凝胶电泳法_SDS_PAGE_测定乳与乳制品中_乳球蛋白的含量
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
SDS的性质与作用
十二烷基磺酸钠(SDS) Sodium dodecyl sulphate CH3-(CH2)10-CH2OSO3--Na+
SDS的性质与作用
Protein Strand
Denature
-
SDS Molecules
-
SDS的性质与作用
蛋白质变性
0.1-1% SDS 0.1 M 2-巯基乙醇 蛋白质变与SDS分子按比例结合 1 ：1.4
插入样品梳加入电极缓冲加入电极缓冲液液ph83ph83浓缩胶浓缩胶ph86ph86通电通电分离胶分离胶ph88ph88加入样品加入样品上样及电泳开始电流恒定在开始电流恒定在10ma10ma当进入分离胶后改为当进入分离胶后改为20ma20ma溴酚蓝距凝胶边缘约溴酚蓝距凝胶边缘约5mm5mm时停止电泳
SDS-聚丙烯酰胺
制备浓缩胶
加入浓缩胶溶 液 pH 8.6
分离胶 pH 8.8
通电
加入电极缓冲 液pH 8.3
上样及电泳
加入样品
浓缩胶 pH 8.6
开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA， 溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
分离胶
pH 8.8
凝胶板剥离与染色
电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板
凝胶电泳
生化社团 吕炎
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
测定蛋白质分子量
一、实验目的 二、实验原理 三、实验步骤 四、结果分析 五、注意事项
一、实验目的
学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测 定蛋白质分子量的原理。 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的 操作技术。
二、实验原理
SDS的性质与作用 聚丙烯酰胺凝胶的性质
06 生物化学实验--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量【目的】1 ．掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作方法。
2 ．熟悉 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。
【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。
不同蛋白质分子具有不同的大小、形状，在一定的 pH 环境中带有不同的电荷量，因而在一定的电场中所受的电场引力及介质对其的阻力不同，二者的作用结果使不同蛋白质分子在介质中以不同的速率移动，经过一定的时间后得以分离，这就是电泳分离蛋白质及核酸生物大分子的基本原理。
聚丙烯酰胺凝胶电泳就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关，为了使其只与蛋白质分子的大小有关，从而利用蛋白质在介质中的迁移率来测定蛋白质的分子量，就需要消除蛋白质分子的形状和所带电荷量的不同对迁移率的影响或减小到可忽略不计的程度。
SDS 是十二烷基硫酸钠（ sAium dAecyl sulfate ）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS/ 1 g 蛋白质），使各种蛋白质 -SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。
SDS- 蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样（约为 18? ，即 1.8 nm ），而长轴则随蛋白质分子量成正比的变化。
说明， SDS 和蛋白质的结合所形成的 SDS- 蛋白质复合物消除了由于天然蛋白质形状不同而对电泳迁移率的影响。
(生物化学)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
ml
4.0 2.5 0.1 0.1 3.3 0.006
