腺病毒质量检定方法
肠道腺病毒检测技术
肠道腺病毒检测技术
刘树强
【期刊名称】《国外医学：病毒学分册》
【年(卷),期】1997(004)002
【摘要】肠道腺病毒（ＥＡｄｓ）是仅次于轮状病毒引起儿童腹泻的病毒。
由于其不能在通常培养腺病毒的细胞系中繁殖，简便快速地检测其存在，一直是人们研究的课题。
本文总结了几种常用的检测技术，以利于不同实验室根据自身情况选择适合的方法。
【总页数】3页(P50-52)
【作者】刘树强
【作者单位】首都儿科研究所病毒室
【正文语种】中文
【中图分类】R446.5
【相关文献】
1.腺病毒及其检测技术研究进展 [J], 潘庆军(综述);朱学芝(审校)
2.化学发光法中和抗体检测技术对广州地区人5型腺病毒的流行病学研究 [J], 苏晓波;马鑫;洪喆瑜;吴后波;王友绍;陈凌
3.猪腺病毒的病原学特征及检测技术研究进展 [J], 庄金秋;梅建国;张颖;杨丽梅;李峰;沈志强
4.人腺病毒分子生物学常用检测技术 [J], 李烨;董妥;Vladimir I.Zlobin;OlegReva;
曲章义;;;;;
5.肠道腺病毒及其检测技术 [J], 杨继红;李宁宁
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腺病毒常见问题与解答
腺病毒常见问题与解答1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？有要求。
对E1和E3双缺失的腺病毒载体，比如AdMax的Kit C、Kit D等，其总包装的外源片断要求小于8 kb。
而对于只有E1缺失或E3缺失的载体，比如Kit A、Kit B等，外源片断要求小于5 kb。
注意，外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。
2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。
根据经验，完成一个完整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012VP左右.3、如何提高腺病毒的活性？提高腺病毒的活性，关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。
纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程，如果扩增的病毒滴度高，那么纯化后就会更高的。
4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR（未翻译区）的额外的碱基会影响蛋白表达吗？UTR尽可能短一些，特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。
在起始密码子ATG 前面可以加一小段（6-9bp）的碱基序列可以增强目的基因的表达，比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。
5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞？参照文献报道是很简单的办法，也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。
Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞（包括分裂和非分裂细胞），比如肝、肌肉、神经组织等。
但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞，比如乳腺癌、白血病细胞等，感染效率较低。
