噬菌体抗体库技术
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噬菌体展示技术的原理及应用
8、 DNA结合蛋白：
锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物，这些结 构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别 和结合特殊的 DNA 序列。噬菌体展示技术也可以用 于创造一个大的、具有识别不同 DNA 序列的 锌指 的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸 序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设 计 锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞 系中的癌基因，也可以启动表达质粒的基因，或干 扰病毒感染插入的片段是从 某些组织或细胞中抽提的mRNA 的互补DNA 片 段,它用来筛选与受体特异性结合的片段。一般可 利用M13 噬菌体或其他表 达一部分真核蛋白,而M13 噬菌体和其他E. coli噬 菌体所能表达的真核蛋白更少。研究表明,没有一 个展示系统能够表达所有的真核细胞蛋白。无论 如何,噬菌体表面cDNA 库的表达将是研究蛋白质 之间相互作用的有用工具。cDNA 库的噬菌体展 示提供了一个应用免疫学方法进行酶：
例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类，等等
6、底物与抑制剂：
主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。
7、信息传递研究:
利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如 凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一个 Hantaviral 受体；受体的配体， 如血管促生素、 αbungarotoxin， 和一些大蛋白分子中的折叠区域， 如 SH2、SH3 和 WW 区域。从多肽库中可分离 到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的 多肽, 因此用完整细胞可以从多肽库中找到受体的 高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体 信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛 选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。
一、发展简史
Dulbecco等提出了在病毒表面展示外源抗原 决定簇和肽的概念。 1985年Smith — 首次利用基因工程技术将 EcoRⅠ内切酶的部分基因片段(171 bp和132 bp)与 pⅢ基因融合，获得的重组噬菌体可在体外稳定增 生，表达产物能被抗EcoRⅠ内切酶抗体所识别.。 1988年Parmley — 将已知抗原决定簇与噬菌体 PⅢ N端融合呈现在其表面，并提出通过构建随机 肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想.。 1990年McCafferty — 用噬菌体展示技术筛选 溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一 个广泛应用的时代。
天然人源IgG Fab噬菌体抗体库的构建及多样性分析
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红霞等
天然人源 Ｉ ｂ ｇ Ｆ 噬菌体抗体库 的构建厦多搓 Ｇ ａ
箜
ｄｉ１ ．９９ｊｉｎ １０—８ Ｘ ２ １ ．１００ ｏ： ３６／． ｓ．００４４ ．００ １．１ ０ ｓ
・
免疫学 技术 与 方法 ・