灌注分离胶（水封，室温30分钟左右凝固） *丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性神经毒性 ——手套
3. 浓缩胶的制备和灌注
5%浓缩胶（10ml）-3ml/组
试剂
ml
Acr/Bis 30%
1.7
0.5mol/L Tris-HCl Ph 6.8
2.5
在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和 夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧
夹子。
玻璃夹放在制胶架上，薄玻璃朝向自己。按弹 簧夹，将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃的间隙内分别
灌制分离胶和浓缩胶，放上梳子，待胶凝固。2. 分离胶的制备和灌注
12%分离胶的制备（10ml）-5ml/组
试剂
Acr/Bis 30% 1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8 10% SDS 10% AP H2O TEMED
• 电泳：80V，15-20min（浓缩胶）；100V（分 离胶）至指示剂距凝胶底边1cm。
6. 染色、脱色
染色：凝胶于0.25% 考马斯亮蓝染 色20min。
脱色：于脱色液 （7.5%冰乙酸， 5%甲醇）中脱 色至蛋白带清 晰。
蒸馏水煮沸5-10’
7. 照相、分析结果
➢凝胶成像系统照相 ➢绘制标准曲线 ➢计算样品蛋白的分子量
兔磷酸化酶B（97400） 牛血清白蛋白（66200）
兔肌动蛋白（43000） 牛碳酸酐酶（31000）
胰蛋白酶抑制剂（20100） 鸡蛋清溶菌酶（14400）
8. 思考题
➢ 浓缩胶与分离胶的作用机制各是什么? ➢ 分离胶灌注完毕，以蒸馏水封闭的作用是
什么? ➢ 根据实验结果，分析实验误差的可能原因。 ➢ 如何配置1L 0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8 缓
凝胶电泳技术在蛋白质定量中的应用
凝胶电泳技术在蛋白质定量中的应用凝胶电泳技术是一种常用的生物化学分析方法，广泛应用于蛋白质的定量与分离。
本文将介绍凝胶电泳技术在蛋白质定量中的应用。
一、背景介绍蛋白质是生物体内最重要的分子之一，对于细胞功能的研究和疾病的诊断有着重要的意义。
因此，准确地定量蛋白质含量是非常重要的。
凝胶电泳技术作为一种常用的蛋白质定量方法，具有灵敏度高、分辨率好、操作简单等优点，被广泛应用于蛋白质研究领域。
二、凝胶电泳的原理凝胶电泳是利用电场作用下蛋白质在凝胶中的迁移速度与其分子量成反比的原理进行蛋白质分析与定量的方法。
常用的凝胶电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和葡萄糖凝胶电泳（PAGE）等。
三、蛋白质定量的方法1. 标准曲线法标准曲线法是基于标准品与待测物质之间的反应关系建立的定量方法。
在凝胶电泳中，可以通过与不同浓度的标准蛋白质进行对比，根据标准蛋白质带的强度与待测样品带的强度之间的线性关系，推断待测样品的蛋白质含量。
2. 比较法比较法是将待测物与已知浓度的标准蛋白质进行比较，从而得到待测物的浓度。
凝胶电泳中可以将待测样品与标准蛋白质混合在同一凝胶上，通过对比它们的带强度来获取待测样品的蛋白质含量。
3. 内标法内标法是将已知浓度的内标蛋白质与待测物质一同进行凝胶电泳，在电泳过程中，通过内标蛋白质与待测物质的比例关系来计算待测物质的浓度。
四、凝胶电泳技术的优势与局限性凝胶电泳技术在蛋白质定量中具有以下的优势：1. 灵敏度高：凝胶电泳技术具有很高的灵敏度，能够检测到低至微克甚至纳克级的蛋白质。
2. 分辨率好：由于凝胶电泳技术的特性，能够对蛋白质进行分离，并且根据带的位置和强度进行定量。
3. 操作简单：与其他蛋白质定量方法相比，凝胶电泳技术的操作相对简单，不需要复杂的仪器设备。
然而，凝胶电泳技术也存在一些局限性：1. 仅适用于溶液中的蛋白质：凝胶电泳技术只适用于水溶液中的蛋白质，对于非水溶性的蛋白质难以应用。
蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法一、实验目的1、学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。
