流式细胞仪的荧光补偿问题-
流式补偿的调节教程（待整理）
流式补偿的调节教程（待整理）A图与B图的区别是A图PE通道的电压调得⽐较合适，⽽B图PE通道的电压调得太低了，你可以明显发现B图的细胞好像趴在X 轴上很难看。
应该说A图将调节补偿的过程描绘得还是⽐较详细的。
调节的是PE-FITC的补偿，也就是说将PE通道中来源于FITC的荧光信号减掉，使PE通道代表PE荧光素的信号。
图A1已经调了部分，但是还不够，也就是说没有将PE通道中来源于FITC的荧光信号完全去掉，还有部分存留；图A2在图A1的基础上⼜减了⼀些，但是还是不够；图A3是正确调节补偿后的结果；图A4过度调节补偿了。
原⽂的意思是A2才是正确补偿,A3轻微经过补偿了,数年前我研究这东西耗了⼀个星期,并且咨询过该⽂章的作者。
kern6549 的观点主要出现在流式仪器说明书或技术⽀持对补偿的阐述中，这种情况是在没有任何检测误差极端理想的情况下才会出现。
补偿是个很复杂的东西，涉及很多数学上的问题，不是学⽣物医学的⼈应该去深究的，除⾮你是流式操作者，并且对结果⾮常执着。
为此我曾找了本线性代数看了⼀个⽉，如果你有兴趣可以看看2001年cytometry partA上⼀篇关于补偿数学模型的⽂章，但前提是你有⾜够的数学知识。
补偿的确是⼀个⾮常复杂的东西，影响补偿⼤⼩的因素也⾮常多，与机器的型号、通道的设置、流式荧光素的选择、抗体的浓度、测试的细胞等都会影响补偿的⼤⼩。
但是调节补偿所要达到的⽬的是⾮常明确的，具体到上⾯的图，图A3有轻微过补偿的观点也是可以接受的，但是如果说A2是正确调节的补偿我是不同意的，可以说A2是轻微补偿调节不⾜。
但是，如果A2和A3⼆选其⼀的话，我肯定选择A3为正确补偿。
对于第⼆副图的结果我也是不太同意作者的观点的。
调节补偿可以选择的荧光素偶联抗体⽐较多，达到我们⽬的的补偿设置是⽐较容易的，并不存在说在极端理想的条件下才能达到理想的效果之说。
这位作者得出这个结论我想可能有两个原因：（1）太注重数学⽅⾯的研究了。
细胞凋亡做光补偿
细胞凋亡做光补偿制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：a) 没有染色的细胞;b) 仅用荧光标记的annexin V染色的细胞;c) 仅用PI染色的细胞.1. 上样未经染色的细胞，在线性FS-SS点图上显示细胞并设门圈出目标细胞群体。
注意：细胞在经培养后光散射信号会发生变化。
要注意使用侧向散射光设门来识别出这些已改变的细胞。
2.建立LogFL1-LogFL3双参数点图并分析以上光散射图中设门的细胞；保证>98%的细胞处于在X、Y轴Log 1为边界的左下象限中心区域。
3. 检测annexin V-FITC单染的细胞并检查FL1-FL3散点图，保证在左上和右上象限内没有颗粒。
如果有颗粒出现在上端象限则说明有荧光渗漏；此时FL1的荧光被FL3 PMT检测到了。
为了纠正这种现象，增加FL1漏到FL3荧光的补偿%（这可能在1-5%之间）。
如果这个调节没有有效地去除FL3的阳性信号，此时要降低FL3 PMT的电压。
4. 检测PI单染的细胞并检查FL1-FL3散点图，保证在右上和右下象限内没有颗粒。
如果有颗粒出现在右侧象限则说明有荧光渗漏；此时PI的荧光被FL1 PMT检测到了。
为了纠正这种现象，增加FL3漏到FL1荧光的补偿%（这可能在15-25%之间）。
如果这个调节没有有效地去除FL1的阳性信号，此时要降低FL1 PMT的电压。
5. 如果在以上调节补偿过程中更改了PMT的电压，我们建议重复3、4步骤，确保不引起过度荧光补偿。
过度补偿可以从阳性细胞十分贴近从标这一现象观察出来。
一个恰当的补偿应该是单阳性细胞荧光强度与落在左下Log 1为边界象限中间阴性细胞的荧光强度一致。
6.因为许多未处理的细胞群体中存在一定数量的annexin V和PI双阳性的细胞，运用annexin V 试剂盒来检测凋亡必须从处理过的细胞中扣除这些原本就存在的双阳性细胞。
7.根据未处理细胞或对照细胞经annexin V和PI染色后在流式细胞上分析的结果来设定十字门的位置，FL1和FL3的划定方法如下：a. 设定FL1标尺位置: 处于左下象限内的大群细胞是annexin V染色阴性的细胞（一般这些细胞会在FL1轴方向上升至2个对数坐标值）。