天然 人源 ＩＧ ａ ｇ Ｆ ｂ噬菌体 抗 体库 的构 建 及 多样性 分 析①
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免疫学 技术 与 方法 ・
天然 人源 ＩＧ ａ ｇ Ｆ ｂ噬菌体 抗 体库 的构 建 及 多样性 分 析①
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15 噬菌体展示技术的原理
受体—配体 信息传递 诘抗剂 抑制剂
噬菌体抗体库的构建
Antibody IgG structure
Antibody IgG structure
Antibody IgG structure
VL
Fab
C VH C H1
L
(Fab’)2 Hinge
Fc
CH2 CH3
Membrane Extension
5. 酶： 例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类， 等等 6. 底物与抑制剂： 主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。
7. 信息传递研究: 利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体， 如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一 个 Hantaviral 受体；受体的配体， 如血管促 生素、 α-bungarotoxin， 和一些大蛋白分子 中的折叠区域，如 SH2、SH3 和 WW 区域。 从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与 受体结合的高亲和力的多肽, 因此用完整细 胞可以从多肽库中找到受体的高选择性配体。 在不知道任何有关的受体和配体信息的情况 下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特 异与靶组织结合的多肽和蛋白。
噬菌体展示技术的原理
噬菌体展示的基本概念
将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋 白融合,并在其表面展示,同时将其遗传密码信息整合到个体 噬菌体的基因组中。直接将可见的表达型与其基因型联系在 一起,利用其配体的特异性亲和力,将所感兴趣的蛋白
质或多肽挑选出来。
多年来 , 噬菌体展示技术被用于 抗体的制备 、 多肽及蛋 白质和酶的制备 。特别是近几年来 , 该技术被作为一种新工 具用于多肽和蛋白质药物的发现与研制、蛋白质与蛋白质的 相互作用及蛋白质与DNA相互作用的研究、蛋白质结构和功 能的研究以及基因治疗药物的定向传递等多方面 的研究。
丝状噬菌体展示
• 2.噬菌体抗体库的分类 (1)根据 免疫抗体库 插入基 因片段 非免疫抗体库 天然抗体库 的来源 半合成抗体库 全合成抗体库
(2)根据可利用的载体主要分为: 丝状噬菌体展示 （M13为最常用）
λ 噬菌体展示
T4噬菌体展示 T7噬菌体展示 具体内容如下：
①丝状噬菌体是一种分泌型噬菌体。是单链环状 DNA病毒，其含有五种结构蛋白： 主要衣壳蛋白p8
•
2.侵入：吸附后尾丝收缩，基板从尾丝 中获得一个构象刺激，促使尾鞘中的144 个蛋白质亚基发生复杂的移位，并紧缩 成原长的一半，由此把尾管推出并插入 细胞壁和膜中。此时尾管端所携带的少 量溶菌酶可把细胞壁上的肽聚糖水解， 以利侵入。头部的核酸迅速即通过尾管 及其末端小孔注入宿主细胞中，并将蛋 白质躯壳留在壁外。从吸附到侵入的时 间极短，例如T4只需15s。
