流式细胞仪的荧光补偿问题
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞仪
流式细胞仪的机型
1. 台式机 检测和分析 B.D. : FACSCalibur; LSRII; LSRI
2. 大型机 分选细胞 B.D. : FACSVantage ；FACSAria Beckman Coulter: MoFlo （DAKO）
荧光抗体的搭配
理论上，不同通道检测的参数可以同时进 行检测。但是如果进行3个荧光参数的检测， 尽可能的选择只需要调节一对参数之间的 补偿的荧光。 如，FL1+FL2+FL4; FL1+FL3+FL4; 注意：PE-Cy5和APC不能同时检测。
流式细胞仪的数据显示和分析
一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。 1．单参数数据显示和分析— 一维直方图
90 Degree Light Scatter
Laser
FALS Sensor
SSC 与入射光成 90 ° 的光，与 细胞内部复杂度 相关，颗粒密度
90LS Sensor
根据FSC/SSC可以将全血中的淋巴细胞，单核 细胞和粒细胞分开
荧光参数 自发荧光：未经荧光染色，细胞内部的荧
光分子经激光照射后发出的荧光信号。 自发荧光的细胞成分： 核黄素，细胞色素等。 死亡细胞的自发荧光较高 需要设置阴性对照。
F/P FITC, PerCP: 2-9; APC, PE: 1; PE-Cy7, APC-Cy7: 1, N;
抗原密度 高丰度抗原：任何荧光素；低丰度抗原：PE，APC
染色指数 自发荧光
高：APC； 低：FITC 非特异形结合
FcR; 荧光自身
直接标记
流式细胞仪分析技术及应用
流式细胞仪分析技术及应用流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。
概述流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析。
一、工作原理（了解）基本组成结构1.液流系统由样本和鞘液组成。
待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流；鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测的精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。
2.光学系统由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。
（1）激光光源：现代流式细胞仪采用的多为气冷式氢离子激光器，常用激光束波长为488nm，15mW。
（2）分光镜：作用是反射较长波长的光，通过较短波长的光。
（3）光束成形器：由两个十字交叉放置的圆柱形透镜组成。
（4）透镜组：有3个透镜，作用是将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。
（5）滤片：长通滤片，允许长于设定波长的光通过；短通滤片，允许短于设定波长的光通过；带通滤片，允许一定带宽的波长通过，其他波长的光不能通过。
（6）光电倍增管（PMT）：主要作用是检测散射光和荧光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。
3.数据处理系统主要由计算机及其软件组成，进行实验数据的分析、存储、显示，是流式细胞仪组成部件中的重要环节。
二、散射光的测定散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，散射光的强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向也有关。
Invitrogen Attune NxT 流式细胞仪应用手册说明书
Invitrogen Attune NxT流式细胞仪应用手册成就稀有细胞超灵敏高通量分析梦想实现全血样本无需裂解无需洗涤夙愿21人全血样本免洗免裂解白细胞分析(三种方法)...............................................................................................2人全血6色T 