多色流式细胞术-荧光素和脱机补偿(ppt课件)
PE-Cy5.5标记抗体
开创荧光标记的新纪元
发射波长范围广:由近紫外-可见-近红外 适于多色分析和制成Tandem荧光染料 毫无例外地得到最好, 最亮的标记物
Alexa Fluor标记抗体特性
多色流式细胞术的必要性
CD4/CD8绝对计数 白血病/淋巴瘤免疫分型 微小残留白血病 祖细胞分析 树突状细胞分析 Naive/Memory T细胞亚群 细胞凋亡分析 增殖/活化分析 细胞周期分析
其它临床/科研应用
多色流式细胞术的必要性
BLOOD, 2000; 96(8): 2691-6
亮度(Brightness)
Alexa Fluor标记物的荧光强度远高于其它标记物
光稳定性(Photostability)
Alexa Fluor标记物的光稳定性强于大多数其它荧光标记物
pH不敏感(pH insensitivity)
Alexa Fluor标记物在很宽的pH范围内均保持高荧光强度
水溶性(Water solubility)
由近紫外可见近红外毫无例外地得到最好最亮的标记物适于多色分析和制成tandem荧光染料wwwgotofcmcomalexafluor标记抗体特性亮度brghtnessalexafluor标记物的荧光强度远高于其它标记物光稳定性photostabialexafluor标记物的光稳定性强于大多数其它荧光标记物ph不敏感phalexafluor标记物在很宽的ph范围内均保持高荧光强度水溶性watersolubialexafluor染料水溶性好因此标记时无需有机溶剂wwwgotofcmcomalexafluor488fitc亮度光稳定性carboxyfluoresceinoregongreenalexafluor488ph敏感性wwwgotofcmcom标记抗体wwwcaltagcomwwwgotofcmcom标记抗体wwwcaltagcomwwwgotofcmcom标记抗体wwwcaltagcomwwwgotofcmcom亮度antb220alexaflur光稳定性极好wwwgotofcmcom标记抗体wwwcaltagcomwwwgotofcmcom脱机补偿necompensatwwwgotofcmcomwwwgotofcmcom多色分析的利器脱机补偿necompensat减少操作时间和样品用量纠正误操作wwwgotofcmcom多色分析的利器脱机补偿necompensatwwwgotofcmcom所有产品与软件信息请登陆wwwgotcmcom免费电话
精选斯坦福大学流式细胞仪补偿原理_很详细
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Bead MFI 36000
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Cy7PE Calibration Aria
PE Cy7PE IgD
Stained cells
unstained cells
beads
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10 4 E-A P 10 3
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Cy7PE-A
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E-A P
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Cy5PE-A, FSC-A subset 10894.fcs Event Count: 5908
10 3 Cy7PE-A
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Diva
FlasherII
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ECY P
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PECY5-A 103 102 0