2、掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术。
二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。
SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
Acr和bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。
引发自由基的方法有化学法和光化学法两种。
化学法的引发剂是过硫酸铵（Ap），催化剂十四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。
采用不同浓度的acr、bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。
因此可按分离物质的大小、形状来选择凝胶浓度。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
三、实验器材及数据30%分离胶储存液、10%浓缩胶储存液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、电泳缓冲液、样品溶解液、染色液、脱色液；标准蛋白，样品蛋白；电泳槽，移液管1ml，烧杯100ml四、注意事项1、acr和bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴口罩和手套，纯化应在通风处内进行。
sds凝胶电泳测定蛋白质的相对
sds凝胶电泳测定蛋白质的相对以SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对为标题，本文将详细介绍SDS 凝胶电泳检测蛋白质相对分子质量的原理和方法。
一、引言蛋白质是生物体内重要的功能分子，其结构和功能的研究对于生物学、医学等领域具有重要意义。
而SDS凝胶电泳是一种常用的分离和检测蛋白质的方法，可以通过分析蛋白质的相对分子质量来研究其结构和功能。
本文将详细介绍SDS凝胶电泳检测蛋白质相对分子质量的原理和方法。
二、原理SDS凝胶电泳是一种离子交换电泳技术，通过在凝胶中加入表面活性剂SDS，可以使蛋白质在凝胶中具有均一的负电荷，从而根据蛋白质的大小分离。
具体原理如下：1. SDS：表面活性剂SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）是一种阴离子表面活性剂，在水溶液中能够使蛋白质完全解离为带负电荷的复合物。
SDS与蛋白质按照1：1的摩尔比结合，使得蛋白质带有负电荷。
2. 凝胶：常用的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶具有较好的分辨率和稳定性，因此在实验中被广泛应用。
3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：将蛋白质样品与SDS混合后，通过电泳将其分离。
由于SDS使蛋白质带有负电荷，因此在电场作用下，蛋白质会向阳极迁移。
由于凝胶的孔径大小不同，蛋白质根据其相对分子质量的大小在凝胶中分离成不同的条带。
三、实验方法SDS凝胶电泳的实验步骤如下：1. 制备凝胶：根据实验需要选择不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶，加入TEMED和过硫酸铵等物质，制备凝胶溶液。
2. 注射样品：将待测蛋白质样品与SDS混合，并进行热变性处理，使蛋白质在凝胶中具有均一的负电荷。
3. 进行电泳：将混合样品注射到凝胶槽中，连接电源进行电泳。
根据需要设定不同的电压和时间。
4. 染色观察：电泳结束后，将凝胶取出，并进行染色。
常用的染色方法有银染和脱色染色等。
5. 分析结果：观察染色后的凝胶，根据不同蛋白质的条带位置和宽度，可以推断其相对分子质量。
四、结果分析SDS凝胶电泳的结果分析主要从条带位置和宽度两个方面进行。
sds-page凝胶分离蛋白原理
sds-page凝胶分离蛋白原理
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质电泳分离技术。
其原理主要包括以下几个步骤：
1. 凝胶制备：通过混合聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）单体和交联剂，形成一个可控制孔径的三维网状结构的凝胶。
