流式细胞仪的荧光补偿问题
流式细胞术补偿原理
流式细胞术补偿原理在流式细胞术中，常用的染料是荧光染料，它们可以结合到细胞表面的分子上或者进入细胞内部。
然后，荧光标记的细胞通过流式细胞仪连续流过一个细胞流，被激光器激发后发出荧光。
流式细胞仪可以同时检测多个不同波长的荧光信号，从而可以对不同荧光标记的细胞进行鉴定和分析。
然而，由于不同荧光染料的荧光光谱有重叠的部分，比如激发光源和发射波长之间的重叠，会使得信号之间相互干扰，从而给正确的结果带来困难。
为了消除这种干扰效应，需要进行补偿。
补偿的目的是将所有的荧光信号重新调整到正确的波长，以使得不同波长的信号不会干扰或者叠加在一起。
补偿的原理可以通过以下步骤进行解释：1. 确定细胞表达的荧光标记物及其荧光信号波长，如使用荧光标记的抗体来表达并鉴定特定细胞表面分子。
每个荧光染料都会有一个特定的波长范围，例如激发波长（excitation wavelength）和发射波长（emission wavelength）。
2.测定每个荧光染料的单独标记细胞的荧光，即只用一个荧光染料来标记细胞样品，并分别进行流式细胞术测定。
这样可以确定每个染料在不同波长下的荧光强度。
3.检测由多种荧光染料标记的细胞样品的各种荧光信号重叠情况。
将不同荧光染料标记的细胞样品混合在一起，并同时进行流式细胞术测定。
观察各个荧光信号的强度，并发现是否存在信号之间的重叠。
4.补偿的步骤是根据单独标记的细胞样品的荧光信号和混合标记的细胞样品的荧光信号重叠情况，进行计算和调整。
根据细胞样品混合的实验结果，可以利用计算公式或者自动化计算软件来进行补偿。
补偿的结果是通过调整各个荧光信号的权重，重新分配各个波长信号的荧光强度。
补偿会根据标记的染料之间的特异性重叠情况和强度差异而不同。
一些情况下，可以通过选择不同的染料来避免重叠或者使用荧光免疫组化等方法。
如果无法避免荧光重叠，补偿是不可或缺的步骤。
总而言之，流式细胞术补偿原理是通过对单独标记和混合标记的细胞样品的荧光信号进行测定和比较，采用计算或者计算软件进行调整，以消除不同荧光染料之间的重叠效应。
细胞凋亡做光补偿
细胞凋亡做光补偿制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：a) 没有染色的细胞;b) 仅用荧光标记的annexin V染色的细胞;c) 仅用PI染色的细胞.1. 上样未经染色的细胞，在线性FS-SS点图上显示细胞并设门圈出目标细胞群体。
注意：细胞在经培养后光散射信号会发生变化。
要注意使用侧向散射光设门来识别出这些已改变的细胞。
2.建立LogFL1-LogFL3双参数点图并分析以上光散射图中设门的细胞；保证>98%的细胞处于在X、Y轴Log 1为边界的左下象限中心区域。
3. 检测annexin V-FITC单染的细胞并检查FL1-FL3散点图，保证在左上和右上象限内没有颗粒。
如果有颗粒出现在上端象限则说明有荧光渗漏；此时FL1的荧光被FL3 PMT检测到了。
为了纠正这种现象，增加FL1漏到FL3荧光的补偿%（这可能在1-5%之间）。
如果这个调节没有有效地去除FL3的阳性信号，此时要降低FL3 PMT的电压。
4. 检测PI单染的细胞并检查FL1-FL3散点图，保证在右上和右下象限内没有颗粒。
如果有颗粒出现在右侧象限则说明有荧光渗漏；此时PI的荧光被FL1 PMT检测到了。
为了纠正这种现象，增加FL3漏到FL1荧光的补偿%（这可能在15-25%之间）。
如果这个调节没有有效地去除FL1的阳性信号，此时要降低FL1 PMT的电压。
5. 如果在以上调节补偿过程中更改了PMT的电压，我们建议重复3、4步骤，确保不引起过度荧光补偿。
过度补偿可以从阳性细胞十分贴近从标这一现象观察出来。
一个恰当的补偿应该是单阳性细胞荧光强度与落在左下Log 1为边界象限中间阴性细胞的荧光强度一致。
6.因为许多未处理的细胞群体中存在一定数量的annexin V和PI双阳性的细胞，运用annexin V 试剂盒来检测凋亡必须从处理过的细胞中扣除这些原本就存在的双阳性细胞。
7.根据未处理细胞或对照细胞经annexin V和PI染色后在流式细胞上分析的结果来设定十字门的位置，FL1和FL3的划定方法如下：a. 设定FL1标尺位置: 处于左下象限内的大群细胞是annexin V染色阴性的细胞（一般这些细胞会在FL1轴方向上升至2个对数坐标值）。
多色流式细胞术-荧光素和脱机补偿(ppt课件)
