噬菌体抗体库技术
全面解读诺贝尔化学奖之噬菌体展示技术
全面解读诺贝尔化学奖之噬菌体展示技术当2018年诺贝尔化学奖颁布的那一刻，我禁不住高呼一声：今年的三大自然科学奖项都被生物学给“收入囊中”了。
别的不说，就说噬菌体展示技术，经过义翘神州十多年的应用改善，已经成为公司抗体制备技术的主要手段，制备开发的抗体近万种，还有几种抗体药物也在临床试验阶段。
为了让大家对噬菌体展示技术有更加清晰的了解，我结合公司十多年的抗体研发生产经验写了本文，希望给大家带来帮助。
1.噬菌体展示技术的发展进化之路1985年Smith GP利用基因工程，将外源基因插入丝状噬菌体(Filamentous bacteriophage，fd)的基因组，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示，从而创建了噬菌体展示技术。
1990年，Mc Cafferty等利用噬菌体展示技术构建了库容为106的抗体库，使其成为一种新兴的抗体制备技术。
而Sir Gregory P. Winter是第一个利用噬菌体展示技术将鼠源抗体药物人源化，使得抗体药物用于临床治疗，比如Adalimumab。
噬菌体展示技术创建后就成为了生物学研究中的重要研究手段，从根本上改变了传统单克隆抗体制备流程（杂交瘤技术），被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。
随着技术的不断发展完善，还进化为多种展示技术，如核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等。
噬菌体展示技术（phage display）是将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框能正确表达，使外源多肽或蛋白在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，可以保持相对的空间结构和生物活性。
然后利用靶分子，采用合适的淘洗方法，洗去未特异性结合的噬菌体。
再用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。
噬菌体展示技术的原理及应用
8、 DNA结合蛋白：
锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物，这些结 构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别 和结合特殊的 DNA 序列。噬菌体展示技术也可以用 于创造一个大的、具有识别不同 DNA 序列的 锌指 的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸 序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设 计 锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞 系中的癌基因，也可以启动表达质粒的基因，或干 扰病毒感染插入的片段是从 某些组织或细胞中抽提的mRNA 的互补DNA 片 段,它用来筛选与受体特异性结合的片段。一般可 利用M13 噬菌体或其他表 达一部分真核蛋白,而M13 噬菌体和其他E. coli噬 菌体所能表达的真核蛋白更少。研究表明,没有一 个展示系统能够表达所有的真核细胞蛋白。无论 如何,噬菌体表面cDNA 库的表达将是研究蛋白质 之间相互作用的有用工具。cDNA 库的噬菌体展 示提供了一个应用免疫学方法进行酶：
例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类，等等
6、底物与抑制剂：
主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。
7、信息传递研究:
利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如 凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一个 Hantaviral 受体；受体的配体， 如血管促生素、 αbungarotoxin， 和一些大蛋白分子中的折叠区域， 如 SH2、SH3 和 WW 区域。从多肽库中可分离 到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的 多肽, 因此用完整细胞可以从多肽库中找到受体的 高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体 信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛 选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。
一、发展简史
Dulbecco等提出了在病毒表面展示外源抗原 决定簇和肽的概念。 1985年Smith — 首次利用基因工程技术将 EcoRⅠ内切酶的部分基因片段(171 bp和132 bp)与 pⅢ基因融合，获得的重组噬菌体可在体外稳定增 生，表达产物能被抗EcoRⅠ内切酶抗体所识别.。 1988年Parmley — 将已知抗原决定簇与噬菌体 PⅢ N端融合呈现在其表面，并提出通过构建随机 肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想.。 1990年McCafferty — 用噬菌体展示技术筛选 溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一 个广泛应用的时代。
天然人源IgG Fab噬菌体抗体库的构建及多样性分析
