应用噬菌体抗体库技术制备抗体
噬菌体展示抗体在输血医学中的应用
５ 参 考 文 献
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【 关键词 】 哇善体 噬营体 肤库 抗 ＲｈＤ） 输皿 （
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国卅 医 学输 血 盟 血液 学 分 册 ２０ ０ ２年 第 ２ ５卷 第 １期
噬 菌体 展 示 抗 体在 输 血医 学 中 的应 用
乔 家驻 综 述
【 要】 噬菌体展示（ 摘 表位 ） 技丰是 一 种体 刮 用分子 生曲 学原理产 生抗体 的新 方法 链 法币仨 筒
得 了 较 理 想 的结 果 。 本 文 就 其 研 究 的 现 状 及 在 输 血 中 的应 用综述 如下 。 ｌ 噬 菌 体 展 示 技 术
１ １ 噬 茵 体 展 示 技 术
噬菌体展示肽库技术的研究及应用进展
2010.012010.01的目的基因克隆进表达载体(fuse phage)，与噬菌体的外壳蛋白基因融合表达，使得一个噬菌体上含有一种序列的肽。
与有机合成法相比较，该方法有其独特的优越性：它可将特定分子的基因型和其表型统一在同一个病毒颗粒内，并且将选择能力和扩增能力联系在一起，即通过与配体的结合从数量众多的多样性群体中选择出表达有相应配体的噬菌体颗粒，再通过感染大肠杆菌使选择出的噬菌体颗粒得到扩增。
其不足在于肽库的容量及短肽的大小受到了限制，且只能表达L 型天然氨基酸形成的短肽。
3噬菌体肽库的筛选技术如何从噬菌体肽库中筛选到特异的重组噬菌体是肽库技术的关键。
经典的方法有两种：①将纯抗体包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；②将抗体与生物素基因相连，再将其固定在包被有Streptavidin 的磁珠上对噬菌体进行筛选。
3.1宿主菌直接洗脱经典筛选过程中，一般利用pH 的变化来洗脱与目标分子结合的噬菌体，这可能对噬菌体造成伤害。
利用噬菌体与宿主之间的亲和性可以直接用宿主菌来洗脱，以避免对筛选的影响，并且将洗脱和感染合并到一步[7]。
3.2双层膜筛选系统获得重组噬菌体蛋白的方法是将筛选出的特异噬菌体转入不含校正基因的菌株，将外源蛋白以可溶性蛋白的形式表达出来。
通过细胞膜间隙最终进入培养基质中。
针对这种情况，Skerra 等[8]建立了双层膜筛选系统。
第一层膜为亲水性多孔膜，这种膜对蛋白质的结合能力小，孔径能让蛋白质分子自由通过，但细胞不能通过；第二层膜为疏水膜，膜表面包被目标蛋白(抗原或抗体)，两种膜分别覆盖在固体培养基上。
细胞在第一层膜上培养一段时间后，将这层膜转移到第二层膜上培养，分泌的可溶性蛋白透过第一层膜，与第二层膜上的目标蛋白结合，然后再用已知的抗原或抗体筛选。
这种方法避免了蛋白常遇到的细胞碎片的干扰，提高了筛选效率。
人源化单克隆抗体的构建技术
人源化单克隆抗体的构建技术摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床,经历了一段曲折的发展历程。
其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。
抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。
本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。
关键词：人源化,单克隆抗体,构建从20世纪7０年代英国学者Milsteｉn和德国学者Koｈler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1],单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。
单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系,还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。
