实验五小鼠初级精母细胞染色体畸变试验
体外培养小鼠生精细胞的形态学研究
体外培养小鼠生精细胞的形态学研究1江中良，李青旺，张明涛，李文烨，帅春晓，程磊西北农林科技大学动物科技学院11＃ 陕西 杨凌 712100E-mail：jiangzhongliang73@摘要：利用姬姆萨原液和瑞－姬染色法对30-35日龄小鼠精液和睾丸组织培养后的生精细胞和精子进行形态学鉴定。
结果表明，用姬姆萨原液染色精子形态清晰，细胞膜边缘清楚，呈紫红色，未成熟精子的染色程度浅于成熟精子；另外，姬姆萨原液也可以替代其它混合染料。
睾丸组织经培养后，用姬姆萨原液染色，生精细胞形态清晰，细胞核呈颗粒状，开始呈现深紫红色，胞质粉红色且带有蓝色背景，颜色较深，过一定时间后，颜色变浅；瑞－姬染色生精细胞形态完整清晰，细胞核、核仁、胞质分别呈现不同颜色。
关键词：生精细胞；体外培养；形态学；细精管生精细胞包括精原细胞、各级精母细胞和精子细胞，其中精原细胞包括Ａ型精原细胞和Ｂ型精原细胞，前者作为人体内唯一可自我更新的干细胞，逐渐受到科学家的重视[1－3]。
而Ａ型精原细胞发育成为成熟精子的过程仍存在许多问题，包括精子发生的基因调控，精原细胞增殖分化的启动和调控，干细胞状态的维持及自我更新的方式等[4，5]。
生精细胞培养可用于人类男性生殖生理及精子发生，调控机制及治疗精子发生阻滞的患者；对精子发生机制的进一步阐明；可促进各种类型的精子微注射[6]，也可以促进动物转基因技术的发展及珍稀野生动物繁殖和濒危物种的保护[7]等。
随着细胞培养技术的发展，人们可直接对所培养的细胞进行观察处理。
因此，生精细胞体外成熟培养的研究已越来越重要，各国学者为之作了大量的努力。
本研究通过对小鼠精液、细精管中生精细胞和精子的染色，及细精管组织培养方面的研究，以期为今后的应用提供一定的数据和理论基础。
1.材料和方法：1.1实验动物选择小白鼠购自第四军医大学实验动物中心，昆明系30-35日龄，健康状况良好，生殖系统发育成熟。
1.2仪器、设备与试剂电子天平（上海精密科学仪器有限公司），相差显微镜及显微镜温控仪（南京凯尔医疗器械有限公司），恒温室水浴锅，CO2培养箱等。
染色体畸变的观察
染色体畸变的观察日期姓名学号指导教师成绩10.0【实验目的】1.掌握人体正常染色体数目及形态特征2.熟悉染色体的核型分析步骤3.了解畸变染色体的类型【实验原理】染色体畸变是指体细胞或生殖细胞内染色体发生异常的改变，包括数目异常和结构畸变两种类型。
多数非整倍体产生的原因是在生殖细胞成熟过程或受精卵早起卵裂中发生了染色体不分离或染色体丢失所致。
染色体结构畸变发生的基础是染色体在化学、物理或生物等致畸因素的影响下发生断裂，断裂未在原位重接，因而造成染色体结构畸变或染色体重排，主要形式包括缺失、易位、重复和倒位等。
凡是能够引起染色体断裂的物质称为断裂剂，断裂对染色体的毒理效应因作用时间不同而导致的结果也有所不同。
若断裂剂作用于DNA复制之前，会导致染色体断裂；若断裂剂作用于DNA复制之后，将导致染色体单体断裂。
电离辐射在细胞周期的任何时期都可以诱发DNA双链断裂。
紫外线只能诱发DNA单链断裂。
大多数化学断裂剂都属于拟紫外线断裂及，即只能诱发DNA单链断裂。
染色体畸变：染色体数目的增减或结构的改变。
染色单体畸变：是指仅涉及染色体内一条染色单体的染色体结构异常。
环状染色体：若断裂发生于染色体的两端，那么断裂下来的两个断片彼此可以粘合成一个，而带着丝粒的部分可通过两断端的粘合形成环状染色体。
超二倍体：超二倍体是指除正常染色体组以外，还有一条或几条额外的染色体或染色体片段的细胞或个体。
亚二倍体：当体细胞中染色体数目多了一条或数条时，称超亚二倍体。
染色体断裂：染色体的臂出现裂开，大于臂的宽度称为断裂，是各类结构畸变的始因。
微小体：指畸变染色体脱离的圆点状短片。
双着丝粒染色体：若染色体的两条臂于同一水平断裂，断片丢失，而两臂的断端相互愈合，继而着丝粒纵裂并自身复制，称为双着丝粒染色体。