PE-Cy5.5标记抗体
开创荧光标记的新纪元
发射波长范围广:由近紫外-可见-近红外 适于多色分析和制成Tandem荧光染料 毫无例外地得到最好, 最亮的标记物
Alexa Fluor标记抗体特性
多色流式细胞术的必要性
CD4/CD8绝对计数 白血病/淋巴瘤免疫分型 微小残留白血病 祖细胞分析 树突状细胞分析 Naive/Memory T细胞亚群 细胞凋亡分析 增殖/活化分析 细胞周期分析
其它临床/科研应用
多色流式细胞术的必要性
BLOOD, 2000; 96(8): 2691-6
亮度(Brightness)
Alexa Fluor标记物的荧光强度远高于其它标记物
光稳定性(Photostability)
Alexa Fluor标记物的光稳定性强于大多数其它荧光标记物
pH不敏感(pH insensitivity)
Alexa Fluor标记物在很宽的pH范围内均保持高荧光强度
水溶性(Water solubility)
由近紫外可见近红外毫无例外地得到最好最亮的标记物适于多色分析和制成tandem荧光染料wwwgotofcmcomalexafluor标记抗体特性亮度brghtnessalexafluor标记物的荧光强度远高于其它标记物光稳定性photostabialexafluor标记物的光稳定性强于大多数其它荧光标记物ph不敏感phalexafluor标记物在很宽的ph范围内均保持高荧光强度水溶性watersolubialexafluor染料水溶性好因此标记时无需有机溶剂wwwgotofcmcomalexafluor488fitc亮度光稳定性carboxyfluoresceinoregongreenalexafluor488ph敏感性wwwgotofcmcom标记抗体wwwcaltagcomwwwgotofcmcom标记抗体wwwcaltagcomwwwgotofcmcom标记抗体wwwcaltagcomwwwgotofcmcom亮度antb220alexaflur光稳定性极好wwwgotofcmcom标记抗体wwwcaltagcomwwwgotofcmcom脱机补偿necompensatwwwgotofcmcomwwwgotofcmcom多色分析的利器脱机补偿necompensat减少操作时间和样品用量纠正误操作wwwgotofcmcom多色分析的利器脱机补偿necompensatwwwgotofcmcom所有产品与软件信息请登陆wwwgotcmcom免费电话
流式 荧光负值
流式荧光负值摘要：1.流式细胞仪的工作原理2.荧光负值的概念和产生原因3.荧光负值在流式细胞仪中的应用4.荧光负值的影响因素和解决方法正文：流式细胞仪是一种广泛应用于生物学研究的实验仪器，它能够快速、准确地对单个细胞进行多参数分析。
荧光负值是流式细胞仪分析过程中常见的一种现象，对细胞分析结果产生重要影响。
本文将从以下几个方面介绍荧光负值的相关知识。
首先，了解流式细胞仪的工作原理。
流式细胞仪通过激光束对单个细胞进行照射，激发细胞内的荧光染料产生荧光信号。
根据荧光信号的强度和波长，可以推测细胞表面标记物的表达情况，从而实现对细胞的多参数分析。
其次，荧光负值的概念和产生原因。
荧光负值是指在流式细胞仪分析过程中，部分细胞产生的荧光信号低于背景荧光信号的现象。
这种现象的产生原因主要有两个：一是细胞内荧光染料的非特异性结合，导致部分荧光信号无法正确反映细胞表面标记物的表达情况；二是激光束在照射过程中对细胞产生的热损伤，使细胞内的荧光染料失去活性。
接着，荧光负值在流式细胞仪中的应用。
荧光负值可以作为评估流式细胞仪分析质量的重要指标，通过监测荧光负值的变化，可以判断分析过程中是否存在非特异性结合或热损伤等问题。
同时，荧光负值还可以用于评估细胞表面标记物的表达水平，为生物学研究提供重要依据。
最后，荧光负值的影响因素和解决方法。
影响荧光负值的因素主要包括荧光染料的质量、激光束的照射强度和细胞样本的处理方法等。
为减少荧光负值的产生，可以采取以下措施：一是选择高质量的荧光染料；二是适当调整激光束的照射强度，避免对细胞产生过度热损伤；三是采用适当的细胞样本处理方法，以保持细胞活力。
总之，荧光负值是流式细胞仪分析过程中常见的现象，对细胞分析结果产生重要影响。
流式细胞仪荧光补偿[整理版]