T4噬菌体展示系统 ： T4噬菌体展示系统是20世纪90年代中 期建立起来的一种新的展示系统。它的显 著特点是能够将两种性质完全不同的外源 多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外 壳蛋白SOC（9 ku）和HOC（40 ku）融 合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它 表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免 了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失。T4 噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分 泌途径，因而可展示各种大小的多肽或蛋 白质，很少受到限制。
（2）D蛋白展示系统：D蛋白的分子质量为 11 ku，参与野生型λ噬菌体头部的装配。 低温电镜分析表明，D蛋白以三聚体的形式 突出在壳粒表面。当突变型噬菌体基因组 小于野生型基因组的82%时，可以在缺少D 蛋白的情况下完成组装，故D蛋白可作为外 源序列融合的载体，而且展示的外源多肽 在空间上是可以接近的。
•
5.裂解：当宿主细胞内的大量子代噬菌 体成熟后，由于水解细胞膜的脂肪酶和 水解细胞壁的溶菌酶等的作用，促进了 细胞的裂解，从而完成子代噬菌体的释 放。
人源化抗体的制备策略
二、 CDR 移植的人源化抗体
鼠源性抗体 V 区中的 FR 仍残留一定的免疫原性, 这种抗体还远非真正的人源化 抗体, 有些还能产生很强的抗独特型反应。 为减少鼠源成分, 人们进一步用人的 FR 替代鼠 FR, 形成更为完全的人源化抗体, 即 除 了 3 个 CDR 是 鼠 源 的 外 , 其 余 全部是人源结构, 又称 CDR 移植抗体( CDR- grafted antibody) 或改型抗体 ( reshaped antibody) 。
为减少鼠源成分转, 人基们因进一小步鼠用人制的备FR的替代人鼠抗FR体, 形,成其更为功完效全的优人于源化其抗他体,技即 术除 了生3产个 C的DR抗是 正鼠 源常的人外体, 其蛋余白全部单是抗人源。结小构, 鼠又称识CD别R 移抗植抗体( CDR- grafted antibody) 或改 型小抗鼠体 识(别re抗sh原ap和原ed动a和员nti抗b动o原d员y的) 。抗抗体原系统的仍抗保持体完系整,统容易仍把保人体持蛋完白识整别,为容异易物。把人体蛋白识别为异物。 此外, 由于抗体是体内 噬菌体抗体库技产术生的产的生,依经赖历于 3了项正实验常技装术的配发和展:成一是熟PC过R 技程术,的从发展而使保人们证可成以用品一具组引有物较( 免高疫的球蛋靶白结可变合区亲中骨和架力部分。的保但守转序列基) ,因通过小RT- PCR 直接从 B 淋巴细胞总RNA 克异隆活出 性全的套抗免体疫)鼠的球建也蛋立白存, 可实在变现区了一基基些因因,型缺从和而陷表使型,抗即的体统转库一的基, 构提因建供简了通单高常易效行有率; 的二体筛是细选噬系菌胞统体突,展这示变是技噬和术菌(其体即抗将他体抗独库体技通特术过的的与核噬序心菌列;体三外,是壳导从蛋大致白肠融不杆合菌完表分达整泌在表的噬达菌人有体结序的合表列功面能;,而的进免而疫经球亲蛋和白富分集子法片筛段选。表达有特 应用 DNA 重组且技术, 将由小于鼠抗抗体体基因是上在的可小变鼠区与体人内抗体装基配因的, 恒因定而区重产组生, 再的将重单组抗后的具基有因导鼠入糖骨髓基瘤化细胞的中模表达式。,所以这些单抗最终并 二噬、菌C体D抗R 移体植库的技不人术是源的化产全抗生人体依赖源于化3 项的实。验技术的发展: 一是 PCR 技术的发展使人们可以用一组引物 ( 免疫球蛋白可变区中骨架部分的保守序列) , 通过 RT- PCR 直接从 B 淋巴细胞总RNA
鼠源性抗体 V 区中的 FR 仍残留一定的免疫原性, 这种抗体还远非真正的人源化 抗体, 有些还能产生很强的抗独特型反应。 为减少鼠源成分, 人们进一步用人的 FR 替代鼠 FR, 形成更为完全的人源化抗体, 即 除 了 3 个 CDR 是 鼠 源 的 外 , 其 余 全部是人源结构, 又称 CDR 移植抗体( CDR- grafted antibody) 或改型抗体 ( reshaped antibody) 。