然而,单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢,主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fｃ受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别,产生人抗鼠抗体（human anｔiｇｅn mｏuｓe ａnｔiboｄy,ＨAMA）；三是在人体循环系统中被很快清除掉。
因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造,减少异源抗体的免疫原性,成为单克隆抗体研究的重点[2]。
随着对抗体基因的研究和ＤNＡ分子重组技术的应用,通过基因改造获得特异性抗体成为可能。
１989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。
至此,抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体;细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。
人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Ｖh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。
人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。
人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。
噬菌体展示技术及其应用研究进展
动物保健 ２０ 年第９ 总第 １９ ０６ 期 ０ 期 堕
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蛋 白展示 系统最突 出的特 点是对外源 多
（ ｌ ｏ ｔ ａ ｓ ｒ ｅ ，Ｓ Ｃ 。Ｓ Ｃ ｓ Ｉ ｕｅ ｃ ｐ ｉ ｐｏ ｉ Ｏ ） Ｏ ｍａ ｒ ｄ ｔｎ
ｔ ｃ ｎｑ ｅ ｅ ｈ ｉｕ ｓ
，
ＰＴ Ｄ ）起源 于 １８ 年 ， ５ 是一种 物 与噬菌体外壳 蛋 白融合 在一起 ，并 在 噬菌体展示 系统 。 ９ 丝状 噬菌 体ＰⅢ 系统单
可 ＰⅧ系 用于筛选 和改造功 能性多肽 、蛋白质强 噬菌 体表面展 示 ，被展示 的多肽或蛋 白 价 展示 ， 以筛选高亲和 力配 体 ， 有力的生物技术 ，广泛应 用于研 究蛋 白 质可保持独立的空间结构和生物学活性 统拷贝数高 ， 利于疫苗 的研 制 ， 丝状 噬 但
些领域产生 了深远的影响 。 物科学提供高效而 实用的研 究手段 。 次要衣壳 蛋 白Ｐ【‘ ｌ ＰⅦ和 ＰＩ Ｉ ＰＶ、 Ｉ Ｘ，其
中较 常用到的是 ＰⅧ和 ＰⅢ 白 ， 蛋 因此构
噬菌体展示技术的基本原理
噬菌体展 示的基本原理 是将外源遗
二 、噬菌体展示系统
成 了 Ｐ Ⅲ Ｐｖ展 示 系统 。Ｐ Ⅲ蛋 白为 和 Ｉ
质 的结构与功能 ，蛋 白质 问的识 别与作 然后利 用靶 分子 ，采 用适 当的淘洗 方法 菌体分泌释放 ， 不易 展示 大分子蛋 白 入
用 ，分离体 内特异 蛋 白质与基 因以及 实
（ 亲和一洗脱一扩增 一亲和 的循环步骤 ） ， 噬菌体和 Ｔ ４噬菌 体系统容量 大 ， 贝数 拷
验 进化等 多个分子 生物学领域 。目前噬 洗去非特异 结合的噬菌体 ，最终从噬 菌 高 ，但不 易筛选高亲和 力配 体 Ｔ ７噬菌
噬菌体抗体概念
噬菌体抗体是指能够特异性识别和结合噬菌体的抗体。
噬菌体是一类可以感染细菌和病毒的微生物，它们通常具有一个由蛋白质外壳和内部基因组组成的结构。
噬菌体抗体的产生通常是由于人体免疫系统识别噬菌体表面的
抗原表位而引发的。
这些抗原表位可以是蛋白质、糖类或者其他化学物质，它们能够刺激免疫系统产生相应的抗体。
这些抗体可以与噬菌体表面的抗原表位结合，从而阻止噬菌体对细胞的感染。
噬菌体抗体在医学和生物学领域具有广泛的应用价值。
例如，可以利用噬菌体抗体来研究病毒的感染机制和病毒与宿主细胞之间的
相互作用。
此外，噬菌体抗体也可以用于治疗病毒感染和抗生素耐药感染。
在实践中，噬菌体抗体的制备通常需要使用动物模型或者体外实验方法。