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流式细胞仪荧光补偿[整理版]流式细胞仪荧光补偿(一)在流式细胞仪分析中用到的“荧光补偿”这个术语是指修正荧光渗漏的过程,如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。
荧光补偿过程从原理上来说相对简单，但实际上涉及许多精细、敏感的方面从而使在实践操作相当复杂。
非常不幸，荧光补偿操作可能是在流式操作中的数据采集和分析等步骤中最少被了解和掌握的内容，可能是因为在介绍它时经常要用到线性代数来计算，并且还要求了解它的产生原理。
然而，正确的荧光补偿对于许多流式分析来说绝对是至关重要的，特别是对现常见的多抗原荧光表达强度分析。
因为荧光补偿常被误解、误用并被许多不正确的观念所包围，许多实验室的荧光补偿设置都不正确。
本章的一个部分将剖析有关补偿的一些疑惑问题。
图1显示在设置荧光补偿中常犯错误。
本章将致力于从以下方面阐述流式细胞仪荧光补偿问题:为什么它是必须的，它是如何通过硬件或软件来完成的，荧光补偿是如何时影响数据视觉效果的，最后是如何设计一个最佳的实验来获得一个正确的荧光补偿。
通过完整地阅读本章节，读者将学会为实验正确地设置荧光补偿并在出版物中识别出补偿设置不当的数据，并能够明白这些错误是如何影响分析结果的。
尽管全面的阐述荧光补偿不可避免地要涉及到一些线性代数的问题，但正确掌握荧光补偿并不一定要求要掌握它;在这两部分内容中的问题可根据你的意愿撇去或跳过。
大部分的流式用户不能正确回答图1中的三个问题。
对于问题1的正确答案是“样本2”。
对于问题2，答案中十字门虚线的位置就不正确。
最后，第三个问题的正确答案是:“不可能决定哪个图形中的荧光补偿是正确的”，因此其中没有哪个可以说中正确的。
如果一个正确的荧光补偿对于流式数据分析这么重要，并且又这么少的人知道如何正确地去设置它，而为什么到目前为止流式细胞仪的分析结果还都不错。
对于此问题的简单答案是绝大多数类型的数据分析并不绝对需要正确的荧光补偿。
此问题的另一个答案是不正确的荧光补偿在双色或三色分析中显得并不十分重要。
流式 荧光负值
流式荧光负值是一种在流式细胞术中常见的现象，指的是细胞在经过荧光染色后，其荧光强度呈现负数值。
这种现象可能会给实验结果带来误导性的影响，因此需要对其进行深入了解和研究。
1. 流式细胞术的基本原理流式细胞仪是一种通过激光散射和荧光检测技术对单个细胞进行分析的仪器。
在流式细胞术中，首先需要将待检测的细胞样品经过荧光染色，荧光染料会与细胞内的特定结构或分子发生特异性反应，从而产生荧光信号。
然后，将荧光染色后的样品注入到流式细胞仪中，通过激光束对单个细胞进行扫描，并根据细胞散射和荧光强度的不同，将细胞分类并计数。
最终，可以得到不同细胞亚群的数量、荧光强度等信息。
2. 流式荧光负值的产生原因流式荧光负值的产生原因比较复杂，可能与细胞的生理状态、荧光染料的性质、流式细胞仪的设置等多方面因素有关。
首先，细胞的生理状态可能会影响其荧光信号的强度。
例如，在细胞凋亡或坏死等情况下，细胞内部的荧光染料可能会被释放出来，导致其荧光强度下降，从而产生负数值。
其次，荧光染料的性质也可能会影响流式荧光负值的产生。
一些荧光染料具有自猝灭现象，即当荧光染料浓度过高时，其荧光强度会出现饱和现象，反而导致荧光信号下降。
此外，流式细胞仪的设置也可能会影响流式荧光负值的产生。
例如，在设置荧光检测通道时，如果通道设置不合理或者盲区设置不当，可能会导致荧光强度低于背景噪音水平，从而产生负数值。
3. 如何避免和处理流式荧光负值为了避免和处理流式荧光负值，可以采取以下措施：（1）选择合适的荧光染料：在进行流式细胞术前，需要根据实验需求和细胞类型等因素选择合适的荧光染料。
荧光染料应该具有良好的特异性和灵敏度，避免出现自猝灭现象。
（2）调整细胞处理条件：在进行细胞处理时，需要注意维持细胞的正常生理状态，避免出现凋亡或坏死等情况。
同时，也需要注意荧光染料的浓度和作用时间等因素，避免荧光强度过高导致负数值的产生。
（3）优化流式细胞仪设置：在进行流式细胞术时，需要根据实验需求和样品特点等因素，合理设置流式细胞仪的参数。
流式细胞仪荧光结果分析中的常见问题及解决方法
流式细胞仪荧光结果分析中的常见问题及解决方法流式细胞仪是一种用于细胞分析的实验室仪器，它能够对单个细胞进行快速而精确的定量和质量分析。
它主要通过将细胞悬浮液注入到仪器中，利用激光器照射细胞并检测经过细胞的光线散射和荧光信号，从而获取大量有关细胞形态、大小、复杂度、表面标记以及内部分子的信息。