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PECY55-A
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Cy5PE 102 101
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Cy55PE: CD24 biotin
7
Fluorescence compensation
FITC fluorescence in the PE channel
Uncompensated
Coulter Epics XL流式细胞仪四色荧光补偿自动设置方法的改进
Coulter Epics XL流式细胞仪四色荧光补偿自动设置方法的改进王升;朱明清;游东生【期刊名称】《现代保健：医学创新研究》【年(卷),期】2007(000)05Z【摘要】目的探讨Coulter Epics XL流式细胞仪的EXPO32-ADC操作系统自带四色荧光补偿程序使用和改进方法.方法把自带荧光补偿程序加以改进,以同型对照代替标准的flow set试剂调节光电倍增管的电压,利用我们现有CD4-FITC,CD8-PE,CD3-ECD,CD45-pc5单标荧光抗体试剂,对仪器进行四色荧光补偿设置.结果仪器获得的四色荧光补偿值是：FITC-FL2：17.0,FITC-FL3：7.3,FITC-FL4：2.0;PE-FL1：0.9,PE-FL3：52.4,PE-FL4：15.1;ECD-FL1：0.3,ECD-FL2：6.7,ECD-FL4：40.2;PC5-FL1：0.1,PC5-FL2：0.7,PC5-FL3：1.2.结论利用改进的荧光补偿设置方法实用、简单、使用和易于掌握.【总页数】3页(P123-125)【作者】王升;朱明清;游东生【作者单位】河南安阳地区医院,河南安阳455000;苏州大学医学院重点实验室;美国贝克曼库尔特有限公司上海办事处【正文语种】中文【中图分类】R446【相关文献】1.Coulter Epics XL流式细胞仪四色荧光补偿自动设置方法的改进 [J], 王升;朱明清;游东生2.COULTER EPICS XL型流式细胞仪激光电源特殊故障维修分析 [J], 郑德柱3.EPICS XL流式细胞仪的基本原理及临床应用 [J], 詹乾钢4.流式细胞仪四色荧光标记技术在急性白血病免疫分型中的临床应用 [J], 李志芹;贺其图;李吉吉;贾国荣;卢艳;韩海燕;李静5.EPICS XL流式细胞仪的基本原理及临床应用 [J], 詹乾钢因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
有关流式荧光补偿
荧光补偿一、为什么要调节荧光之间的补偿每一种荧光素分子都发射某一特定波长范围内的光然而这些荧光的发射光谱会发生重叠有时这种重叠现象非常显著。
比如说FITC、PE 、Cy5-PE这三种荧光素都能够被488nm的氩离子激光器激发激发后的发射波谱分别是FITC的发射峰在520nm左右。
PE在575nm左右而Cy5-PE在670nm 左右。
如图为了能够同时检测这三种发射光信号我们只能通过合适的带通滤光镜来选择性地通过某一特定波长范围内的光。
滤光镜的选择依赖于荧光素发射峰的位置通常来说滤光镜要能够收集靠近荧光素发射峰波长范围内的光波。
比如说FITC我们选用530/30滤光镜既这种滤光镜能够收集515-545nm范围内的光波。
然而我们选用的任何一种滤光镜都不可能仅仅收集一种荧光染料的发射光比如FITC有一部分发射光进入到我们用来收集PE575nm的区域因此只要FITC存在我们不仅在FL1通道收集到530/30的光信号还能在FL2通道上接受到一部分FITC的发射光信号如果同时还加入了PE那么我们怎样判断FL2收集到的光信号有多少来自于PE 多少来自于FITC 呢这就是我们要提的补偿问题。
所谓“补偿”就是除去某一荧光素误入到其它荧光通道中的发射光信号。
具体来说我们必须将FL2荧光通道收集的光信号中属于FITC的那一部分减去才能确切地知道PE的发射光到底是多少。
