流 式 细 胞 仪 补 偿 设 置
流式细胞仪操作方法
一、样品制备1、取样（大约1×106 cells），离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞，﹣20℃冻存过夜。
分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100μl 的Rnase（GenScript试剂A），37℃水浴30min，然后再加入400μl的PI染液（GenScript试剂B），在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。
每个样品至少获取2×104cells，二、上流式测细胞1.1、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow），拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。
检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。
确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput）、变压器电源，稳定5分钟。
将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。
如果需要打印，打开打印机电源。
打开电脑（密码：BDIS），等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。
1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。
若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。
关闭液流抽屉。
执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell中的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流出）。
结束后自动STANDBY，5分钟后即可进行试验。
2.1、从苹果画面中选取CELLQuest，最大化，选散点图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H（选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。
流式细胞仪介绍 ppt课件
Forward Light
Detector
Cell Surface
Area
相对荧光强度（FL） (需探针标记)
是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出
的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。
区分阴阳性：通过荧光强度可将同一个细胞群体
中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分
开来。
区分阳性强弱：也可以将阳性细胞中的高FL的细
非常节省细胞，对于科研珍贵标本尤为重要！
绝对的细胞计数，无需计数微珠，细胞培养后往往需要细
胞计数仪，可以完全代替细胞计数仪。
自动标记，自动进样，自动清洗，节省时间。
自动补偿，对多色分析自动生成补偿数值
小巧的台式机设计,低噪，低热
非加压系统进样
(25)
34
仪器的竞争分析
BD的各种机型（一）
无加压系统
溶液瓶附着在仪器上
仪器状态能够通过溶液瓶的不同颜色来指示
软件基本特征
12‘’触摸屏（内嵌）
Live support 远程网络服务，德国工程师进
行远程在线检修机器
VGA 接口 (连接第二个显示器或者代替的显示
器)
功能强大、易于操作
——直观的操作界面 (用于仪器控制, 数据获取和数据
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流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 - 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡
线粒体膜电位变化检测细胞凋亡实验原理JC-1（5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide）是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想荧光探针。
可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。
在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光（FL-2 通道）；在线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1 为单体(monomer)，可以产生绿色荧光（FL-1 通道）。
这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。
常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。
线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。
通过JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。
JC-1 单体的最大激发波长为514nm，最大发射波长为527nm；JC-1 聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。
实验用品1.12⨯75mm 的Falcon 管和15ml 聚苯乙烯离心管2.微量加样器和加样头3.线粒体检测试剂盒（货号551302，100tests），包括JC-1和10 ⨯ Assay Buffer, 注：每个KIT 包括 4 小瓶JC-1 试剂，每小瓶试剂足够检测25 个样本4.离心机5.CO2 培养箱6.流式细胞仪样本制备图1：试剂准备和JC-1 染色步骤总揽1.在JC-1粉末中加入125ulDMSO使其充分溶解，配成JC-1 Stock Solution，需根据实验的量分装-20度保存。
2.根据样本量配制JC-1 Working Solution，每个样品500ul 1×Assay Buffer + 5ulJC-1 Stock Solution。
《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡Annexin V 检测细胞凋亡 (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7)实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits 试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)Annexin V 检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。
实验用品1. 一次性12×75mm Falcon试管。
2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。
33. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
流式细胞仪
流式细胞仪的机型
1. 台式机 检测和分析 B.D. : FACSCalibur; LSRII; LSRI
2. 大型机 分选细胞 B.D. : FACSVantage ；FACSAria Beckman Coulter: MoFlo （DAKO）
荧光抗体的搭配
理论上，不同通道检测的参数可以同时进 行检测。但是如果进行3个荧光参数的检测， 尽可能的选择只需要调节一对参数之间的 补偿的荧光。 如，FL1+FL2+FL4; FL1+FL3+FL4; 注意：PE-Cy5和APC不能同时检测。
流式细胞仪的数据显示和分析
一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。 1．单参数数据显示和分析— 一维直方图
90 Degree Light Scatter
Laser
FALS Sensor
SSC 与入射光成 90 ° 的光，与 细胞内部复杂度 相关，颗粒密度
90LS Sensor
根据FSC/SSC可以将全血中的淋巴细胞，单核 细胞和粒细胞分开
荧光参数 自发荧光：未经荧光染色，细胞内部的荧
光分子经激光照射后发出的荧光信号。 自发荧光的细胞成分： 核黄素，细胞色素等。 死亡细胞的自发荧光较高 需要设置阴性对照。
F/P FITC, PerCP: 2-9; APC, PE: 1; PE-Cy7, APC-Cy7: 1, N;
抗原密度 高丰度抗原：任何荧光素；低丰度抗原：PE，APC
染色指数 自发荧光
高：APC； 低：FITC 非特异形结合
FcR; 荧光自身
直接标记
CytoFLEX流式细胞分析仪快速入门
1. 每隔一个月清洁一次流动室。 a. 机器待机时，选择“细胞分析仪”菜单中的深度 清洁，然后等待至过程结束。
注意
可能会出现仪器损坏。请勿将清洁溶液放置在流动室中超过 24 个小时。 b. 等待半个小时，然后选择充注以清除剩余清洁溶液。 c. 等待至充注循环完成，然后运行“日常清洁”。
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显示并保存。
• 结果部分的绿色图标 • 结果部分的红色图标
表明通过。 表明失败。
6. 若 QC 失败，请充注仪器、初始化并重复操作 QC。
注释 若 QC 同一天连续失败两次，请联络 Beckman Coulter 代表。
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CytoFLEX 流式细胞分析仪快速入门 数据采集
数据采集
创建实验
重要 对于每个新批次编号，下载对应的目标值文件，并参考步骤 2.
