第八章+转基因动物

PCR反应
PCR技术就是在体外通过酶促反应或自发地扩增 一段目的基因的技术。 PCR要求反应体系具有以下条件： 1、要有与被分离的目的基因两条链各一端序列相 互补的DNA引物(约20个碱基左右)； 2、具有热稳定性的酶如Taq DNA聚合酶； 3、4种dNTP； 4、作为模板的目的DNA序列。 PCR反应可扩增出100～5000bp的目的基因。
正负选择法
10.2转基因动物
10.2.1转基因小鼠 的制备方法 10.2.2转基因动物 的应用价值
10.2.1转基因小鼠的制备方法
1974年，Jaenish 和Mintz应用显微注 射法，在世界上首次 成功地获得了SV4ODNA转基因小鼠 。 Palmiter等人于 1982年将大鼠的生长 激素基因导入小鼠受 精卵的雄原核中，转 基因动物技术轰动了 整个生命科学界。
脂质体（liposome）介导的基因转移
脂质体（人工生物膜）是一种内部包装DNA的 球状磷脂双分层膜结构，能与细胞膜融合将 DNA送入细胞的。 优点脂质体介导转染法简便易行，成本适中， 具有较高的转染率和较小的细胞毒性。 转染步骤：1. 制备DNA/脂质体复合物；2. 然后DNA/脂质体复合物与培养细胞作用2小 时左右，就可望实现DNA导入受体细胞。3.筛 选。
cDNA法
由于真核生物的mRNA具有poly A这一结构 特点，可以用结合长度大约为15bp的短链多 聚DT的纤维素填充的柱子，根据碱基配对原则， 将其吸附，从真核细胞的总RNA中提取出来， 再用能打断A-T氢键的缓冲液洗脱。
cDNA法
得到纯化的mRNA后， 再利用逆转录酶和DNA 聚合酶I，缓冲液和4种脱 氧核糖核苷三磷酸及短的 oligo（dT）分子作为引 物，合成cDNA。 然后，采用DNA杂交或 免疫分析的方法来筛选目 的基因
10.1.2几种有效的转基因方法
基因转移（transgenosis）是借助于物理、化学或 生物的手段将外源基因导入受体细胞，并检查其在该 细胞内表达情况的一种技术，是细胞工程中一项重要 而应用广泛的技术。 转化(Transformation )指质粒DNA或以它为载体 构建的重组DNA导入细菌的过程 。（用于原核生 物 ）。 转染 (Transfection) (用于真核生物 )指病毒或细 菌以其为载体构建的重组子导入真核细胞的过程 转导(transduction)是指通过病毒将一个宿主的 DNA转移到另一个宿主的细胞中而引起的基因重组现 象。 。
λ噬菌体
λ噬菌体染色体是长约49kb的双链DNA，该 DNA的两个5’末端都是由12个bp组成的单链互补 粘性末端，当λ噬菌体DNA进入宿主细胞后，这两 个粘性末端互相结合，在连接酶作用下封闭成环。 在λ噬菌体基因组中位于左边的基因（A-J）编码 噬菌体头部和尾部的蛋白质；中间的基因（J-N） 与重组和生长过程有关，但与裂解生长过程无关， 因此对裂解生长过程来说，中间区的DNA是非必 需的，可以被缺失或置换，因此可以在这个区域克 隆外源DNA；右边的基因涉及λ基因的表达、调节、 DNA合成晚期功能调节以及宿主细胞裂解等。
pUC19质粒
长2686bp，带有pBR322的复 制起始位点，一个氨苄青霉素抗性 基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子β －半乳糖苷酶基因（lac Z’）的调 节片段，一个调节lac Z’基因表达 的阻碍蛋白的基因lac I，还有多 个单克隆位点。 pUC19的筛选将转化细胞涂布到 含有氨苄青霉素、IPTG和X－gal 的固体培养基上，那些带有自身环 化质粒的细胞由于能够形成具活性 的β－半乳糖苷酶，所以菌落是蓝 色，如果插入有目的DNA片段， 无法形成杂合β－半乳糖苷酶，菌 落时白色的。
λ噬菌体载体
分类：插入型载体和置换型载体。 插入型载体：具有单一的酶切位点， 可供外源DNA的插入。 置换型载体：有成对的酶切位点， 在两个酶切位点之间的DNA片段， 可被外源DNA片段置换。 λ噬菌体载体可以克隆较大DNA 片段，最大长度约为23kb，只需 将λ噬菌体DNA、尾巴和纯化的 空的头，混在一起就可以在体外产 生具有侵染性的噬菌体颗粒。
DNA显微注射
一种注入的外源基因序列
反转录病毒法
利用反转录 病毒可以转 移小片段 DNA≤10kb 缺陷：可能 导致产生辅 助病毒株
利用胚胎干细胞
PCR检测
筛选和鉴定
可以利用 正负选择 法或PCR 检测外源 DNA是否 整合到染 色体的正 确位点。
10.2.2转基因动物的应用价值
PCR反应过程
1、变性，即将模板DNA置于 94℃的高温下，使双链DNA 的双链解开变成单链DNA； 2、退火，将反应体系的温度 降低至55℃左右，使得一对 引物分别与变性后的两条模板 链相配对； 3、延伸，将反应体系温度调 整到Taq DNA聚合酶作用的 最适温度72℃，然后以目的 基因为模板，合成新的DNA 链。 反复进行约30个循环左右， 即可扩增得到目的DNA序列。
1）用于各种人类遗传疾病的模型 以转基因鼠居多，例如在老鼠中转入突变的 人β珠蛋白基因，会产生β－地中海型贫血 症。 2）进行基因治疗 基因治疗是通过调控目的基因的表达，抑制、 替代或补偿缺陷基因，从而恢复受累细胞、 组织或器官的生理功能。 3）基因功能及基因定位的研究