细胞无需补偿且免洗免裂解检测................................................................................................6人全血10色免疫表型分析.....................................................................................................................10人全血13色免疫表型分析.....................................................................................................................13人全血吞噬细胞检测...........................................................................................................................17小鼠脾细胞10色免疫表型分析...............................................................................................................22小鼠调节性T 细胞检测........................................................................................................................25藻类存活率分析...........................................................................................................................28使用Attune NxT 流式细胞仪进行荧光蛋白检测...........................................................................................30hPSC 来源的心肌细胞分化过程中转录因子表达的流式细胞分析......................................................................37利用Attune NxT 流式细胞仪检测全血中的血小板............................................................................................42利用Attune NxT 流式细胞仪设计T 细胞基础配色方案......................................................................51利用Attune NxT 流式细胞仪快速准确地进行植物细胞核DNA 含量分析................................................................59使用 ModFit LT 软件分析 Attune NxT FCS 数据文件的操作指南 . (66)利用Invitrogen Attune NxT 流式细胞仪对单细胞生物中的中性脂进行检测 (74)利用Attune NxT 流式细胞仪进行精确浓度测定的推荐方法 (78)Attune NxT 自动进样器实现流式高通量自动化检测：在所有板孔和微孔板之间保持结果的一致性 (80)使用FlowJo 软件分析Invitrogen Attune NxT FCS 数据文件的操作指南 (88)使用FCS Express 6软件分析Attune NxT FCS 数据文件 (96)目录2人全血免洗免裂解白细胞分析(三种方法)无需洗涤/裂解检测人全血中的白细胞简介从人的全血中分离并检测白细胞的传统方法十分耗时，且通常需要大量处理和富集方可进行分析。
Coulter Epics XL流式细胞仪四色荧光补偿自动设置方法的改进
１ １ 仪器 ．
１２ 试 剂 ．
Ｃ ｕｔｒ ｐｃ Ｌ流式细胞仪 。 ｏｌ ｉｓ ｅＥ Ｘ
维普资讯
医学创新研究
２０ ０ ７年 ５月
第 ４卷
第１ ４期
ＭＥ Ｉ ＩＥ Ｉ Ｎ Ｖ ＴＯ Ｅ Ｅ Ｒ Ｈ Ｄ ＣＮ Ｎ Ｏ Ａ Ｉ Ｎ Ｒ Ｓ Ａ Ｃ
．
．
蓦 曩露誊 薯荔 专 碧磐 蠢爹誊 誊童雾 萎 缀鸯 曩誊垂零 撂磐爹 磐季 参 爱 垂 善 曩誊 ０疆 薹 爹 謦誊 蓦 彗 簦嚣譬 季 ≯ 努； 孝雷
１ 材 料
２ ２４ 依次 上第 ２支 、 ３支 、 ４支 、 ５支 、 ６支试 管 。在 ．． 第 第 第 第
上第 ６支试 管 时 ， 仪器 不会 自动停 止。此 时打 开仪 器控 制 （ ｙ ｃ— ｔｍ ｔ ｏｔ １菜单下 “ ｃ ｅｕ ” ｏ ｅ ｒ ｎｒ ） ｅｃ ｏ Ａ ｑｓｔｐ 对话框 ， 勾掉 “ ｅｕ ｄ ” 仪 ＳｔｐＭｏｅ ， 器将 自行停止 。此 时补偿设 置 已经完 成。打开 “ ｏ ｐｎａ ｏ ” ｃｍ ｅ ｓｔ ｎ 对 ｉ
Ｆ ３： ． Ｆ ＴＣ—Ｆ ４： ． Ｐ —Ｆ ： ． Ｐ —Ｆ ３： ２ ４， Ｅ —Ｆ Ａ ： ５ １ Ｅ Ｌ ７ ３， Ｉ Ｌ ２ ０； Ｅ Ｌ１ ０ ９， Ｅ Ｌ ５． Ｐ Ｉ １ ． ； ＣＤ —Ｆ ： ． Ｅ Ｌ１ ０ ３， ＣＤ —Ｆ ２： Ｅ Ｌ ６ ７， ＣＤ —Ｆ ４： ０ ２； Ｃ Ｌ ４ ． Ｐ ５一Ｆ ： Ｌ１