6、腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意哪些问题？1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。
可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。
2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。
避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。
轮状病毒、腺病毒二合一抗原检测试剂盒(乳胶法)说明书
轮状病毒、腺病毒抗原检测试剂盒（乳胶法）说明书【产品名称】通用名称：康珠生物轮状病毒、腺病毒抗原检测试剂盒（乳胶法）【包装规格】1人份/袋，20袋/盒。
【预期用途】本产品用于体外定性检测婴幼儿腹泻患者粪便中的A群轮状病毒和腺病毒抗原。
人类轮状病毒（Human RotaVirus，HRV）感染是婴儿和小孩重度脱水性胃肠炎最常见的原因，3月龄后的婴儿最可能发生重度腹泻和脱水，几乎所有人在其3~5岁时都感染过HRV。
轮状病毒于1973年被人类认识，Bishop等于在澳大利亚墨尔本腹泻儿童的十二指肠活检物通过电镜检出该病毒。
轮状病毒属于呼肠孤病毒科，为球型无包膜的双股RNA病毒。
腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90 nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。
腺病毒是DNA 病毒，主要在细胞核内繁殖，耐温、耐酸、耐脂溶剂的能力较强，一般通过呼吸道传染。
【检验原理】本检测试纸条采用高度特异性的双抗体夹心反应原理及免疫层析分析技术，试纸卡为两窗试纸卡，在试纸卡左边的窗口的试纸条上含有被预先固定于膜上测试区（T）抗A群轮状病毒抗体和质控区（C）的羊抗鼠抗体，乳胶标记垫上包被有乳胶颗粒标记的抗A群轮状病毒单克隆抗体；右边的窗口的试纸条上含有被预先固定于膜上测试区（T）抗腺病毒抗体和质控区（C）的羊抗鼠抗体，乳胶标记垫上包被有乳胶颗粒标记的抗腺病毒单克隆抗体，测试时，标本与预包被在左边的试纸条上的乳胶颗粒标记的抗A群轮状病毒单克隆抗体（或者与预包被在右边的试纸条上的乳胶颗粒标记的抗腺病毒单克隆抗体）混合，并在毛细效应下向上层析。
如是A群轮状病毒阳性，左边试纸条上的乳胶标记抗体在层析过程中先与标本中的A群轮状病毒结合，随后结合物会与固定在膜上的抗A群轮状病毒抗体结合，在测试区（T）内会出现一条红色条带。
这条带是特异性的抗体-抗原-乳胶标记抗体复合物在膜上结合形成的。
如是阴性，则测试区（T）内将没有红色条带。
aavqpcr的滴度鉴定的标准曲线
aavqpcr的滴度鉴定的标准曲线
aav载体蛋白的表达滴度检测的标准曲线。
AAV（腺相关病毒）是一种常用于基因治疗的病毒载体。
在AAV载体蛋白的表达滴度检测中，可以使用标准曲线法进行定量检测。
标准曲线法是一种通过已知浓度的标准品和未
知样品进行比较，从而确定未知样品浓度的方法。
在AAV载体蛋白的表达滴度检测中，首先需要制备不同浓
度的标准品，例如10^9、10^8、10^7、10^6、10^5、10^4、10^3、10^2、10、0.1VP/μl等。
然后使用一定量的未知样品与不同浓度的标准品进行比较，通过测定未知样品和标准品的OD值（吸光度值），绘制标准曲线。
最后根据未知样品的OD值，通过标准曲线可以计算出未知样品中AAV载体蛋白的浓度。
需要注意的是，由于AAV载体蛋白的表达滴度检测方法不
同，所使用的标准品和测定方法可能会有所不同，因此具体
操作需要根据所使用的检测方法进行相应的调整。
同时，为