例如，可以使用病毒蛋白或者噬菌体表面蛋白来免疫动物，以刺激动物产生相应的抗体。
然后，可以从动物的血清中提取出抗体，用于进一步的研究或治疗。
总之，噬菌体抗体是一种具有重要应用价值的抗体，它可以帮助我们更好地理解病毒的感染机制和病毒与宿主细胞之间的相互作用，同时也为治疗病毒感染和抗生素耐药感染提供了新的思路和方法。
抗体库技术
5.2.2.2 抗体库筛选技术
•1. 用于筛选的抗原 • 能够将结合与非结合形式的噬菌体分离开
的方法均可用于筛选 • a 可溶性抗原包被于酶标板（聚苯乙烯） • b 将抗原固定化到琼脂糖微珠上，亲和柱
层析
• C 生物素-抗原+ 抗体库→
• 基因工程抗体，极大地改善了抗体的性能 和扩展了抗体的应用范围
• 抗体库技术，通过DNA重组技术，克隆全 套抗体可变区基因，在原核系统表达有功 能的抗体分子片段（即抗体库），从中筛 选特异性抗体的基因。
• 两项关键技术：
• PCR：用一组引物，扩增出全套免疫球蛋 白的可变区基因
• 以大肠杆菌(或噬菌体)直接表达有功能活性 的抗体分子片段
• 噬粒做表达载体，来源于辅助病毒的野生 型蛋白Ⅷ和蛋白Ⅷ-抗体融合蛋白共同组装 到噬菌体表面，各自的表达数目取决于两 者的相对数量
• 每一个噬菌体表面可表达24个左右的抗体 分子
• 基因Ⅲ(蛋白Ⅲ )：
• 用噬菌体载体产生多价抗体分子
• 用噬粒表达，所产生的噬菌体抗体颗粒中 10%表达有抗体分子片段，单价
• 辅助噬菌体是一类自身DNA复制效率极低 的突变型，但可为宿主细胞的质粒DNA提 供复制和包装所需的蛋白酶和外壳蛋白
• 用辅助病毒超感染，辅助病毒提供所有的 丝状噬菌体蛋白，将噬粒DNA 以单链的形 式包装在噬菌体外壳蛋白内，形成病毒颗
粒，可以感染大肠杆菌，但不产生（辅助 噬菌体）子代噬菌体。
• 噬粒载体中插入抗体分子片段与基因Ⅲ或 基因Ⅷ
• 基因工程抗体技术，是继杂交瘤单克隆抗 体技术以后抗体领域的又一次革命
• "噬菌体抗体库技术"又被誉为这次革命中 的革命
从噬菌体抗体库中筛选抗HIV-Tat蛋白单链抗体
序列 测定 ，并检测其抗原结合活性 。结果 经过筛选 ，获得了 １株能 与 Ｔａｌ蛋白特 异性结合 的 阳性 克隆 ，经检索 ｋａｂａｔ 数据 库 ，发现其轻 、重链 可变 区分别属于 ｖ Ｉ型 、Ⅶ Ⅲ型。结论 利用 噬菌体抗 体库技术可 以不经 过免 疫制备 出高
特异性 的人源化抗 Ｔａｔ蛋白单链抗体。
ｂｒａｒｙ．Ｍ ｅｔｈｏｄｓ Ｐａｎｎｉｎｇ ｏｆ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ—Ｔａｔ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｓｐｅｃｉｆ ｉｃ ａｎｔｉ—ＨＩＶ—Ｔａｔ ｓｃＦｖ．Ｔｈｅ ａｎｔ ｉｇｅｎ
ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆ ｉｅｄ，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｐａｎｎｉｎｇ，１ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｓｃＦｖ ａｌｓｏ ｃａ／１ ｂｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ，
Ｋ ｅｙ ｗｏｒｄｓ，Ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ；ＨＩＶ－Ｔａｔ；Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
（Ｃｈｉｎ．『ｌａｂ脚 ，２０Ｏ８，１２：０５９２）
，ＺＨＡＮＧ
Ｃｕｏ－ｌｉ，ｅｌ ａ１．（Ｔｈｅ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ删 如 Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆＰＩＡ，Ｃｈａｎｇｃｈ．ｎ １３００６２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｌｏｉｌｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔ ｉ—ＨＩＶ—Ｔａｔ ｓｉｎｇｌｅ—ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｓｃＦｖ）ｆｒｏｍ Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ（Ｉ＋Ｊ）ｐｈａｇｅ ａｔ￣ｔｉｂｏｄｙ ｌｉ—