4）转基因动物作为乳腺生物反应器：
显微操作仪使用杠杆操作而移动， 它能靠杠杆操作把微吸管的先端 在显微镜的视野中作平面移动。 上下的运动靠设在显微操纵仪支 柱上的上下微动，粗动调节装置 进行。它与显微镜牢固地连接起 来。右侧的显微操作仪是装在显 微镜本体上，左侧的显微操作仪 是装在显微镜的机械台上，随机 械台的移动而移动，一般在进行 操作时，先将平皿放置在显微注 射仪上，移动载物台，把视野移 到细胞处，先用缓慢移 动 显微操纵仪上固定细胞的微吸管， 同时使注射器缓慢减压，吸引目 标受精卵并固定之，再用另一侧 显微操纵仪移动微注射针，对准 细胞核刺入，导入目的基因，完 成显微注射。
将所需要的目的基因构建入载体，加上适当的调控 序列，转入动物胚胎细胞，使转基因动物分泌的乳 汁中含有所需的药用蛋白。
1.抗凝血酶Ⅲ：转基因羊中得到，产量为7g/l 2.β乳球蛋白：转基因小鼠，0.1－2mg/ml 3.红细胞生成素（EPO）:转基因小鼠乳汁0.5ug/ml 4.α1抗胰蛋白酶（AAT）:转基因羊60mg/ml 5.因子Ⅸ:转基因羊的乳汁125ug/ml的重组蛋白 6.因子Ⅷ：转基因猪1－2.7ug/ml 7.生长激素：转大鼠GH基因猪最高，血清中740ng/ml
质粒载体pBR322
1.大小为4361bp，含有 抗氨苄青霉素和抗四环素 这样两个抗生素抗性基因 2.在四环素抗性基因内部， 还具有BamH I、Hind Ⅲ和Sal I 三个识别位点。 3.Pst I识别位点在氨苄青 霉素抗性基因。 4.pBR322带有一个复制 起点，可以保证质粒只在 大肠杆菌里进行复制功能。
柯氏质粒 Cosmid
柯氏质粒可克隆携带 40kb大小的DNA片段， 并在大肠杆菌中复制保存， 综合了质粒载体和噬菌体 载体二者的优点。 柯氏质粒上带有多个单克 隆位（RE2），两个cos 位点，DNA复制起始位点 和抗生素抗性基因，在两 个cos位点之间还有一个 限制性内切酶位点 （RE1）。
显微注射法的优点与缺点
1）转化率高达20％，特别是在没有合适的DNA载体 系统时更有价值； 2）对各种受体细胞均适用，从体细胞、淋巴细胞到 受精卵； 3）对转移物质没有限制，可以是DNA、RNA、蛋白 质、病毒、代谢物或代谢底物以至细胞器、染色体、 细胞核； 4）可以控制转移的量和转移物的浓度； 5）要求的样品量少，2ml样品足够作显微注射； 6）实验细胞与对照细胞可以化同样的条件下比较。 但也有缺点，如设备和技术的要求较高，一次处理细 胞数量不能太多，对细胞有损伤。
基因枪介导的DNA转移
基因枪法最早是由美国 康奈尔大学的Sanford 最先提出的。它通过高 速飞行的金属颗粒将包 被其外的目的基因直接 导入到受体细胞内，从 而实现基因转化的方法。 1992年，世界首例转 基因小鼠就是通过该法 获得的。
基因枪转化的原理
10.1.3定点突变和受体系统
基因打靶（gene targeting）又称同源 重组技术，也是转基因技术的一个组成部分。 利用转基因的方法，将外源基因序列导入靶 细胞后，通过外源基因序列与靶细胞内染色 体上同源基因序列间的重组，将外源基因定 点整合到靶细胞基因组上的某一确定位点， 而对某一预先确定的靶位点进行点突破的一 项技术。
DNA-磷酸钙沉淀法
[方法与步骤] 1 传代细胞准备 细胞在转染前24ｈ传代,待细胞密度达50%～ 60%满底时即可进行转染。 2 DNA沉淀液的准备 首先将质粒DNA用乙醇沉淀（10～ 50μg/10cm2平板），空气中晾干沉淀，将DNA沉淀重悬 于50μL无菌水中，加50μL2.5mol/L CaCl2。 3 用吸管在500μL Hepes中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同时用 另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整个过程需 缓慢进行，至少需持续1～2min。 4 室温静置30min，出现细小颗粒沉淀。 5 将沉淀逐滴均匀加入10cm2平板中，轻轻晃动。 6 在标准生长条件下培养细胞4～16h。除去培养液，用5ml Hepes洗细胞2次，加入10ml完全培养液培养细胞。 7 收集细胞或分入培养皿中选择培养。
显微注射DNA
显微注射DNA一般是用微吸管加DNA溶液 在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将 DNA注射进去的方法，在动物细胞转移中 较常使用。现在，多利用显微镜操作器在相 差显微镜下进行操作。每个细胞的注射量约 为10－11 ml，熟练的操作者每10分钟可注 射200个细胞。
显微操作仪
显微操作仪的使用
基本步骤
1.分离获得目的基因； 2.在体外进行DNA重组，将外源DNA连接 到能自我复制又带有选择标记的载体上； 3.将重组DNA转移入受体细胞； 4.筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆； 5.将此克隆。