Ｐ Ｌ 程序 。 Ｎ”
流式细胞仪是集 电子技术 、 计算机技术 、 激光技术 、 流体理 论 于一体 ， 在免疫学 、 血液学 、 瘤学 、 肿 细胞 生物 学等 临床 医学 和基
础 医学研究领域广泛 应用 的一 种非 常先进 的检 测仪 器。随着 人 们对细胞研究 的深入和流式 细胞 技术 的发展 ， 人们 已不局 限于利 用单色荧光标记去研究 ， 而需 要对细胞进行多色荧光 分析 。用 流 式细胞术进行多色荧光 分析所 用 的荧 光染料 都具 有较宽 发射 光
流式细胞仪主要技术参数
流式细胞仪主要技术参数1.光学系统：1.1*激光配置:配置488nm和638nm两根全固态激光器，激光功率均大于等于50mW以上；1.2检测参数：可同时激发和检测6色荧光.1.3光路设计：固定校准的光路设计，智能监控确保激光稳定工作。
光学滤光片可由用户根据实际应用自行更换，无需专业人员调校；1.4采用专利的FAPD（Fiber Array Photo Detector）能够达到5倍于传统高性能PMT的光电转换效率；1.5检测器电压可以调节，以适应不同特性样品的检测，提高实验灵活性；1.6光信号收集系统, 能将大视野范围内的光信号准确地传递到接收光路中，最多可以支持到7个空间独立的激光同时激发的信号收集；1.7*系统具备进一步升级的能力，最高可升级至3激光13色。
2.分析性能：2.1*颗粒检测能力：可准确区分0.1um、0.2um和0.3um的细胞或微粒；2.2*荧光灵敏度：FITC的荧光灵敏度少于30 MESF，PE的荧光灵敏度少于10MESF；2.3荧光分辨率：CV<3%（G0/G1期最高峰）；2.4无需微球的绝对计数功能，在检测的同时即可自动计算样本浓度，结果准确。
3.电子系统：3.1信号处理精度：24比特原始信息量；3.2高达107的线性动态范围，可以将强信号和弱信号都完全显示在一张图上；3.3*支持多色荧光信号共同采集，信号获取速度（上样速度）达到30,000个/秒；3.4荧光补偿：全矩阵荧光补偿，可脱机补偿，离线分析；4.液路系统：4.1半自动化上样系统，具有自动混匀和自动清洗功能，降低样本间交叉污染；4.2液流系统日常维护简单、清洗简便，自带开关机程序；4.3*上样速度：除常见低、中、高速外，用户可连续自定义样本进样速度；4.4最少上样量（即样本死体积）为10μL5.软件功能：5.1操作系统：Window 7或以上版本；5.2*系统语言：支持中文、英文双语言；5.3基本分析软件功能：必须具备图形叠加功能；具备实时分析、细胞绝对数分析、IQ自动GATE分析、彩色GATE分析、RATIO分析、去粘连分析。
流式细胞仪结果分析
CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例
六、自身免疫病相关HLA抗原分析
HLA-B27可出现在58%～97%的强直 性脊椎炎 As 患者
七、移植免疫中的应用
FCM作为一个强大的技术平台,已应用于多个领 域,其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛， 目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞 术的交叉配型 Flow cytometry cross-matching, FCXM 和群体反应性抗体 Panel reactive antibody, PRA 检测，
样本来源：各种细胞 如外（ZHOU）血,骨 髓,实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞 ,微生 物,人工合成微球等， 检测大小：一般是0.5um～40um
流式细胞仪的组成
液流系统 光学系统 数据处理系统
分选系统
分析型流式细胞仪
分选型流式细胞仪
液1 液流流系统
流动室
流动室 Flow cell 是液流系统的核心部件,流动室是由石英 玻璃制成,单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕通过流动 室内一定孔径的孔,检测区在该孔的中心,细胞在此与激光 垂直相交，
荧光染料的特性
•激发波长 EXCITING •发射波长 EMISSION
荧光补偿
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选主 要是在对具有某种特征的细胞需进 一步培养和研究时进行的，
一 分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
微小的乳胶微球分别染成上百 种不同的荧光色 固相芯片是用 探针在芯片上的坐标位置给基 因的特异性编码；而液相芯片 则是用颜色来编码
流式细胞分析中荧光素选择问题探析
流式细胞分析中荧光素选择问题探析【摘要】选择多色流式细胞中荧光素最佳的组合是一个复杂的过程。
本文总结了常用流式细胞荧光素和多色流式细胞中荧光素选择的原则。