4. 使用屏幕左侧的批次编号-下拉列表 球对应的批次编号。
，选择与 QC 荧光微
5. 选择 始 QC。
，将已准备的 QC 样品试管插入样品试管托架，然后选择
以开
注释 QC 可能需要数分钟。QC 荧光微球的最低流速为 100 事件/秒。一旦完成，结果就会自动
4. 请熟悉工具栏。
图形 统计资
料 层级
5. 利用“图表”工具
门 缩放 标尺
增益 阈值 撤消/恢复
新建所需直方图或点状图。
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CytoFLEX 流式细胞分析仪快速入门 数据采集
6. 设置所需样品流速，然后选择“采集”面板上的
，以起动激光器和流体。
7. 将样品管装入样品端口，然后选择
以开始采集和显示数据。
关闭
1. 从“文件”菜单打开任一实验，并初始化仪器。 2. 在“细胞分析仪”菜单中选择日常清洁。
荧光补偿的名词解释
荧光补偿的名词解释荧光补偿（Fluorescence Compensation）是一种在流式细胞仪等光学设备中常用的技术，用于解决多重标记实验中荧光通道的重叠问题。
在多重标记实验中，不同的荧光标记物常常发射在相似的波长范围内，导致光谱的重叠，影响数据的准确性和解读。
荧光补偿通过数学计算，消除不同通道之间的干扰，使得每个标记物的信号能够被准确地检测和分析，并最大程度还原每个标记物的表达情况。
荧光补偿主要基于荧光标记物的光谱特性和荧光衰减规律。
当多个标记物同时存在时，它们的发射光谱线会发生重叠，使得接收器接收到混合信号。
为了正确地区分每个标记物的信号，研究人员需要对重叠的光谱进行定量分离。
在进行荧光补偿之前，需要收集一些关键的实验数据，包括每个标记物的单标控制样品以及多重标记实验样品。
通过对单标控制样品进行单独的荧光信号检测，可以得到每个标记物的光谱特性，并确定它们的发射峰值和衰减速率。
而多重标记实验样品则提供了由多个标记物组成的复杂光谱，用于计算和补偿干扰。
荧光补偿的核心原理是使用补偿矩阵（compensation matrix）来完成。
补偿矩阵是一个方阵，用于描述不同通道之间的荧光重叠情况。
在补偿矩阵中，每个元素表示一个通道接收到其他通道的荧光信号的贡献比例。
通过计算荧光重叠的程度和光谱特性，可以得到补偿矩阵的数值。
一旦获得了补偿矩阵，就可以对多重标记实验样品中的荧光信号进行补偿。
根据补偿矩阵中的数值，可以根据各通道的发射光强和接收到的光谱重叠情况，将每个通道的信号进行调整和分离，使得实验结果准确无误。
荧光补偿的精确性和可靠性对于多重标记实验结果的解读至关重要。
一些研究发现，如果不进行荧光补偿，可能会导致对某些标记物的表达情况误判，并影响最终的分析结果。
因此，研究人员在进行多重标记实验时，应该充分理解荧光补偿技术，并进行相应的数据处理和分析。
同时，荧光补偿也是一个动态的过程，需要根据实验条件的变化进行不断的优化和调整。
BDFACSCalibur流式细胞仪操作手册
BDFACSCalibur流式细胞仪操作⼿册B D F AC S C a l i b u r流式细胞仪FACS101Handbook本课程介绍「表⾯抗原流式分析」有关之基础⼯作原理。
如希望进⼀步了解流式细胞技术应⽤，请⾄本公司⽹站订阅FACSinformation电⼦报。
如需要本课程⼿册，欢迎⾄本公司⽹站下载。
如需要免疫荧光染⾊⽅法，请⾄本公司⽹站下载。
⼀、BDFACSCalibur基本结构1.1仪器本体：1.电源开关：在BDFACSCalibur仪器右侧下⽅，先启动仪器本体，再打开计算机。
2.光学系统：BDFACSCalibur基本配有⼀⽀波长488nm的氩离⼦雷射以BDFACSCalibur基本型为例FSCDiode只收488nm波长散射光SSCPMT只收488nm波长散射光FL1PMT荧光光谱峰值落在绿⾊范围（波长515-545nm）FL2PMT荧光光谱峰值落在橙红⾊范围（波长564-606nm）FL3PMT荧光光谱峰值落在深红⾊范围（波长>650nm）3.仪器⾯板：仪器前⽅⾯板的右下⽅有三个流速控制键、及三个功能控制键。
流速控制：LO：样品流速：12?l/minMED：样品流速：35?l/minHI:样品流速：60?l/min功能控制：RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进⼊流动室。
（正常显⽰绿⾊；黄⾊时表⽰仪器不正常，请检查是否失压。
）STANDBY：⽆样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停⽌流动，雷射功率⾃动降低。
PRIME：去除流动室中的⽓泡，流动室施以反向压⼒，将液流从流动室冲⼊样品管，持续⼀定时间后，以鞘液回注满流动室。
