碳源底物的利用能力的差异,来表征土壤微生物代谢功能多样性或结构多样性一种方法。采用Biolog体系能够较好地评价我国不同耕地、草地、森林等土壤中的微生物群落结构[1]。随着分子生物技术的广泛引入,通过非培养方法研究土壤微生物多样性的报道不断增加,这些方法包括磷脂脂肪酸)方法、脂肪酸甲酯方法、限制性片段长度多态性方法[2]以及DGGE/TGGE方法等,通过这些方法已经揭示出土壤环境中存在高度的微生物多样性。我国作为世界微生物资源大国,微生物资源开发利用具有重要的科研和经济价值。在根结线虫生防真菌、有机污染物降解微生物、根瘤菌、黏细菌、放线菌等方面均开展了大量的研究,分离、筛选出一批重要的微生物菌种资源。近年来,国家科技部启动“环境微生物菌种资源整理、整合”项目,必将极大地推动微生物资源开发的进程[3]。 1.2微生物资源的特点物种繁多:迄今我们所认识的真菌达7万多种,细菌5,000多种,放线菌3,000多种。可见,微生物是一类物种丰富的生物资源和基因资源。生长繁殖速度极快:有的细菌繁殖一代,仅需20min。由于这一特点,微生物产品可以在人工控制条件下,实现大规模生产。这是目前栽培的任何农作物都无法比拟的。比较容易大幅度提高产率:相对而言,微生物的基因组小得多,

微生物诱变育种研究进展

微生物诱变育种研究进展摘要：本文综述了国内外微生物诱变育种领域的研究新进展，对生物学效应及诱变微生物的机理进行了总结。从物理诱变、化学诱变及复合诱变三个方面介绍了诱变效应、作用机制及在实践中的应用，并对微生物诱变育种的研究进展进行了概述。关键词：微生物；诱变育种；机制；研究进展常规的诱变育种方法主要为物理诱变育种和化学诱变育种。微生物的诱变育种，是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异菌体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并且找出发挥这个突变株最佳培养基和培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产物。以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种，具有速度快、收效大和方法简单等优点，是菌种选育的1个重要途径，在发酵工业菌种选育上具有卓越的成就，迄今为止国内外发酵工业中所使用的生产菌种绝大部分是人工诱变选育出来的。诱变筛选方法相对简便，是菌种选育的基本、常规和经典方法。特别是对遗传背景不很清楚的对象，诱变育种更是必不可少。近年来，随着新诱变因子的不断发现和筛选体系的进一步完善，微生物诱变育种有了长足的发展。 1 微生物诱变育种的作用从自然界分离的野生菌种，不论是在产量上还是在质量上，均难适合工业化生产的要求。理想的工业化菌种必须具备遗传性状稳定、纯净无污染、能产生许多繁殖单位、生长迅速、能于短时间内生产所要的产物、可以长期保存、能经诱变产生变异和遗传、生产能力具有再现性、具有高产量和高收率等特性。微生物发酵工业中，诱变育种主要有以下作用: 提高有效产物的产量；改善菌种特性，提高产品质量；简化工艺条件；开发新品种，产生新物质；用于研究推测产物的生物合成途径；与其他育种方法相结合[1]。 2诱变育种的过程诱变育种包括三个重要环节：突变的诱发、突变株的筛选突变基因的表达。 2.1突变的诱发突变的诱发受到菌种的遗传特性、诱变剂、菌种的生理状态以及诱变处理时环境条件的影响。出发菌株就是用来进行诱变试验的菌株。出发菌株的选择是诱变育种工作成败的关键。功的经验。诱变作用不但决定于诱变剂，还与出发菌株的遗传背景有关。菌种的生理状态、被处理菌株诱变前的预培养和诱变后的培养条件以及诱变处理时的外界条件等都会影响诱变效果。