为减少鼠源成分转, 人基们因进一小步鼠用人制的备FR的替代人鼠抗FR体, 形,成其更为功完效全的优人于源化其抗他体,技即 术除 了生3产个 C的DR抗是 正鼠 源常的人外体, 其蛋余白全部单是抗人源。结小构, 鼠又称识CD别R 移抗植抗体( CDR- grafted antibody) 或改 型小抗鼠体 识(别re抗sh原ap和原ed动a和员nti抗b动o原d员y的) 。抗抗体原系统的仍抗保持体完系整,统容易仍把保人体持蛋完白识整别,为容异易物。把人体蛋白识别为异物。 此外, 由于抗体是体内 噬菌体抗体库技产术生的产的生,依经赖历于 3了项正实验常技装术的配发和展:成一是熟PC过R 技程术,的从发展而使保人们证可成以用品一具组引有物较( 免高疫的球蛋靶白结可变合区亲中骨和架力部分。的保但守转序列基) ,因通过小RT- PCR 直接从 B 淋巴细胞总RNA 克异隆活出 性全的套抗免体疫)鼠的球建也蛋立白存, 可实在变现区了一基基些因因,型缺从和而陷表使型,抗即的体统转库一的基, 构提因建供简了通单高常易效行有率; 的二体筛是细选噬系菌胞统体突,展这示变是技噬和术菌(其体即抗将他体抗独库体技通特术过的的与核噬序心菌列;体三外,是壳导从蛋大致白肠融不杆合菌完表分达整泌在表的噬达菌人有体结序的合表列功面能;,而的进免而疫经球亲蛋和白富分集子法片筛段选。表达有特 应用 DNA 重组且技术, 将由小于鼠抗抗体体基因是上在的可小变鼠区与体人内抗体装基配因的, 恒因定而区重产组生, 再的将重单组抗后的具基有因导鼠入糖骨髓基瘤化细胞的中模表达式。,所以这些单抗最终并 二噬、菌C体D抗R 移体植库的技不人术是源的化产全抗生人体依赖源于化3 项的实。验技术的发展: 一是 PCR 技术的发展使人们可以用一组引物 ( 免疫球蛋白可变区中骨架部分的保守序列) , 通过 RT- PCR 直接从 B 淋巴细胞总RNA
抗体库技术
b 在无抑制基因的宿主菌中则UAG为终止 密码子，抗体分子表达为可溶性蛋白
5.2.2.2 抗体库筛选技术
•1. 用于筛选的抗原 • 能够将结合与非结合形式的噬菌体分离开
的方法均可用于筛选 • a 可溶性抗原包被于酶标板（聚苯乙烯） • b 将抗原固定化到琼脂糖微珠上，亲和柱
层析
• C 生物素-抗原+ 抗体库→
• 基因工程抗体，极大地改善了抗体的性能 和扩展了抗体的应用范围
• 抗体库技术，通过DNA重组技术，克隆全 套抗体可变区基因，在原核系统表达有功 能的抗体分子片段（即抗体库），从中筛 选特异性抗体的基因。
• 两项关键技术：
• PCR：用一组引物，扩增出全套免疫球蛋 白的可变区基因
• 以大肠杆菌(或噬菌体)直接表达有功能活性 的抗体分子片段
• 噬粒做表达载体，来源于辅助病毒的野生 型蛋白Ⅷ和蛋白Ⅷ-抗体融合蛋白共同组装 到噬菌体表面，各自的表达数目取决于两 者的相对数量
• 每一个噬菌体表面可表达24个左右的抗体 分子
• 基因Ⅲ(蛋白Ⅲ )：
• 用噬菌体载体产生多价抗体分子
• 用噬粒表达，所产生的噬菌体抗体颗粒中 10%表达有抗体分子片段，单价
• 辅助噬菌体是一类自身DNA复制效率极低 的突变型，但可为宿主细胞的质粒DNA提 供复制和包装所需的蛋白酶和外壳蛋白
• 用辅助病毒超感染，辅助病毒提供所有的 丝状噬菌体蛋白，将噬粒DNA 以单链的形 式包装在噬菌体外壳蛋白内，形成病毒颗
粒，可以感染大肠杆菌，但不产生（辅助 噬菌体）子代噬菌体。
• 噬粒载体中插入抗体分子片段与基因Ⅲ或 基因Ⅷ
• 基因工程抗体技术，是继杂交瘤单克隆抗 体技术以后抗体领域的又一次革命
• "噬菌体抗体库技术"又被誉为这次革命中 的革命
5.2.2.2 抗体库筛选技术
•1. 用于筛选的抗原 • 能够将结合与非结合形式的噬菌体分离开
的方法均可用于筛选 • a 可溶性抗原包被于酶标板（聚苯乙烯） • b 将抗原固定化到琼脂糖微珠上，亲和柱
层析
• C 生物素-抗原+ 抗体库→
• 基因工程抗体，极大地改善了抗体的性能 和扩展了抗体的应用范围
• 抗体库技术，通过DNA重组技术，克隆全 套抗体可变区基因，在原核系统表达有功 能的抗体分子片段（即抗体库），从中筛 选特异性抗体的基因。
• 两项关键技术：
• PCR：用一组引物，扩增出全套免疫球蛋 白的可变区基因
• 以大肠杆菌(或噬菌体)直接表达有功能活性 的抗体分子片段