2. 样品处理：将待测蛋白样品加入含有SDS和还原剂（通常是β-巯基乙醇）的缓冲液中，在高温条件下进行蛋白变性和解聚，使蛋白质的二级结构和三级结构解开，同时在蛋白质上附加负电荷。
3. 装载样品：将变性的蛋白样品通过吸附或卷筒法装载到预先形成的凝胶中。
4. 电泳：将装载样品的凝胶置于一个带正电极和负电极的电泳槽中，施加电场使蛋白质在凝胶内移动。
由于SDS在蛋白质中均匀包裹，使所有蛋白质表面均负电荷，蛋白质在电场中的迁移速率只与电场强度和蛋白质的分子量成反比。
5. 可视化：经过一段时间的电泳后，各个蛋白质按照其分子量的大小被分离在凝胶上。
可以通过染色方法（例如银染或荧光染色）将蛋白质可视化，从而得到蛋白质的分离图谱。
通过SDS-PAGE可以分离不同分子量的蛋白质，借此可以定量和比较不同样品中蛋白质的含量以及分子量等特性。
乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测
乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测乳与乳制品中常见的蛋白质种类包括酪蛋白、乳清蛋白和乳酸菌蛋白等。
其中，酪蛋白是乳与乳制品中最主要的蛋白质组分，占据了乳中总蛋白质的75%以上。
乳清蛋白是乳与乳制品中的另一主要蛋白质成分，它具有良好的水溶性和生物利用度。
常规理化指标检验蛋白质含量的方法主要有几种，包括Kjeldahl法、琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收光谱法等。
Kjeldahl法是一种用于测定有机氮含量的经典方法，也是乳与乳制品中蛋白质含量检测的常用方法之一、该方法的原理是通过将样品中的蛋白质分解为氨基酸，然后将氨基酸转化为氨，并以氨的形式测定样品中的氮含量。
通过乘以适当的因子，可以计算出样品中蛋白质的含量。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的蛋白质分析方法，可以用于检测乳与乳制品中蛋白质的组成和含量。
该方法利用蛋白质在电场中的迁移速率与其分子量之间的关系，通过测定蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以推断出蛋白质的分子量和含量。
紫外吸收光谱法是一种基于蛋白质在特定波长下具有吸光性的原理，通过测定吸收光谱的变化来确定样品中蛋白质的含量。
这种方法简单、快速，并且无需破坏性地处理样品，因此在乳与乳制品中蛋白质含量的检测中得到了广泛应用。
除了上述常见的方法外，还有其他一些新型的蛋白质检测方法正在不断发展中，例如质谱法、免疫测定法等。
这些方法具有高灵敏度和高选择性，能够准确地测定乳与乳制品中蛋白质的含量。
在实际的生产和质量控制中，对乳与乳制品中蛋白质含量的检测是至关重要的。
通过对产品中蛋白质含量的监测，可以及时发现和解决质量问题，确保产品的标准化和稳定性。
总之，常规理化指标检验乳与乳制品中蛋白质含量的方法多种多样，每种方法都具有其特定的优点和适用范围。
选择适当的方法，并根据实际情况进行合理的检测，对于乳与乳制品的生产和质量控制具有重要的意义。
SDS-PAGE蛋白纯度鉴定
百泰派克生物科技
SDS-PAGE蛋白纯度鉴定
一般实验分离的蛋白质常常会含有一些杂质蛋白或提取步骤中使用的试剂等，影响后续实验的顺利进行，因此有必要对其进行纯化，并对纯化结果进行检测，即蛋白质纯度测定。
蛋白质纯度测定可以评价蛋白质是否含有杂质以及杂质的含量，是进一步研究蛋白质至关重要的环节。
一些蛋白产品尤其要进行纯度检测，以确保产品的质量和安全性。
随着生命科学研究的发展进步，蛋白纯度鉴定的方法也越来越多样化，包括电泳法、免疫化学法、沉降速率测定法、色谱法、质谱法等，他们的原理和方法也不尽相同。
聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）是最经典的纯度鉴定方法，简便快速，灵敏度高且成本低，在蛋白质纯度鉴定中被广泛应用。
将待检测蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，
若该蛋白样品中不含其他蛋白杂质，那么电泳结束后只有一条蛋白条带；若蛋白质样品中含有多个蛋白质或者纯化蛋白样品中含有其他杂蛋白，经过SDS-PAGE分离