PRIME结束，仪器恢复STANDBY状态。
4.储液箱抽屉：在主机左下⽅之储液箱抽屉。
可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器SheathFilter，及空⽓滤⽹Airfilter。
请注意⽓路减压阀VENTTOGGLE之位置。
鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。
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流 式 细 胞 仪 补 偿 设 置
众所周知
通过荧光将488nm
或其他波长的光转变为另一波长的光并由计算
机统计处理变为可读数据
激发波长 发射波长 FITC 488nm 525nm PE 488nm 575nm PE-TR 488nm 615nm PE-Cy5.5 488nm 667nm
PE-Cy7 488nm 767nm Cytomation,Moflo
机型上使用
如Coulter,Altra 或BD Calibur 或Partec
Cyflow ML 或Cytomation, Moflow)
以上列出了各荧光素的激发及发射波长的峰值
即有很宽的范围为FTIC 可以看到两者的发射波
长均为偏态分布PE 多数将其转变为575nm 左右的光对PE 则检测575nm 左右的光
就会出现发射光谱相互叠加的现象
在流式细胞仪检测光信号时
此时计算机会将此部分信号计入PE 荧光信号
中同样PE 受激后也会发出小部分525nm 左右的光
此时就需要进行一系列仪器设置下图为其他荧光素发射波长之间相互叠加情况
生 物 秀
现在商业提供的荧光直标抗体上所结合的FITC其发射光的光谱分布也十分稳定可以推算出漏入其他荧光探测器的信号占本探测器信号的百分比计算机会在其他探测器中减去根据的本探测器的信号乘以百分比后的数值
其他荧光的补偿调节原理也同上图PE
调节的补偿有PE-%FITC PE-Cy5-%PE
PE-% PE-Cy5六组补偿
由于在进行补偿之前的信号都已经过放大电路处理
同时又因为补偿电路在放大电路的后面
原荧光探测器的信号与漏进其他探测器的信号
漏进其他探测器的信号-原荧光探测器的信号x N%=0
电压特定电压对应于特定的补偿参数
需运用以上调节补偿的基本原理并结合特定的标本来实现PE双色分析
A通过调节电压在
进行调补偿时
阴性对照在此处的作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数荧光阴性对照实际为没有特异性的由于化学键
这些蛋白会与标本中的细胞结合当荧光特异性抗体与标本结合时非特异信号
所以我们只认为大于阴性对照的信号才是由特异结合而引起的信号并将其归入统计范围
FITC
上图为未调补偿的双参数直方图没有荧光干扰因为检测管中只
联科生物技术有限公司流式细胞仪补偿设置[ - 4 - ]
含有PE标记的IgG阴性对照但实际情况并不如此这个信号就是由于FITC荧光漏入PE探测器中而引起的
绝对不可变动
通过调节补偿参数可通过FastComp形象地可将PE的信号降低只能通过数字直接调节补偿百分比如下图
通过A管已将FITC此时检测FITC标记抗体与PE 阴性对照漏入PE的信号为200补偿数字为5%200-1000x5%=150同理2号位的补为15%200-1000x15%=503号位的补偿为20% 200-1000x20%=04号位补偿为30%200-1000x30%=-10 PE的信号会比原来的本底还低
所以要避免以上两种情况的出现
即PE信号与原来本底相同时
即FITC单阳性细胞的PE的平均荧光强度与双阴性细胞PE荧光强度一至
通过调节补偿需将PE中的信号恢复至与其本底一至调节荧光补偿首先要知道双阴性细胞的情况其次必须存在阳性细胞和阴性细胞
同理FITC阴性对照/PE标记抗体但前提条件是在C管中要存在FITC/PE双阴性细胞和PE单阳性细胞
在流式细胞上
补偿便调节完毕
必须做荧之间的补偿先准备各种标记的荧光阴性对照
逐管加入各种荧光标记的特异性抗体与其他荧光的对照
在日常工作中或CD3/CD4/CD8多色抗体来调节荧光补偿
在人外周血中B当加入CD3PE-Cy5/CD4FITC/CD8PE三色荧光抗体时
CD3-/CD4-/CD8-细胞群
如NK细胞
CD3+/CD4+/CD8-细胞群
如杀伤型T细胞
由上可知这就满足了调节补偿的基本要求又已知PE-Cy5对于PE和FITC的干扰很小CD8PE荧光的干扰
在许多实验中此时最终观察的单参数结果而非双参数在这种情况下调节补偿的方法又略有不同只要清楚地理解补偿的形成及调节原理详细的方法见有关章节涉及设门的实验方案
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