二、怎样实现补偿荧光素有这样一个特性它被任何一个荧光通道检测到的光信号的比值例如FITC在FL1FL2通道的值是恒定不变的不会随着PMT电压仪器灵敏度的改变而变化。
因此在理想状态下我们能够通过检测FL1通道的值来确定FL2通道的值从而确切地知道怎样正确调节FL2的补偿。
这样我们才能确定实现补偿后FL2通道检测的光信号只是PE发出的不再有FITC的干扰了。
从数学上说实现从FITC到PE的补偿只需从FL2检测到的信号中减去FITC的部分理论上FL1的值越高它进入到FL2中的部分也越多因为两者的比值是不变的。
关于流式荧光标记补偿设置和荧光三标的疑问
1、准备用FITC，PE和APC进行三标，检测三标细胞占待检测细胞的百分比。
预实验摸抗体浓度时，用单标管与相应的同型对照管比较，在二维散点图上，发现部分指标除在检测通道上偏移，在无关通道上散点也有偏移，我想这就应该是补偿需要做的事情了吧。
根据预实验的结果，发现荧光的部分干扰现象，如PE检测影响APC和FITC，FI TC影响APC，而APC不影响PE和FITC等。
问题：（1）很奇怪的是FITC和APC的发射光谱距离很远，应该没有干扰才对。
为什么也发现了APC受到FITC的影响？是哪里出了问题？（2）三种荧光之间是否两两之间都必须进行补偿？是否APC对PE和FITC不需要补偿？（3）流式可以根据二维散点图检测双阳细胞所占的百分比，那么流式能否测出三标细胞占待检测细胞的百分比？如果可以，应该如何操作？（4）检测三标各管如何设置才最节省且结果最可信？APC和前二者间不做补偿。
它们不是由同一根激光激发，走不同的光通道，互相之间没有影响，因此不用。
PI＆FITC均由488nm激光激发，走相同的光学通道，两者的发射波长有重叠部分，因此要求补偿。
这样说有误导，APC和FITC/PE间确实“通常”不需要compensate（也不绝对），但不是因为激发波长不同，而是由于发射波长相差较远，overlap很少。
同是488nm激发的P E-Cy5.5就和APC有overlap，通常需要compensate。
其实compensation很简单，一个一个地run单色control，一个一个地compensate就好了。
2、还有一个问题阳性细胞和阴性细胞在散点图上应该有明显的分群，但是为什么我检测的图形只是整体有微弱偏移，而并没有明显的分群？难道是抗体浓度太低了？我也试着提高抗体浓度，提高了一倍，还是没有明显的改观。
请帮忙分析一下原因。
（1）关于这三种荧光之间的干扰问题，大家看附件里面的图就明白了，因为FITC的发射光是一个宽范围，会漏到PE里面，所以PE的检测器里会检测到FITC的光，因此需要调解补偿，去除这部分假阳性。
流式细胞仪的荧光补偿问题课件
荧光补偿不当还可能 影响流式细胞仪的定 量和定性分析结果。
荧光补偿问题可能导 致实验结果的不稳定 性和不可重复性。
荧光补偿问题的解决方法
01
02
03
04
在实验设计时，应尽量选择光 谱不重叠的荧光染料，避免干
扰。
通过软件算法和校准技术，对 荧光补偿问题进行修正和优化
。
可以使用标准样本进行荧光补 偿校准，以提高实验数据的准
流式细胞仪的荧光补偿问题课件
目录
• 引言 • 流式细胞仪的工作原理 • 荧光补偿的问题分析 • 荧光补偿问题的实验研究 • 总结与展望 • 参考文献
01
引言
背景介绍
流式细胞仪是一种在生物学、医学和 生物工程领域广泛使用的技术，可用 于对细胞进行快速、多参数的分析。
荧光补偿是流式细胞仪分析中的重要 环节，通过对荧光的补偿可以纠正仪 器对不同荧光信号的偏差和不一致性 ，提高实验结果的准确性和可靠性。
实现实时荧光补偿
开发能够实时进行荧光补偿的 流式细胞仪，提高实验效率， 减少误差。
提高荧光补偿的自动化程 度
研究能够自动进行荧光补偿的 算法和技术，减少人工操作的 误差和繁琐程度。
多维数据分析
利用多维数据分析方法，对流 式细胞仪产生的多维荧光数据 进行深入分析和挖掘，发现更 多生物标记物和疾病标记物。
L.L. Wheeless et al., Flow Cytometry
A Practical Approach, 3rd ed., Academic Press, 2016.
THANKS
感谢观看
实验步骤
详细描述实验操作流程， 包括样本准备、上机实验 、数据收集及处理等。
实验结果及分析