替尼泊苷长循环阳离子脂质体的制备

替尼泊苷长循环阳离子脂质体的制备钟琳;楼兴法【摘要】目的优化薄膜分散法制备替尼泊苷长循环阳离子脂质体的最佳处方.方法薄膜分散法制备脂质体,以粒径和包封率为考察指标,用单因素考察和正交设计等方法优化脂质体的处方.结果优化后的最佳处方为:磷脂DSPC和PEG 5000-DOT-MA比为4:1,药物和磷脂比为1:4,磷脂与胆固醇比为2:1,乳化剂为卵磷脂.优化的脂质体平均粒径为115.45nm,平均Zeta电位为25.54 mV,平均包封率为91.32%,5±3℃放置180 d和25±2℃放置30 d各项指标变化不显著.结论制备的替尼泊苷长循环阳离子脂质体包封率高,粒径小,释放缓慢,稳定性和安全性好.%Objective To optimize the formulation of long-circulating cationic teniposide-containing liposomes .Methods The long-cir-culating cationic teniposide-containing liposomes were prepared by thin film dispersion method .Single factor experiment and or-thogonal design were adopted to screen the formulation .Results The ideal combination of formulation was as follows :DSPC-PEG 5000-DOTMA (4:1);teniposide-phospholipid(1:4);phospholipid-cholesterol (2:1);lecithin as an emulsifier with purity of 80% .The average particle size of the optimized long-circulating cationic teniposide-containing liposomes was 115 .45 nm (n=3) , and the average Zeta potential was 25 .54 mV (n=3) ,and the average encapsulation efficiency was 91 .32% (n=3) .The tenipo-side-containing liposomes were quite stable after being stored in 5 ± 3 ℃ for 180 d and 25 ± 2 ℃ for 30d .Conclusion The opti-mized ,sustained release long-circulating cationicteniposide-containing liposomes with satisfied size and high entrapment efficiency were obtained ,which was safe and stable .【期刊名称】《西北药学杂志》【年(卷),期】2017(032)006【总页数】4页(P771-774)【关键词】替尼泊苷;长循环阳离子脂质体;薄膜分散法;磷脂;卵磷脂;胆固醇【作者】钟琳;楼兴法【作者单位】杭州市萧山中医院药剂科,杭州 311200;杭州市萧山中医院药剂科,杭州 311200【正文语种】中文【中图分类】R944替尼泊苷具有较强的广谱抗肿瘤活性，用于治疗白血病、恶性淋巴瘤、中枢神经系统肿瘤等，具有脂溶性大、易透过血脑屏障和毒性低等特点[1]。

但其溶解性极差，生物利用度低，大大限制了其在临床上的应用。

目前上市的有注射液，但其处方中用到的表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油致敏性极高；该注射液使用时需要根据不同的治疗周期配制多个不同浓度的稀释溶液，且静脉输注频繁，周期长，配制的稀释静脉输注液还易产生沉淀，存在的这些安全隐患既给医护人员带来心理压力，也给患者带来意外的危险[2]。

长循环脂质体[2-4]可有效减少不良反应，能提高药物的靶向性、生物利用度和治疗指数。

本文采用薄膜分散法[5-6]，通过考察磷脂种类、不同的磷脂比、乳化剂种类和投入量、药脂比、磷脂与胆固醇比等因素，筛选出最优处方。

1.1 仪器 RV8旋转蒸发仪(IKA®)；JY92-ⅡN超声波细胞粉碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Nano ZS90纳米粒度及Zeta电位仪(英国马尔文公司)；Optima XPN-100 Uitracentrifuge(美国贝克曼库尔特公司)；德国Dionex-U3000液相色谱系统(DionexChemeleon色谱工作站，DAD检测器，美国戴安公司)；224-1CN电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)；α1900S紫外分光光度计(上海谱元仪器有限公司)；TGL-16M台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)。

1.2 试药替尼泊苷(江苏亚邦药物研发有限公司，批号140719，质量分数98%以上)；二油酰磷脂酰胆碱DOPC,二硬脂酰基卵磷脂DSPC，聚乙二醇5 000-N-[1-(2，3-二油酰氯)丙基]-N，N，N-氯化三甲胺PEG5 000-DOTMA，聚乙二醇5 000-二肉豆蔻甘油丝氨酸PEG5 000-DMGS，卵磷脂(质量分数80%)和胆固醇(均为上海艾韦特医药科技有限公司惠赠)；聚氧乙烯蓖麻油，波洛沙姆188(GATTEFOSSE公司惠赠)；色谱纯：三氯甲烷、乙醇(天津市富起化工有限公司)；水为纯化水；其余药品、试剂均为分析纯。

2.1 脂质体的制备称取处方量的替尼泊苷、磷脂和胆固醇，用三氯甲烷10 mL溶解，转移至250 mL圆底烧瓶中，在提前准备好的50 ℃的恒温水浴锅中减压蒸去三氯甲烷，得到一层均匀薄膜，加入含有乳化剂的PBS缓冲液(pH值为7.40) 5 mL，恒温水浴锅中振荡水化30 min，形成乳白色溶液，探头超声(功率为30%)，超声10 min(超声10 s停10 s)[7-9]，得到粒径较小的纳米脂质体溶液。