帮助大家选择多色流式细胞中荧光素，避免重复试验和错误。
【关键词】流式细胞；荧光素近十年来流式细胞仪已经成为临床医生、免疫学家和细胞生物学家必不可少的工具，这项技术在不断进步。
流式细胞仪的多参数细胞分析这一独特的功能让大多数细胞分析成为了可能。
coon首先提出了荧光抗体标记细胞内的目的蛋白技术，在20世纪80年代，细胞亚群仅仅通过检测单一的细胞表面标志物来确定，使用的单抗和荧光素很受限制。
基因表达技术的诞生和新的单抗以及荧光素的获得使更复杂的多参数分析成为可能。
荧光素受到一定波长的激光激发后，释放出能量并发射出一定波长的荧光.因此，我们在选择荧光素时应注意各种荧光素的激发波长，以选择正确的激光器.例如fitc和pe、pi等的激发波长为488nm，apc等激发波长为630nm。
fitc、pe、pe-cy5为目前流式细胞仪的常用荧光素，基本能满足日常临床和科研的需要。
随着多色流式细胞仪的出现，新荧光素和标记抗体也得到了长足发展。
然而为实验中所需抗体选择最佳的荧光素组合是一个复杂的过程。
如何选择多色流式细胞仪检测试剂组合，避免重复试验和错误，增加你实验成功的机会。
试剂的选择首选是根据您仪器配置开始的。
仪器中所装配的激光器和探测器的型号和数量决定了你的仪器的光学系统能否激发某个荧光素，并能否正确地检测某个荧光素组合。
本文总结了一些常用流式细胞荧光素和多色流式细胞中荧光素选择的原则。
1常用荧光素的种类及特性［1］1.1fitc（fluorescein）又称异硫氰酸荧光素，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；fitc的最大发射波长为525nm，在流式细胞仪的fl1通道检测。
1.2pe（r-phycoerythrin）又称藻红蛋白，有r-pe和rd1的别称，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；pe的最大发射波长为575nm，在流式细胞仪的fl2通道检测。
流式细胞术实验技巧及数据分析
64um
激发光源与光束成形系统
20um
强度
32um 0 32um
这种椭圆形 光斑的检测 区保证每个 细胞分别受 到光照且受 检时受到一 致的光照
FCM的单细 胞照明技术
荧光光谱重
FITC和PE荧光光谱重叠
荧光补偿
FL2
Uncompensated vs Compensated
FL1
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻
调节性T细胞检测
G3=R1*R3 G4=R1*R4
凋亡细胞测定
凋亡细胞测定
细胞凋亡检测
阴性的设置
血小板检测
血小板检测
血小板检测
血小板检测
谢谢
做事情尽量要主动，主动就是没人告诉你，而你在做着恰当的事情。 好习惯的养成，在于不受坏习惯的诱惑。 世界上只有想不通的人，没有走不通的路。 既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 人而无信，不知其可也。——《论语·为政》 世间的许多事情都如此。当你刻意追求时，它就像一只蝴蝶一样振翅飞远；当你摒去表面的凡尘杂念，为了社会，为了他人，专心致于一项事情时 候，那意外的收获已在悄悄地问候你。 不抱有一丝幻想，不放弃一点机会，不停止一日努力。 不过，一切纪律都当小心地施用，除了诱导学生去把他们的工作完全作好以外，没有别种目的。——夸美纽斯 敢于质疑自己认为不相信的事情，并追究其中的道理。 天下之事常成于困约，而败于奢靡。——陆游 友情，是人生一笔受益匪浅的储蓄。这储蓄，是患难中的倾囊相助，是错误道路上的逆耳忠言，是跌倒时的一把真诚搀扶，是痛苦时抹去泪水的一 缕春风。 你永远要宽恕众生，不论他有多坏，甚至他伤害过你，你一定要放下，才能得到真正的快乐。
双克隆细胞周期分析
flowjo流式调节补偿操作步骤
flowjo流式调节补偿操作步骤
以下是使用FlowJo软件进行流式调节补偿的一般步骤：
1. 打开FlowJo软件并导入流式数据文件。
2. 点击“样品列表”中的样本以选择要进行补偿的样本。
3. 在工具栏中点击“补偿”按钮，然后选择“自动补偿”或“手动补偿”选项之一。
- 自动补偿：FlowJo将自动识别样本中的荧光双重染料所引起的流式补偿，并根据之前的实验设置进行补偿。
- 手动补偿：用户可以手动输入补偿值来校正荧光染料之间的重叠。
4. 如果选择了自动补偿，FlowJo将为每个染料的荧光信号生成补偿矩阵。
用户可以查看并修改自动生成的补偿矩阵。
5. 如果选择了手动补偿，用户需要单击“编辑补偿矩阵”按钮并在新窗口中手动输入每个染料的补偿值。
6. 当完成补偿设置后，点击“应用”按钮以应用补偿到选定的样本。
7. 可以使用鼠标右键点击样本并选择“统计”选项，以查看补偿后的数据。
8. 用户可以对样本进行进一步的数据分析和可视化，或选择将补偿后的数据导出为不同格式的文件。
请注意，以上的步骤仅为一般流程，FlowJo的界面和操作可能会因不同版本的软件而略有差异。