了保证检测结果的准确性，建议在实验过程中遵循质量控制
原则，进行必要的空白对照和重复实验等质量控制措施。
小鼠腺病毒检验方法例析
１１ 阳性血清 ： ． 准备感 染 Ｋ Ｍ及 ＩＲ的小 鼠各 ５只， 已 Ｃ 用 经感染 了小鼠的腺病毒细胞病的有毒液体为其注射 ，一共 注射 ３周 ， 注射时使用腹腔注射 ， 每周 每只注射 ０２ ｍ 。每 －１ ｌ 个 星 期 ，在 小 鼠 感 染 前 ，从 其 的 眼 眶 中 进 行 血 样 采 取 ， ０２ ｍ／ ，并 加 入 ０ ２ ｌ Ｐ Ｓ ．１ ｌ只 ． ｍ 的 Ｂ ，将 两 者 进 行 １１ ８ ： ０的稀 释 。当进 行 完 最后 一 次 的感 染 后 ， 一 周 之后 将 其 处死 ， 在 收 集 小 鼠的 血 清 ， 行 抗 体 等 测 定 ， 用 各种 方式 比对 研 究 。 进 并 通 常 采用 的小 鼠为普 通 开放 饲 养 的 小 鼠 ，将 其处 死 后 收 集
异。
３ 结 果
ｌ 羊 抗 兔 及 羊 抗 鼠 ， Ｇ标 价 的 辣 根 ， 氧 化 物 酶 ， 两 ＿ ２ Ｉ ｇ 过 这 项均有实验室制备取得 ，其 中羊抗 鼠的过氧化物酶 由过碘 酸钠 法 制 得 。 １ 羊抗兔及羊抗 鼠 ＩＧ 荧光抗体 ： ． ３ ｇ， 这两项采用有南 京的 生 物研 究 所 生 产 的产 品 ， 号 为 ２ ０ — ８ ２ ０ — ５ 其 批 ０８ 及 ０８ ， 工作 的浓度 为 １ ６ ：。 １ １ 酶联的葡萄球菌， ． ４ Ａ蛋白： 南实验室制备所得 。 １ 被检测的动物： ． ５ 实验 所 用 的小 鼠为 普 通 开放 饲 养 的小 鼠及 通 过专 业 的渠 道 所 购 置 Ｓ Ｆ的 小 鼠 。 Ｐ １ 小 鼠腺病毒 的标准株 ： ． ６ 采用 由中国医学院医学实验的 动 物 研 究所 提 供 的 Ｃ Ｆ活 毒 的抗 原 中 所分 离 的毒株 。
一
性 ， 由于其病毒携带及排毒时间较长 ， 但 它也会诱 发疾病致 死。 尤其它会对某些种类 的仓 鼠产生致瘤性 ， 可能进一 并有
aav结合抗体检测方法
aav结合抗体检测方法
AAV（腺相关病毒）结合抗体检测方法主要用于检测样本中是否存在针对AAV衣壳蛋白的特异性抗体。
这些抗体可能对AAV介导的基因治疗产生不利影响，因此需要提前检测受试者或动物体内是否存在AAV中和抗体。
常用的AAV结合抗体检测方法包括：
1. 免疫印迹法（Western blotting）：这是一种常用的蛋白质检测方法，通过将AAV衣壳蛋白分离出来，然后与样本中的抗体进行反应，检测是否存在针对AAV衣壳蛋白的抗体。
2. 免疫荧光法（Immunofluorescence）：这是一种用于检测样本中特定蛋白质的方法，通过将AAV衣壳蛋白与样本中的抗体进行反应，然后用荧光标记物标记抗体，最后通过荧光显微镜观察是否存在特异性抗体。
3. 酶联免疫吸附法（ELISA）：这是一种常用的免疫分析方法，通过将AAV衣壳蛋白固定在固相载体上，然后与样本中的抗体进行反应，最后加入酶标二抗检测是否存在特异性抗体。
4. 免疫沉淀法（Immunoprecipitation）：这是一种
用于检测样本中特定蛋白质的方法，通过将AAV衣壳蛋白与样本中的抗体进行反应，然后进行离心沉淀，最后检测沉淀物中是否存在特异性抗体。
以上方法可以根据实验条件和需求进行选择，同时需要考虑抗体特异性和敏感性等因素。
在实际操作中，可能需要对方法进行优化和验证，以获得更准确的结果。
腺病毒测序实验方案
腺病毒测序实验方案
腺病毒和慢病毒载体测序实验方案
一实验目的: 搞清楚公司目前常用的几个腺病毒和慢病毒载体序列，进行空载体测序
二实验方法；选取公司常用的腺病毒和慢病毒载体，比如慢病毒载体H201，Y201，H101，H104，Y007;腺病毒载体AOV001，AOV002和AOV003.