后不同的蛋白质会被分离成多个蛋白条带。
百泰派克生物科技提供SDS-PAGE蛋白质纯度鉴定一站式服务，包括检测污染物、
蛋白质变体、异构体、S-S链错配、不完整蛋白产物、降解蛋白、蛋白质修饰、蛋
白质聚集体和蛋白质前体等，欢迎免费咨询。
蛋白SDS-PAGE纯度鉴定与分子量测定
蛋⽩SDS-PAGE纯度鉴定与分⼦量测定蛋⽩SDS-PAGE纯度鉴定与分⼦量测定⼀、原理：（1）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳⼗⼆烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）简称SDS - PAGE。
⽤于蛋⽩纯度及蛋⽩质亚基相对分⼦量（relative molecular mass, Mr）测定。
SDS是⼀种阴离⼦去污剂，带有⼤量负电荷，与蛋⽩质结合后使蛋⽩质所带负电荷⼤⼤超过了天然蛋⽩质原有的负电荷，因⽽消除或掩盖了不同种类蛋⽩质间原有电荷的差异。
SDS 破坏蛋⽩质氢键、疏⽔键，引起蛋⽩质构象改变，使蛋⽩质－SDS 复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋⽩质分⼦量成正⽐。
因此，蛋⽩质—SDS复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中的迁移率不受蛋⽩质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋⽩质分⼦量）有关。
蛋⽩质的迁移率与分⼦量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bXMW：分⼦量；X：迁移率；k、b均为常数将已知分⼦量的标准蛋⽩质的迁移率对分⼦量对数作图，可获得⼀条标准曲线，未知蛋⽩质在相同条件下进⾏电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分⼦量。
（2）分离效应：PAGE根据其有⽆浓缩效应，分为：连续电泳（continuous electrophoresis）：采⽤相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（discontinuous electrophoresis）：采⽤不同孔径的凝胶和不同缓冲体系连续PAGE：电荷效应；分⼦筛效应不连续PAGE：电荷效应；分⼦筛效应；浓缩效应不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为⼤孔径的浓缩胶，下层为⼩孔径的分离胶。
①浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成⼀条窄带，然后再进⼊分离胶进⾏分离。
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乳清蛋白主要由乳白蛋白、乳球蛋白组成，乳白蛋白约占乳清蛋白的68％，乳白蛋白还可细分为：α-乳白蛋白约占乳清蛋白的19.7%，β-乳球蛋白约占乳清蛋白的43.6%，血清白蛋白约占乳清蛋白的4.7%。有文献报道，β-乳球蛋白具有降低胆固醇的功效，在酸性胃肠道内具有抗酸能力，能够进入人体循环系统，容易被吸收。另外，β-乳球蛋白能够对脂溶性营养素如维生素A和维生素E进行预结合，从而促进它们的吸收[1]。因此被认为是多功能蛋白，在营养上的角色备受重视。定量检测乳与乳制品中β-乳球蛋白的含量，可以明示乳制品的营养价值，给予消费者以更好的选择。目前β-乳球蛋白常用的检测方法有高效液相色谱法[2-3]和电泳法[4-8]，与液相方法相比，电泳法具有成本低、操作简单，耗时短，重复性高等特点。
1材料与方法1.1材料与仪器30%丙烯酰胺单体贮备液、1mol/LTris-HCl缓冲液，pH6.8、1.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.8、10%过硫酸铵、10%SDS溶液、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）溶液；样品缓冲液（4mg溴酚蓝，1.6mL1mol/LTris-HCl缓冲液，pH6.8，4mLSDS溶液，1.2mLβ-巯基乙醇，100％甘油2.2mL，全部混合后用水稀释定容至20mL）；电极缓冲液（Tris-甘氨酸系统：0.025mol/LTris，0.192mol/L甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3）；考马斯亮蓝染色液，2.5g/L；β-乳球蛋白1标准品（纯度≥90%，SIGMA公司）：精确称取0.0100gβ-乳球蛋白标准品，用样品缓冲液定容至10mL，沸水浴中加热3-5min，在-20℃以下保存；配制成相当浓度的系列β-乳球蛋白标准溶液。BIO-RAD凝胶电泳仪及光密度仪（BIO-