• 噬粒做表达载体，来源于辅助病毒的野生 型蛋白Ⅷ和蛋白Ⅷ-抗体融合蛋白共同组装 到噬菌体表面，各自的表达数目取决于两 者的相对数量
• 每一个噬菌体表面可表达24个左右的抗体 分子
• 基因Ⅲ(蛋白Ⅲ )：
• 用噬菌体载体产生多价抗体分子
• 用噬粒表达，所产生的噬菌体抗体颗粒中 10%表达有抗体分子片段，单价
• 辅助噬菌体是一类自身DNA复制效率极低 的突变型，但可为宿主细胞的质粒DNA提 供复制和包装所需的蛋白酶和外壳蛋白
• 用辅助病毒超感染，辅助病毒提供所有的 丝状噬菌体蛋白，将噬粒DNA 以单链的形 式包装在噬菌体外壳蛋白内，形成病毒颗
粒，可以感染大肠杆菌，但不产生（辅助 噬菌体）子代噬菌体。
• 噬粒载体中插入抗体分子片段与基因Ⅲ或 基因Ⅷ
• 基因工程抗体技术，是继杂交瘤单克隆抗 体技术以后抗体领域的又一次革命
• "噬菌体抗体库技术"又被誉为这次革命中 的革命
噬菌体展示
噬菌体展示
简介
噬菌体是一种能够感染细菌并在其中繁殖的病毒。
它被广泛用于生物学研究和生物技术应用中，特别是在基因工程和基因治疗领域。
噬菌体展示技术是一种将特定蛋白质或肽段展示在噬菌体表面的方法。
通过选择与目标蛋白质相互作用的噬菌体克隆，可以筛选出具有特定功能的蛋白质或肽段。
本文将介绍噬菌体展示技术的原理、应用和优点。
原理
噬菌体展示技术依赖于噬菌体基因组中的一个外源基因，该基因编码目标蛋白质或肽段。
这个外源基因通常被插入到噬菌体的毒力因子基因中，例如毒力因子III基因。
插入后，目标蛋白质或肽段会与细菌细胞的表面结合。
噬菌体携带的基因信息会导致细菌细胞表面展示目标蛋白质或肽段。
通过这种方式，科研人员可以通过筛选和选择的方法找到与目标蛋白质或肽段相互作用的噬菌体克隆。
应用
噬菌体展示技术在生物学研究和生物技术应用中有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：
抗体库筛选
噬菌体展示技术可用于抗体库筛选，以寻找与特定抗原相互作用的抗体。
通过将抗原展示在噬菌体表面，科研人员可以筛选出具有高亲和力和特异性的抗体，用于治疗和诊断应用。
肽库筛选
噬菌体展示技术也可用于肽库筛选，以寻找具有特定功能的肽段。
通过将肽段展示在噬菌体表面，科研人员可以筛选出与特定靶点相互作用的肽段，用于药物开发和治疗应用。
蛋白质互作网络研究
噬菌体展示技术可以用于研究蛋白质互作网络。
通过将一种蛋白质展示在噬菌体表面，并将其用作识别其他与其相互作用的蛋白质的。
噬菌体展示技术的原理及应用
02 噬菌体展示技术 原理
噬菌体结构与功能
噬菌体基本结构
由蛋白质外壳和内部遗传物质组 成，具有识别和感染宿主细胞的 能力。
噬菌体功能
通过感染宿主细胞，将自身遗传 物质注入细胞内，并利用宿主细 胞的资源进行复制和增殖。
展示原理及过程
展示原理
利用噬菌体感染宿主细胞的特点，将外源蛋白或多肽与噬菌体表面蛋白融合表达 ，从而展示在噬菌体表面。
发展历程
自20世纪80年代初期噬菌体展示技术 被首次提出以来，随着分子生物学和 基因工程技术的不断发展，该技术得 到了迅速发展和广泛应用。
技术特点及优势
技术特点
噬菌体展示技术通过将外源基因插入到噬菌体的基因组中，使得外源蛋白或多 肽能够在噬菌体表面表达，从而实现了对外源蛋白的高通量筛选和鉴定。
优势
等。
实验操作步骤
转化宿主菌
将构建好的噬菌体展示载体转化 到宿主菌中。
噬菌体繁殖和蛋白表达
在适当的条件下培养宿主菌，使 噬菌体繁殖并表达目标蛋白。
噬菌体收集和纯化
收集宿主菌培养物，通过离心、 过滤等方法纯化噬菌体。
构建噬菌体展示载体
将目标蛋白基因克隆到噬菌体载 体中，构建成噬菌体展示载体。
噬菌体展示验证
通过ELISA、Western blot等方 法验证目标蛋白是否在噬菌体表 面展示。
结果分析与解读
噬菌体滴度测定
通过测定噬菌体的滴度来评估实验的 可靠性和重复性。
目标蛋白表达量分析
通过SDS-PAGE等方法分析目标蛋白 的表达量，以评估展示效果。
展示特异性验证
通过与其他非特异性蛋白的对比，验 证目标蛋白在噬菌体表面的展示特异 性。
安全性问题
噬菌体作为病毒的一种， 存在潜在的安全风险，如 污染实验室、感染工作人 员等。