它可同时测量多个参数，并具备高通量性能，能够快速分析数以万计的细胞，并提供详细的统计学数据。
它广泛应用于免疫学、细胞生物学、药理学、肿瘤学等领域的研究和实验中。
然而，在分析流式细胞仪得到的荧光结果时，常常会遇到一些问题，如信号强度弱、背景高、细胞群分布异常等。
本文将介绍常见问题，并提供相应的解决方法。
一、信号强度弱1. 信号补偿不正确：检查流式细胞仪上的单色阳性对照是否设置正确，并确保门控和补偿设置正确。
2. 用于检测的抗体不足：增加抗体的量或浓度。
二、荧光强度高1. 抗体浓度过高：减少每个样本中添加的抗体量。
2. 过量抗体被捕获：洗涤步骤要充分，并在洗涤缓冲液中加入吐温或Triton，以保持细胞的透化作用。
3. 封闭不足：在抗体混合液中加入1%-3%的封闭剂，并增加封闭步骤。
三、背景高/阳性细胞百分比高1. 增益设置过高/补偿过低：使用阳性对照正确设置流式细胞仪，并使用补偿减少小颗粒背景信号和降低增益。
2. 抗体过量：降低抗体的浓度，并在洗涤缓冲液中加入去污剂，确保洗去过量的抗体。
四、在应该只有一个细胞群的情况下观察到两个或多个细胞群1. 表达靶蛋白的细胞群不止一个：检查样本中包含的细胞类型预期的蛋白表达水平，并确保细胞充分分离。
2. 出现细胞双峰：细胞双峰显示为第二大细胞群，其荧光强度大约是单细胞荧光强度的两倍。
在染色前用移液枪将细胞轻柔混匀，并在细胞仪中运行之前再次混匀。
五、侧向散射背景偏高（来自小颗粒）1. 细胞裂解：确保样本中的细胞没有裂解和破碎，样本应新鲜并正确制备，避免高速离心或激烈涡旋的操作。
Coulter Epics XL流式细胞仪四色荧光补偿自动设置方法的改进
Coulter Epics XL流式细胞仪四色荧光补偿自动设置方法的改进王升;朱明清;游东生【期刊名称】《现代保健：医学创新研究》【年(卷),期】2007(000)05Z【摘要】目的探讨Coulter Epics XL流式细胞仪的EXPO32-ADC操作系统自带四色荧光补偿程序使用和改进方法.方法把自带荧光补偿程序加以改进,以同型对照代替标准的flow set试剂调节光电倍增管的电压,利用我们现有CD4-FITC,CD8-PE,CD3-ECD,CD45-pc5单标荧光抗体试剂,对仪器进行四色荧光补偿设置.结果仪器获得的四色荧光补偿值是：FITC-FL2：17.0,FITC-FL3：7.3,FITC-FL4：2.0;PE-FL1：0.9,PE-FL3：52.4,PE-FL4：15.1;ECD-FL1：0.3,ECD-FL2：6.7,ECD-FL4：40.2;PC5-FL1：0.1,PC5-FL2：0.7,PC5-FL3：1.2.结论利用改进的荧光补偿设置方法实用、简单、使用和易于掌握.【总页数】3页(P123-125)【作者】王升;朱明清;游东生【作者单位】河南安阳地区医院,河南安阳455000;苏州大学医学院重点实验室;美国贝克曼库尔特有限公司上海办事处【正文语种】中文【中图分类】R446【相关文献】1.Coulter Epics XL流式细胞仪四色荧光补偿自动设置方法的改进 [J], 王升;朱明清;游东生2.COULTER EPICS XL型流式细胞仪激光电源特殊故障维修分析 [J], 郑德柱3.EPICS XL流式细胞仪的基本原理及临床应用 [J], 詹乾钢4.流式细胞仪四色荧光标记技术在急性白血病免疫分型中的临床应用 [J], 李志芹;贺其图;李吉吉;贾国荣;卢艳;韩海燕;李静5.EPICS XL流式细胞仪的基本原理及临床应用 [J], 詹乾钢因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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A-FITC
γ1-FITC A-FITC γ1-FITC γ1-FITC A-FITC γ1-FITC A-FITC γ1-FITC γ1-FITC γ1-FITC A-FITC
B-PE
γ2a-PE γ2a-PE B-PE γ2a-PE B-PE γ2a-PE γ2a-PE B-PE γ2a-PE γ2a-PE B-PE γ1-PC5 γ1- PC5 γ1- PC5 C-PC5 C-PC5 γ1-ECD γ1- ECD γ1- ECD C- ECD γ1- ECD C-ECD γ1- PC5 γ1- PC5 γ1- PC5 γ1- PC5 D-PC5 D-PC5