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红霞等
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免疫学 技术 与 方法 ・
天然 人源 ＩＧ ａ ｇ Ｆ ｂ噬菌体 抗 体库 的构 建 及 多样性 分 析①
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噬菌体展示肽库技术的研究及应用进展
2010.012010.01的目的基因克隆进表达载体(fuse phage)，与噬菌体的外壳蛋白基因融合表达，使得一个噬菌体上含有一种序列的肽。
与有机合成法相比较，该方法有其独特的优越性：它可将特定分子的基因型和其表型统一在同一个病毒颗粒内，并且将选择能力和扩增能力联系在一起，即通过与配体的结合从数量众多的多样性群体中选择出表达有相应配体的噬菌体颗粒，再通过感染大肠杆菌使选择出的噬菌体颗粒得到扩增。
其不足在于肽库的容量及短肽的大小受到了限制，且只能表达L 型天然氨基酸形成的短肽。
3噬菌体肽库的筛选技术如何从噬菌体肽库中筛选到特异的重组噬菌体是肽库技术的关键。
经典的方法有两种：①将纯抗体包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；②将抗体与生物素基因相连，再将其固定在包被有Streptavidin 的磁珠上对噬菌体进行筛选。
3.1宿主菌直接洗脱经典筛选过程中，一般利用pH 的变化来洗脱与目标分子结合的噬菌体，这可能对噬菌体造成伤害。
利用噬菌体与宿主之间的亲和性可以直接用宿主菌来洗脱，以避免对筛选的影响，并且将洗脱和感染合并到一步[7]。
3.2双层膜筛选系统获得重组噬菌体蛋白的方法是将筛选出的特异噬菌体转入不含校正基因的菌株，将外源蛋白以可溶性蛋白的形式表达出来。
通过细胞膜间隙最终进入培养基质中。
针对这种情况，Skerra 等[8]建立了双层膜筛选系统。
第一层膜为亲水性多孔膜，这种膜对蛋白质的结合能力小，孔径能让蛋白质分子自由通过，但细胞不能通过；第二层膜为疏水膜，膜表面包被目标蛋白(抗原或抗体)，两种膜分别覆盖在固体培养基上。
细胞在第一层膜上培养一段时间后，将这层膜转移到第二层膜上培养，分泌的可溶性蛋白透过第一层膜，与第二层膜上的目标蛋白结合，然后再用已知的抗原或抗体筛选。
这种方法避免了蛋白常遇到的细胞碎片的干扰，提高了筛选效率。
抗体噬菌体展示技术
Introduction of Phage Display Technology
The scheme of Байду номын сангаасhagemid vector
▪ IG region: intergenic region, usually
contains the packing sequence and replication origin of minus and plus strands
▪ Molecular tag: to facilitate library
screening and for protein analysis
▪ Restriction enzyme recognition sites:
useful for DNA recombination and gene manipulation; multiple cloning sites (MCS)
▪ Protease cleavage site
▪ Promoter
▪ Signal peptides: phage protein
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the
most often used for phage display, primarily the M13 and Fd strains.
▪ Helper phage: wild-type pIII
helper phage and special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic
噬菌体展示文库中的终止密码子
噬菌体展示文库中的终止密码子噬菌体展示通俗的理解就是把要表达的蛋白与噬菌体的外壳蛋白融合表达，使蛋白表达到噬菌体表面，当然在这个过程中需要保证蛋白的结构和功能不发生改变。
因为蛋白质保持了其本身的活性，所以可以通过特异的反应鉴定筛选出表达有活性蛋白的噬菌体。
该技术将蛋白的表型和基因型直接联系了起来，可以实现高通量的筛选。
噬菌体展示文库可广泛用于选择针对多种不同抗原的抗体。
噬菌体展示抗体（PDA）文库可以快速分离和鉴定用于治疗和诊断的高特异性单克隆抗体。
噬菌体展示抗体文库可以分为免疫库、天然库和随机肽库。
为了创建尽可能大的抗体库，随机肽库越来越受到关注，目前已经产生了很多合成和半合成抗体库。
噬菌体展示抗体文库本质上是一种建库和筛选技术，这里我们重点关注将外源基因插入噬菌体外壳基因，使其表达到噬菌体外壳的建库步骤。
为了在丝状噬菌体表面上显示抗体可变区并随后回收可溶性抗体，将琥珀终止密码子（TAG）置于抗体的编码区和噬菌体外壳蛋白pIII之间。
这种琥珀终止密码子TAG在大肠杆菌抑制菌株如TG1或XL1 blue中表达时，大约20%的时间翻译为谷氨酰胺，而另外80%的时间翻译为终止信号，因此将琥珀终止密码子编码为终止信号的克隆比将琥珀终止密码子编码为谷氨酰胺的克隆的数量更多，也就是说大多数噬菌体并没有将抗体展示到噬菌体表面。
由于只有融合表达外源蛋白和噬菌体衣壳蛋白的噬菌体才有可能被筛选出来，而大多数的翻译终止，所以在抑制菌株中更容易筛选到抗原特异性噬菌体。
一旦选择并克隆了抗原特异性噬菌体，就可以通过转换到大肠杆菌非抑制菌株如HB2151表达可溶性抗体。
然而，从合成和半合成文库中选择阳性结合克隆有一个固有的偏向，即克隆中会含有随机产生的琥珀终止密码子TAG，终止密码子的存在会减缓单链抗体的选择过程，并对单链抗体的分离和生产造成影响，这使得高亲和力结合抗体的鉴定变得复杂。