2微生物的诱变育种

微生物的诱变育种一、教学目标及基本要求： 1. 理解诱变剂对微生物的杀菌和诱变双重生物学效应； 2. 学习紫外线诱变的方法和测定诱变剂最适剂量的方法。二、实验原理紫外线的生物学效应主要是它能引起DNA结构的变化而造成的。紫外线具有杀菌和诱变双重生物学效应，随着紫外线照射时间的增加，杀菌率和突变率随之提高。但当照射时间延长到某一程度时，继续延长照射时间，其杀菌率虽然增加，突变率却下降。紫外线的强度单位(剂量)为尔格/mm2，由于测定困难，在实际诱变育种中，常用紫外线照射时间或细胞的死亡率表示相对剂量，其中以细胞死亡率表示具有实际意义。本实验以枯草芽孢杆菌为出发菌株，以营养缺陷的突变作为诱变效应的指标，测定紫外线诱变剂的最适剂量。以照射时间为横坐标，以细胞存活率或死亡率和突变率为纵坐标作图，突变率最高值相对应的照射时间即为最适剂量。三、实验材料 1. 菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 2. 培养基肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1），细菌基本培养基（附录Ⅱ-1.9） 3. 其它生理盐水，诱变箱，磁力搅拌器，涂布棒，离心管，离心机，培养皿等。四、方法与步骤 1. 菌体的培养取斜面菌种1环，接种于盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)16~18h。取1ml培养液转接于另一只盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)6~8h。 2. 细胞悬浮液的制备取10ml培养液，3500/min离心10min，收集菌体，沉淀用10ml 生理盐水洗涤离心2次，之后将菌体充分悬浮于12ml生理盐水中。 3. 活菌计数法测定细胞悬浮液的浓度取1ml细胞悬浮液，逐步稀释为10-1、10-2、10-3……。取最后3个稀释度的菌液各1ml，置于无菌空平皿中，然后倾注15ml融化并冷却至45~50℃的肉汤固体培养基，轻轻充分混匀，凝固后于37℃倒置培养1~2天，计数每皿的菌落数（每个稀释度作三个平行）。按下式计算每毫升细胞悬浮液菌体的浓度（N0）。菌体浓度(个/ml) = 菌落数(按杂菌总数计数原则)×稀释倍数 4. 诱变处理 (1) 取10ml菌液于φ90mm的培养皿中（带有磁棒），将皿放置于诱变箱内的磁力搅拌器上。 (2) 开启紫外灯，预热20min，开启磁力搅拌器，打开皿盖，分别照射15、30、45、60、75、90s。 (3) 取不同时间诱变处理的菌液1ml，以肉汤固体培养基平板，按照上述菌落计数的方法进行适当稀释后，采用肉汤固体培养基倾注法测定处理液中存活的细胞浓度（每个照射剂量做三个稀释度，每一稀释度平行做三个平皿）。将结果填入表1。表1 紫外线对枯草芽孢杆菌存活率的影响

微生物的化学诱变技术

微生物的化学诱变化学诱变：利用化学物质对微生物进行诱变，引起基因突变或真核生物染色体的畸变称为化学诱变。化学诱变的物质很多，但只有少数几种效果明显，如烷化剂、吖啶类化合物等。复合处理及其协同效应：诱变剂的复合处理常有一定的协同效应，增强诱变效果，其突变率普遍比单独处理的高，这对育种很有意义。复合处理有几类：同一种诱变剂的重复使用，两种或多种诱变剂先后使用，两种或多种诱变剂同时使用。定向培育和驯化：定向培育是人为用某一特定环境条件长期处理某一微生物群体，同时不断将他们进行移种传代，以达到累积和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。由于自发突变的变异频率较低，变异程度较轻，故变异过程均比诱变育种和杂交育种慢得多。微生物化学诱变的操作过程化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。化学诱变剂都具毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，移取液体时绝对禁止直接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全，也要防止污染环境，造成公害。一、碱基类似物用于诱发突变的碱基类似物有5-BU、5-FU、BUdr、5-IU等他们是胸腺嘧啶的结构类似物，AP、6-MP是腺嘌呤的结构类似物。最常用是5-BU和AP。当将这类物质加入到培养基中，在繁殖过程中可以掺入到细菌DNA分子中，不影响DNA的复制。它们的诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变，困此，也叫掺入诱变剂。显然这一类诱变剂要求微生物细胞必顿处在代谢的旺盛期，才能获得最佳的诱变效果。（一）碱基类似物的诱变机制正常的碱基存在着同分异构体，互变异构现象在嘧啶分子中以酮式和烯醇式的形式出现，而嘌呤分子中以氨基和亚氨基互为变构的形式出现、一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA碱基中频率更高。 5-BU导致A:T碱基对转换为G:C碱基。 2-氨基嘌呤也可以诱发DNA分子中A:T－G:C或G:C－A:T的转换。（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例） 1．单独处理将微生物液体培养到对数期，离心除去培养液，加入生理盐水或缓冲液，饥饿培养8~10 h，消耗其体内的贮存物质、将5-BU加入到经饥饿培养的培养液中，处理浓度为25~40 μg/mL，温合均匀，取0.1~0.2 mL菌悬液加入到琼脂培养基上涂布培养。在适宜温度下，使之在生长过程中诱变处理。培养后挑取单菌落，进行筛选。如果是处理真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度，常处理浓度为0.1 mg/mL。