发射波峰--最大发射波长
FITC--异硫氰酸荧光素
PE--藻红蛋白
PE-Cy5--藻红蛋白偶联物
荧光染色对照的设置
• 阴性对照
– 空白对照（自发荧光） – 同型（ISO)对照（自发荧光＋非特异荧光）
实验样本（特异荧光＋自发荧光＋非特异荧光）
荧光染料平均荧光强度比较
PerCP < APC < FITC < ECD < PC5 < PE
调节补偿原则
• 横平竖直 • 即X-mean或Y-mean 相等
双色荧 光补偿1
双色荧 光补偿2
CD3-CD4-CD8-
双阴
前T细胞
CD3-CD4+CD8+ CD3+CD4+CD8CD3+CD4-CD8+
双阳 单阳
胸腺皮质细胞 胸腺髓质细胞
外周血
恳请各位老师指正！
• • • •
1.荧光素为什么会出现荧光？ 2.检测前为什么需要进行荧光补偿？ 3.荧光补偿的方法有哪些？ 4.荧光补偿的原则是什么？
荧光发生的机理
室温下荧光素分子大部分处于“基态”，当荧光 素在一定波长（激发波长）的光的照射下吸收光 能后（经染色后的细胞在激光束的照射下），荧 光染料吸收能量能级跃迁，进入新的状态，称为 “激发态”，处于激发态的分子极不稳定，它可 以通过在10-9－10-7秒的极短时间内以发射一定 波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返回 到基态。这一过程称为荧光发射，也就是发光。
荧光补偿（compensation）
定义：指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素 发射光谱重叠（spectral overlap）的过程， 即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他 的干扰荧光信号。
补偿方法
手动补偿 自动补偿（flow-set) 无论手动或自动补偿都需将单种荧光素标 记的单克隆抗体分别进行单色荧光染色 ※即几色分析就需要制备几个补偿对照管
荧光素的激发光谱和发射光谱
任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱 • 激发光谱（Excitation，Ex）： – 是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范 围内的光线，也称为吸收光谱。 – 吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max • 发射光谱（Emission）： – 是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波 长范围内的荧光。 – 发射波峰（最大发射波长）：Em-Max
同型对照的选择
– 与实验染色的单克隆抗体特异性无关的 免疫球蛋白亚型； – 与染色的单克隆抗体 ①相同种属来源 ②相同免疫球蛋白及亚型 ③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度
分析类型
单色分析
管
1 2
功能
Isotype Sample1,2…… γ1-FITC A-FITC
加入的抗体
1
双色分析 2 3
Isotype
现举例进行FITC、PE、PC5三色手动补偿 1.准备ISO（阴性对照管）； IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PC5 2.通过调节电压，使阴性群体落在双阴性区 域； FITC与PE、FITC与PC5、PE与PC5
• FITC与PE
PE
FITC
3.上单染管(CD3-PC5、CD4-FITC、CD8-PE)，准备 补偿； （注： 保持电压绝对不变； 开始补偿1 Compensation2
γ1-FITC
A-FITC γ1-FITC
γ2a-PE
γ2a-PE B-PE
4
1 2 三色分析 3 4 5 1 2 四色分析 3 4 5 6
Sample1,2……
Isotype Compensation1 Compensation2 Compensation3 Sample1,2…… Isotype Compensation1 Compensation2 Compensation3 Compensation4 Sample1,2……