正常情况下，包含终止密码子的单链抗体比例在10-30%之间波动，但对于某些特定的抗原选择方法，这一比例可能会增加到70-100%。
丝状噬菌体展示
• 2.噬菌体抗体库的分类 (1)根据 免疫抗体库 插入基 因片段 非免疫抗体库 天然抗体库 的来源 半合成抗体库 全合成抗体库
(2)根据可利用的载体主要分为: 丝状噬菌体展示 （M13为最常用）
λ 噬菌体展示
T4噬菌体展示 T7噬菌体展示 具体内容如下：
①丝状噬菌体是一种分泌型噬菌体。是单链环状 DNA病毒，其含有五种结构蛋白： 主要衣壳蛋白p8
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2.侵入：吸附后尾丝收缩，基板从尾丝 中获得一个构象刺激，促使尾鞘中的144 个蛋白质亚基发生复杂的移位，并紧缩 成原长的一半，由此把尾管推出并插入 细胞壁和膜中。此时尾管端所携带的少 量溶菌酶可把细胞壁上的肽聚糖水解， 以利侵入。头部的核酸迅速即通过尾管 及其末端小孔注入宿主细胞中，并将蛋 白质躯壳留在壁外。从吸附到侵入的时 间极短，例如T4只需15s。
T4噬菌体展示系统 ： T4噬菌体展示系统是20世纪90年代中 期建立起来的一种新的展示系统。它的显 著特点是能够将两种性质完全不同的外源 多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外 壳蛋白SOC（9 ku）和HOC（40 ku）融 合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它 表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免 了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失。T4 噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分 泌途径，因而可展示各种大小的多肽或蛋 白质，很少受到限制。
（2）D蛋白展示系统：D蛋白的分子质量为 11 ku，参与野生型λ噬菌体头部的装配。 低温电镜分析表明，D蛋白以三聚体的形式 突出在壳粒表面。当突变型噬菌体基因组 小于野生型基因组的82%时，可以在缺少D 蛋白的情况下完成组装，故D蛋白可作为外 源序列融合的载体，而且展示的外源多肽 在空间上是可以接近的。
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5.裂解：当宿主细胞内的大量子代噬菌 体成熟后，由于水解细胞膜的脂肪酶和 水解细胞壁的溶菌酶等的作用，促进了 细胞的裂解，从而完成子代噬菌体的释 放。
噬菌体展示文库的筛选技术 2005
噬菌体展示文库的筛选技术李丽芳 张映(山西农业大学动物科技学院,太谷 030801)摘 要: 噬菌体展示技术(Phage Display Techniques ,PD T )是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术。
该技术作为筛选与多种靶分子(如抗体、酶类、细胞表面受体等)具有特异性亲和力或活性的肽的一个有效方法,自问世以来,已取得了很大的发展,并被广泛地应用于基因治疗、基因疫苗研究、抗原表位研究、药物设计、研究细胞信号传导等领域[1]。
但该技术在两方面仍需进一步完善:(1)寻求更为有效的表达载体;(2)进一步完善筛选方法。
关键词: 噬菌体 肽库 抗体库 筛选The Selection T echniques of Phage Display LibrariesLi Lifang Zhang Y ing(A ni mal S cience and Technolog y Depart ment of S hanx i A g ricult ure Universit y ,S hanx i Tai gu 030801)Abstract : Phage Display Techniques (PD T )is a biotechnique used for screening and reconstructing functingal polypeptide.It ,s a effective method of select the peptide which has high affinities to many given targets (such as an 2tibody ,Enzyme ,surface receptor of cell ).It has been made much progress and are widely used in many fields ,such as genetic treatment ,the study of genetic vaccine ,epitope mapping ,drug discovery after its appearance.But it has to get more perfact in two sides :(1)Seek more effective expression vector ;(2)G et more perfect selection methods.Many selection methods are reviewed in this article.K ey words : Phage Peptide library Antibody library Selection 噬菌体表面展示技术是一种将外源多肽或蛋白质的DNA 序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位置上,外源基因将随着外壳蛋白的表达而表达,从而使多肽或蛋白以与外壳蛋白融合的形式展示在噬菌体表面。