通过腺病毒和慢病毒转化感受态细胞stbl3，LB培养，LB平板挑选单克隆摇菌过夜，送菌液去测序。
采用通用引物测序的方法，根据细胞平台主管黄老师提供的信息，腺病毒载体测序引物：pDC315F: acg tgg gta taa gag gcg；pDC315R: cga tgc tag acg atc cag；慢病毒载体测序引物CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG；先测序一部分，在此基础上继续设计引物，测通
三实验步骤
1 配置好LB液体培养基和LB固体培养基。
2按SOP的要求转化，把空载体转化进感受态细胞stbl3中
3 超净台中操作，在离心管中加入890μL不含抗生素的LB培养基，置于37℃摇床上，200rpm 震荡培养45min；
4 超净台中操作，取100μL转化液涂布于含抗生素(如氨卞)的LB 平板培养基，置于37℃孵箱，过夜培养。
5 按SOP得要求涂平板，挑菌和摇菌。
6 送菌液测序
7 通过测序获得载体一部分序列，继续设计引物，测通质粒
四实验的问题：因为不知道载体的序列，不方便设计引物，增大测序的困难；先使用别人推荐的引物
五预知的实验结果
测通慢病毒H201，Y201，H101，H104，Y007; 测通腺病毒AOV001，AOV002和AOV003。
病毒包装实验整体流程及原理(慢病毒、腺病毒)
广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，公司网址：有需要请联系丘先生病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1 慢病毒1.1.1 原理慢病毒( Lentivirus )是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA 慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2 特点1) 直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2) 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3) 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4) 无需任何转染试剂，操作简便。
5) 可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3 慢病毒包装简要流程：1) 含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
1) 2) 3) 4) 5)2) 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞 293T 等。
3) 培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4) 病毒的纯化和浓缩。
5) 分装、-80 C 保存。
6)滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、 腺病毒 1.2.1原理腺病毒(Adenovirus , Ad)是一种无包膜的线状双链DNA 病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad 载体都是基于血清型 2和5,通过转基因的方式取 代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
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1 一、无菌检查 ........................................................................................................................... 2 （一）薄膜过滤法 ........................................................................................................... 3 （二）直接接种法 ........................................................................................................... 3 二、支原体检查 ....................................................................................................................... 4 第一法 细胞培养法 ......................................................................................................... 4 第二法 指示细胞培养法（DNA染色法） ................................................................... 5 三、细胞内、外源病毒因子检查 ........................................................................................... 7 1 细胞形态观察及红细胞吸附试验（简称血吸附试验） ........................................... 7 2 不同细胞传代培养法检测病毒因子 ........................................................................... 7 3 接种动物和鸡胚法检测病毒因子 ............................................................................... 8 4 逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测 ................................................... 8 1）逆转录酶活性测定 ..................................................................................................... 8 2）透射电镜检查 ........................................................................................................... 11 3）感染性试验 ............................................................................................................... 11 5 特殊外源病毒因子的检测 ......................................................................................... 11 四、致瘤性检查 ..................................................................................................................... 11 五、感染效率和病毒的产量等的测定 ................................................................................. 12 六、细胞鉴别（染色体检查） ............................................................................................. 12 七、病毒敏感性检查 ............................................................................................................. 13 八、细胞功能检查 ................................................................................................................. 13 九、重组腺病毒滴度的测定 ................................................................................................. 14 十、病毒比滴度（比活性IU）测定 .................................................................................... 16 十一、E1A区、E2B区、AAV及插入基因的检测 ........................................................... 16 一）E1A区的检测 ........................................................................................................ 16 二）E2B区的检测 ......................................................................................................... 17 三）AAV的检测............................................................................................................ 18 四）插入基因的检测 ..................................................................................................... 18 十二、病毒外源因子检查 ..................................................................................................... 19 十三、内毒素测定 ................................................................................................................. 19 供试品溶液的制备 ......................................................................................................... 19 确定最大有效稀释倍数（MVD） ............................................................................... 20 方法1 凝胶法 .............................................................................................................. 20 鲎试剂灵敏度复核试验 ................................................................................................. 21 干扰试验 ......................................................................................................................... 21 检查法 ............................................................................................................................. 23 十四 效力试验插入基因表达活性测定，插入基因的生物学活性测定 ........................... 24 十五 复制型病毒（RCA）检测 A549细胞检测法 ........................................................... 24 十六 腺相关病毒的检测采用PCR法 ................................................................................. 26 十七 残留量测定应根据生产工艺及成品的添加成份，对有潜在危险性的成份进行残留量检测： ................................................................................................................................. 27 1残余宿主DNA含量测定 ........................................................................................... 27 2残余牛血清白蛋白含量测定 ...................................................................................... 27 3残余核酸酶含量测定 .................................................................................................. 28 十八 重组病毒制品的稳定性试验 ....................................................................................... 28