凝胶电泳法（SDS-PAGE）测定乳与乳制品中β-乳球蛋白的含量韩奕奕，黄菲菲，王建军，吕春
（上海市乳品质量监督检验站，上海200436）
摘要：建立一种快速、准确测定乳与乳制品中β-乳球蛋白含量的SDS-PAGE方法。β-乳球蛋白标准溶液在0.238-7.128mg/L范围内呈线性相关(r=0.99),具有良好的重复性（RSD<10%），液态奶及奶粉的检出限分别为24mg/100mL、240mg/100g。通过对β-乳球蛋白的重复性和灵敏度实验，表明SDS-PAGE方法具有操作简单、准确可靠的特点，适用于乳与乳制品中β-乳球蛋白含量的测定。关键词：β-乳球蛋白；凝胶电泳法；乳与乳制品
中图分类号：TS252.1文献标识码：A文章编号：1671-5187(2009)02-0074-04TheDeterminationofβ-lactoglobulinContentinMilkandDairyProductsbySDS-PAGEElectrophoresis
HanYiyi,HuangFeifei,WangJianjun，LvChun
（ShanghaiDairyProductsQualitySupervisionandInspectionCenter,Shanghai200436,P.R.China）
Abstract:Arapidquantitativemethodfordeterminationofβ-lactoglobulininmilkanddairyproductsbySDS-PAGEelectrophoresishasbeendeveloped.Themethodhadgoodrelativity(r=0.99)andgoodanalyticprecision(RSD<10%),withtheLODof24mg/100mLinmilkand240mg/100ginmilkpowderandcheese.Thismethodisfast,simple,reliable，soitcanbeappliedinthedeterminationofβ-lactoglobulininmilkanddairyproducts.Keywords:β-lactoglobulin;SDS-PAGEelectrophoresis;milkanddairyproducts
收稿日期：2008-10-22
《乳业科学与技术》2009年第2期（总第135期）74RAD公司）。1.2实验方法1.2.1样品制备液体样品：取1mL样品，依次加入1mL水和2mL样品缓冲液，沸水浴加热3-5min，磁力搅拌器搅拌4h，离心5min，去除脂肪，取清液分装，在-20℃保存，备用。固体样品:称取1g样品，精确到0.1mg，加适量水溶解，定容至10mL，取1mL依次加入1mL水和2mL样品缓冲液，沸水浴加热3-5min，磁力搅拌器搅拌4h，离心5min，去除脂肪，取清液分装，在-20℃保存，备用。1.2.2分离胶及浓缩胶制备按表1所示配制12％分离胶及3%浓缩胶表1不连续电泳的凝胶配方（垂直电泳）贮液3%浓缩胶12%分离胶丙烯酰胺单体贮备液2.5mL12mL浓缩胶缓冲液贮备液0.6mL—分离胶缓冲液贮备液—7.5mL十二烷基磺酸钠溶液（10%）50μL300μL水1.82mL10mLN,N,N′,N′-四甲基乙二胺溶液（TEMED）5μL20μL过硫酸铵溶液/100g·L-125μL200μL1.2.3上样将制备好的凝胶放入电泳槽中，并灌入新配置的电极缓冲液。用微量进样器分别加入β-乳球蛋白标准溶液2μL和试样2μL。1.2.4参考电泳条件（恒电流）：浓缩胶中浓缩30mA；分离胶中分离30mA。1.2.5染色及脱色凝胶用水清洗三次，浸泡在盛有考马斯亮蓝染色液的器皿中，染色12h。染色后的凝胶用脱色也浸泡脱色，至凝胶背景无色为止。用光密度仪对凝胶进行测定分析，根据光密度值计算β-乳球蛋白的含量。2结果与分析2.1分离胶浓度的选择SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统。在不连续系统中，样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。因此，采用不连续系统，对相同样品，相同电流下，在5%、12%、15%以及20%的分离胶上进行电泳，对分离效果进行了比较，见图1-图4。