纳米抗体筛选实验步骤
纳米抗体筛选一、纳米抗体简介1.纳米抗体发现及结构1993年，Hamers-Casterman教授以及他的同事们在骆驼的血清中发现了一种与传统抗体结构不同的新型抗体，这种抗体仅仅由两条重链构成，被称为重链抗体(heavy-chain antibody, HCAb)。
重链抗体的重链的可变区称为VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)，通过体外重组表达制备的VHH 分子质量仅仅为15kDa，是传统抗体的十分之一左右，是抗原结合片段（scFV，VH-VL）的二分之一左右，因此被称为纳米抗体(nanobody, Nb)。
传统抗体（左）、重链抗体（中）和纳米抗体（右）的结构由于没有轻链，纳米抗体仅有3个属于重链的抗原识别区域（CDRs 区）。
为了弥补缺少的轻链CDRs的生物学活性，纳米抗体在CDR3部分增加了氨基酸长度（16~18个氨基酸残基，对应的传统抗体的CDR3有8-15个氨基酸），以增加CDR的多样性和特异性。
另外，纳米抗体的CDR3 区域可形成一个大的暴露的凸环，像“手指”一样延伸到抗原的缝隙或者裂口中，可以接触到传统抗体不能接触的抗原表位。
CDR3凸环中的一个半胱氨酸还可以与CDR1 或FR2 的45 位点的半胱氨酸形成二硫键，可使纳米抗体的生物结构相对稳定，大大降低纳米抗体与抗原结合所需能量，使得高亲和力的纳米抗体的获得较容易。
纳米抗体和VH结构示意图2.纳米抗体优势（1）纳米抗体理化特性较稳定（2）纳米抗体的大规模生产较容易实现（3）纳米抗体免疫原性低（4）纳米抗体分子量小，组织渗透能力强，血液清除较快（5）纳米抗体可以识别传统抗体不能识别的位点（6）纳米抗体具备形成多聚体的能力3.纳米抗体筛选纳米抗体筛选和制备纳米抗体的获得现在普遍通过免疫羊驼，从羊驼体内自身的抗体成熟阶段来得到抗体基因，然后通过噬菌体展示筛选技术来从羊驼抗体库中筛选得到高亲和力的抗体序列。
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应用噬菌体抗体库技术制备抗体
摘要：噬茵体抗体库技术是利用PCR扩增出抗体的全套可变区基因，将抗体分子
DNA片断如Fab或单链抗体(scFv)与噬茼体外壳蛋白基因PⅢ或PVI]I连接，使融合
蛋白表达于噬茵体颗粒的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程富集筛选特异性
抗体.。这一技术将抗体基因型和表型联系在一起，使识剐抗原的能力和噬茵体
的可扩增性统一起来，较好的模拟了体内的抗体产生的过程，成为一种高效的筛
选体系。噬菌体抗体库是近年发展起来的一项分子生物学新技术。构建容量大、
特异性高和敏感性强的人源性抗体是此项技术的核心，也是其远大前景的基础.
本文就噬茵体抗体库技术的原理、构建、筛选做一综述。
关键词：噬茵体抗体库技术；抗体库；噬茵体
噬菌体抗体库技术(phage display antibody li—brary techniques)是指
用聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)扩增抗体的全套可变区基因，
通过噬菌体表面展示技术，把Fab段或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面，经
过“吸附一洗脱一扩增”过程筛选并富集特异性抗体。20世纪80年代中期，Smith
在前人对丝状噬菌体分子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术。由于
该技术具有生产人抗体的潜力，因此，吸引了许多学者投入这一研究中，使得噬
菌体抗体库技术得以迅速发展，并由此开创了一条简便、快速的基因工程抗体生
产路线.