2.2 脂质体包封率的测定文献主要采用HPLC或HPLC-MS/MS等方法测定的替尼泊苷的质量浓度[10-11]，为了实验操作方法的适用性和方便性，本文采用UV 法测定替尼泊苷的质量浓度[12]。

2.2.1 检测波长的选择分别精密量取适量空白脂质体和替尼泊苷各50 mg，分别置于50 mL量瓶中，用氯仿溶解，吸取1 mL，置于10 mL 量瓶中，用乙醇定容待用。

以乙醇为参比，扫描显示在波长220 nm 处有紫外吸收，空白脂质体无干扰。

2.2.2 标准曲线的建立精密称取替尼泊苷100 mg，加适量氯仿超声溶解并定容至50 mL，作为储备液，精密量取一定量储备液，用甲醇稀释并分别配制质量浓度为1，10，20，50，100和150 μg·mL-1的标准溶液，分别测吸光度值，以吸光度值对质量浓度作图，得标准曲线方程，结果表明，质量浓度在1～150 μg·mL-1范围内，吸光度值和质量浓度线性关系良好。

2.2.3 精密度精密称取原药50 mg，加适量氯仿超声溶解并定容至50 mL，作为储备液，精密量取一定量储备液，用乙醇稀释并分别配制成质量浓度为80，100和120 μg·mL-1的溶液，各质量浓度平行3个样品，各样品测3次。

测得平均质量浓度分别为80.25(RSD值为0.125%，n=9)，100.14(RSD值为0.153%，n=9)和120.04 μg·mL-1(RSD值为0.160%，n=9)。

2.2.4 回收率精密称取原药50 mg，用空白脂质体溶液定容至50 mL，混匀，取1 mL，3份，用适量氯仿溶解，加乙醇定容至20 mL量瓶中，测吸光度值，平均回收率为96.38%，RSD值为0.52%(n=9)，表明空白脂质体无干扰。

2.2.5 超滤离心法精密称取载药脂质体溶液适量，以15 000 r·min-1离心20 min，弃去上清液，用少量氯仿溶解离心沉淀物[13-14]，用乙醇定容，测吸光度值，用标准曲线方程计算药物质量浓度，计算公式为:包封率=(1-M1/M2)×100%(M1为沉淀物游离药物的量，M2为载药脂质体总药物量)。

2.3 体外释放实验将半透膜在水中浸泡过夜，取游离药物的PBS缓冲液或脂质体溶液各1 mL，分别加入2个透析袋中，两端夹紧，置于100 mL PBS (pH值为7.40) 缓冲液中，37 ℃恒温水浴，转速为50 r·min -1，分别于0，2，4，8，12，24，36，48和72 h取样0.5 mL，及时补充0.5 mL PBS缓冲液，0.2 μm滤膜过滤样品，测定不同时间段样品的药物含量。

2.4 脂质体粒径和电位测定吸取适量纳米脂质体溶液，用水稀释10倍，加入到检测仪的石英比色皿和毛细管小池中，测定粒径大小、分布及Zeta电位。

2.5 稳定性实验将纳米脂质体溶液分别放置在2～8 ℃冰箱和25±2 ℃恒温箱中，分别于0，3，6个月和0，2，4周取样，观察样品的外观形状并测定平均粒径及分布、Zeta电位、pH值、包封率及渗漏率的变化情况。

2.6 影响脂质体的处方因素考察2.6.1 磷脂种类的影响考察的磷脂为中性磷脂DOPC、DSPC、阳离子磷脂PEG5 000-DOTMA和阴离子磷脂PEG5 000-DMGS，按照2.1项下方法改变磷脂种类制备脂质体，药物投料为50 mg，胆固醇50 mg，质量分数80%的卵磷脂30 mg(乳化剂)，选取的方案为：①150 mg HSPC；②150 mg DOPC；③120 mg HSPC+30 mg PEG 5 000-DOTMA；④120 mg DOPC+30 mg PEG 5 000-DOTMA；⑤120 mg HSPC+30 mg PEG 5 000-DMGS；⑥120 mg DOPC+30 mg PEG 5 000-DMGS。

6组分别进行实验，将制备好的纳米脂质体溶液放置在25±2 ℃恒温箱中，1周后取样，平均粒径分别为485.41，467.54，128.84，207.80，341.25和327.28 nm；包封率分别为40.56%，45.65%，87.87%，73.60%，63.77%和65.21%。

由此可知，由中性磷脂制备出的脂质体样品①和样品②稳定性很差，平均粒径较大，包封率很低，肉眼可见样品底部有大量白色沉淀物，脂质体溶液分层很厉害，由中性磷脂加阴离子磷脂制备的脂质体样品⑤和样品⑥次之，中性磷脂加阳离子磷脂制备的脂质体稳定性较好，其中样品③的脂质体稳定性最好，因此选用中性磷脂[15]HSPC加少量阳离子磷脂PEG5 000-DOTMA 的混合磷脂作为最优磷脂。