β-乳球蛋白标准品牛奶平行样奶粉平行样
奶酪平行样
图15%分离胶分离效果
β-乳球蛋白标准品牛奶平行样奶粉平行样奶酪平行样
图212%分离胶分离效果
β-乳球蛋白标准品牛奶平行样奶粉平行样
奶酪平行样
图315%分离胶分离效果
β-乳球蛋白标准品牛奶平行样奶粉平行样奶酪平行样
图420%分离胶分离效果
韩奕奕等：凝胶电泳法（SDS-PAGE）测定乳与乳制品中β-乳球蛋白的含量752.5确定检出限根据限量要求，对0.2376mg/mL的标准样品（较接近于空白样品）20个平行样进行电泳，得到标准偏差，由LOD=3×SD得到检出限。液态奶中为24mg/100mL，奶粉、奶酪中为240mg/100g。2.6实际样品的测定将β-乳球蛋白标准样品与经前处理的样品一同点样，在既定电泳条件下，进行电泳分析，通过图5可以看出，胶体最前端的是α-乳白蛋白，第二条带为目标条带———β-乳球蛋白，其余为其他的酪蛋白等。同时可以看出，在既定电泳条件下，可以达到β-乳球蛋白与其它蛋白良好的分离效果。
由表3可以看出，同一样品使用不同的染色方法，得到的β-乳球蛋白含量基本一致。综上所述，改良的考马斯亮蓝染色与传统考马斯亮染色相比，不仅使用低毒的有机试剂，缩短了脱色时间，并且能达到与传统考马斯亮蓝染色的定量效果。2.4标准曲线的建立用SDS-PAGE测定β-乳球蛋白的标准溶液，其测定结果表明β-乳球蛋白的标准溶液与光密度值之间存在着较好的线性关系，相关系数r为0.99，回归方程分别为Y＝1.5452X-0.7139，详见表4。
通过图1-图4，可以看出，由于5%的聚丙烯酰胺凝胶对β-乳球蛋白和其他乳清蛋白和酪蛋白没有明显的阻碍作用，因此，5%的分离胶无法将蛋白质分开；10%-20%浓度的凝胶具有较小的孔径，对蛋白质能够起到分子筛的作用，因此与其他乳清蛋白和酪蛋白较好的分离效果。同时，随着分离胶浓度的增大，β-乳球蛋白的迁移距离越短，因此，在β-乳球蛋白的迁移距离相同的情况下，分离胶浓度越大，电泳时间也逐渐增加，考虑到时间因素，我们认为12%的分离胶浓度更加适用于β-乳球蛋白的检测。2.2电流的选择对相同样品在12%分离胶上分别在10mA、15mA、20mA、30mA以及60mA电流下进行电泳，电泳时间与电流强度的比较表3。表2电流强度与电泳时间一览表（单胶）电流/mA1015203060耗时/min18090706030通过上表可以看出，电流越大，电泳时间越短；另一方面，当电流增加到60mA时，可以明显感觉到电泳中产生的热量，由于产生的热量会引起介质温度升高，这会对分离效果造成潜在的影响。综合考虑，我们选择30mA的电流，既可快速地进行电泳，又不会在电泳过程中产生大量的热量。2.3染色剂的选择SDS-聚丙烯酰胺凝胶常用的染色剂为考马斯亮蓝R-250，在进行电泳时使用两种方法进行染色。2种染色液的成分及操作如下：（1）传统考马斯亮蓝染色法：清洗后的凝胶用染色液（45.4%甲醇、4.6%乙酸、0.25%考马斯亮蓝R-250）着色过夜，再经洗脱液（5%甲醇、7.5%乙酸）过夜脱色至背景清晰。（2）改良考马斯亮蓝染色法：清洗后的凝胶用染色液（20%乙醇、10%磷酸、10%硫酸铵、0.25%考马斯亮蓝R-250）着色过夜，再经洗脱液（5%甲醇、7.5%乙酸）脱色3-4次，即可背景清晰。通过试验，我们发现使用传统的考马斯亮蓝染色法，脱色时间较长，一般需要1-2d，需要用到大量的有毒、易挥发的试剂，胶体颜色不易脱去，在胶体背景处取20个点，光密度的平均值为0.00057，胶体背景较高。使用改良考马斯亮蓝染色法，用低毒的乙醇代替甲醇，采用高酸、高离子染色液，与蛋白质结合选择性高，脱色时间大大缩短，只需要3-4h，在胶体背景处取20个点，光密度的平均值为0.00011，获得了背景清晰的胶体。在考察染色时间、脱色时间、图像背景的同时，对同一样品分别在两块凝胶上做8个平行样，进行凝胶电泳，两块胶分别采用两种方法染色，得到的β-乳球蛋白含量如表3。表3同一样品使用不同染色方法得到β-乳球蛋白含量浓度/（mg·mL-1）12345678平均值/（mg·mL-1）RSD/%