1 噬菌体抗体库技术的基本原理
噬菌体抗体库技术的原理是将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因
与噬菌体的外壳蛋白Ill(PIl1)或外壳蛋白Ⅷ(PⅧ)基因随机重组，继而感染大肠
杆菌，经增殖并在噬菌体表面以抗体片段Fab或ScFv一外壳蛋白融合蛋白的形式
表达。这种噬菌体颗粒可以特异识别抗原，又能感染宿主菌进行再扩增，经过“吸
附一洗脱一扩增”过程就能筛选并富集特异性抗体。所构建的抗体库称为全套抗
体库，从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体。它的最大特点是实现了直接将基因型
和表型联系在一起，可以快速而高效地从大量克隆中筛选出表达特异性抗体。
2 噬菌体抗体库的构建
噬菌体抗体库按抗体基因的性质分为DNA文库和cDNA 文库，按抗体基因的来
源分天然抗体库、免疫抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库等。免疫球蛋白基
因可来源于杂交瘤细胞、体外免疫的细胞、致敏及非致敏的B淋巴细胞(骨髓、外
周血、病灶局部引流淋巴结、扁桃体或经过免疫的小鼠脾脏等)，其中以淋巴结
的B淋巴细胞较好。建库的大致过程是：首先提取细胞的总RNA，经过RT—PCR扩
增可变区基因，运用两种不同的限制性内切酶分别对纯化的轻链PCR产物和表达
载体进行酶切，再对切割产物进行分离纯化，按一定比例将载体和轻链连接，转
化感受态细胞并扩大培养，提取质粒即为轻链库。再对重链PCR产物和轻链库进
行双酶切，纯化后按一定比例连接、转化感受态细胞并扩大培养，提取质粒既为
轻链库。再对重链PCR产物和轻链库进行双酶切，纯化后按一定比例连接、转化
感受态细胞，加入辅助噬菌体培养，离心取上清，加入聚乙二醇(PEG)沉淀并收
集噬菌体颗粒，这样就得到噬菌体总抗体库。
3 噬菌体抗体库的表达载体和筛选
噬菌体抗体库的表达载体可分为入噬菌体(phage入)、单链丝状噬菌体
(filamentous phage)及噬菌粒(phagemid)三种系统，这三种系统各有其利弊。
入噬菌体表达系统可通过菌斑印迹(plaque lift)筛选克隆，但外源性片段不能
太大，其库容量较小(106)。丝状噬菌体主要为Winter实验室所采用，目前已构
建了fd CAT1及fd D()Gl，并已制备ScFv；在此载体中又包括单价及多价两个子
系统，可筛选出高亲和力抗体。噬菌粒是应用最多的表达载体，也是简便高效模
拟B细胞产生抗体的原核表达系统。建抗体库的目的是筛选出各种特异性的抗体
分子，噬菌体抗体库在这方面有无可比拟的优势。经典的筛选方法有两种：一是
将纯抗体包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛
选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；二是将抗体与生
物素基团相连，再将其固定在包被有链霉蛋白抗生素的顺磁珠上对噬菌体进行筛
选。在筛选过程中，噬菌体种类、固相介质表面的抗原密度或溶液中抗原的浓度
和清洗时间三种因素对筛选的效率影响较大。同时，每一轮筛选都需要进行检测，
以证实筛选的有效性。
4 噬菌体抗体库技术的优点
①方法简单易行，节省时间，可通过发酵生产来大量制备；②筛选容量增大，
可在数周内筛选100万～ 1亿个克隆，可获得高亲和力的人源化抗体；③ 直接从
未经免疫的人或小鼠的淋巴细胞中得到抗体基因，因此可以获得完全人源化的抗
体，克服了杂交瘤细胞不稳定的缺点，避开了人工免疫和杂交瘤技术；④模拟体
内免疫过程和天然全套抗体库，随意“制造”和克隆针对任何抗原的抗体。
5 结语
不可否认，噬菌体抗体库技术已显示强劲的发展势头，它的价值不仅仅在于
抗体的制备，其强大的筛选能力已广泛地应用到免疫学、细胞生物学、药理学、
蛋白质工程等诸多领域。后基因组时代的到来，就是研究蛋白质的结构、功能及
其相互作用，噬菌体抗体库技术能提供此项技术平台。但人们需要进一步解决的
问题是构建库容大、多样性好的抗体库，长时间保存抗体库使其库容和多样性不
下降和新筛选方法的建立。相信随着此项技术的不断完善，将会有一个广阔的诱
人前景.