【实验内容】（通过比较，理解染色体畸变、染色单体畸变、染色体断裂、微小体、双着丝染色体、环状染色体、超二倍体、亚二倍体等概念）染色体结构畸变的观察：1、染色体畸变：指在某一条染色体两条单体上同时发生的畸变。
实验一小鼠精子畸形试验(共13张精选PPT)
实验目的
通过该实验，学习和掌握小鼠精子畸形 实验的原理和步骤
实验原理
精子畸形是指精子形状改变和畸形精子 器材：眼科剪、眼科镊、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、吸管
精子畸形百分率 分别记录各种类型畸形的精子，进行精子畸形类型构成比分析，并计算每组动物精子畸形百分率。 精子畸形是指精子形状改变和畸形精子数量增多。
酰胺（ 50mg/kg ）
实验操作步骤
一、动物分组及处理
动物选择 分组及处理：
， 阳性对照组：8只雄鼠 环磷酰胺腹腔注射三次
空白对照组：16只雄鼠，不做任何处理
实验操作步骤
二、制片
实验操作步骤
三、片
低倍镜 找到背景清晰、精子重叠较少的 部位高倍镜 按顺序检查精子的形态。
每只动物检查完整的精子1000个。
实验结果分析与评价
精子畸形 主要表现在头部，畸形的类型 阳性对照组：8只雄鼠，环磷酰胺腹腔注射三次 可分为无钩、香蕉形、无定形、胖头、 空白对照组：16只雄鼠，不做任何处理
精子畸形 主要表现在头部，畸形的类型可分为无钩、香蕉形、无定形、胖头、双头以及双尾等。 通过该实验，学习和掌握小鼠精子畸形实验的原理和步骤
双头以及双尾等。 实验动物：雄性小鼠 （6-8周）24只
空白对照组：16只雄鼠，不做任何处理 试剂：生理盐水、甲醇（分析纯）、 2%伊红水溶液环磷酰胺（ 50mg/kg ）
精子畸形百分率 分别记录各种类型畸形 阳性对照组：8只雄鼠，环磷酰胺腹腔注射三次
器材：眼科剪、眼科镊、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、吸管 精子畸形百分率 分别记录各种类型畸形的精子，进行精子畸形类型构成比分析，并计算每组动物精子畸形百分率。
精子畸形是指精子形状改变和畸形精子数量增多。 阳性对照组：8只雄鼠，环磷酰胺腹腔注射三次
染色体 实验报告
染色体标本的制备及组型实验生命科学学院张瀛【实验目的】1．掌握染色体标本的制作方法。
2．认识不同生物染色体的特征，学会做染色体组型图。
【实验用品】小白鼠，秋水仙素，生理盐水，0.3%KCl液，固定液，铜网，酒精灯，离心机，注射器，剪刀，镊子，载玻片，滴管，显微镜等。
【实验原理】染色体标本制作的原理细胞分裂中期染色体形状较为清楚，故使用中期细胞，并以每条染色体相对独立存在为染色体标本制作的四大要点1）PHA：促细胞分裂，使淋巴细胞返幼，变为淋巴母细胞。
2）秋水仙素：破坏微管装配，使纺锤体不能形成，使大量细胞停止在分裂中期。
（相同作用：秋水仙胺、长春碱、鬼臼素）3）低渗作用：水进入细胞内，使细胞内容空间变大，染色体间的距离拉大，易于染色体分散开。
4）空气干燥：使细胞和染色体展开。
5）固定：用camoy`s solution（甲醇：冰醋酸=3:1）作用使蛋白质变性，对染色体内的组蛋白来说，变形后硬度增加，保持了染色体的“即时形态”，对细胞膜蛋白来说，变形使细胞膜硬度增强，形成屏障作用，防止了细胞内物质外溢和丢失。
染色体标本制作的意义根据染色体的特征（数目、形态、大小等）制作染色体组型图。
染色体标本制作的应用1） 生物学方面：根据染色体特征鉴别生物及种类。
染色体数目：兔-44条，猫-38条，狗-78条，马-64条，人-46条，小鼠-40条（18对端着丝粒染色体，第17、18对为亚端着丝粒染色体），大鼠-42条，鸡-78条。
2） 临床医学方面：主要用于遗传性疾病的诊断及研究。
因此，染色体组型实验广泛应用于胎儿遗传性疾病早期诊断中（抽取羊水）。
染色体组型把真核生物的一个体细胞中的各个染色体按其长度、形状和着丝粒的位置排列成一定顺序的过程，即为染色体组型。
染色体核型染色体组型是染色体核型的模式表达。
染色体组型及分群依据主要根据染色体的相对长度，着丝粒的位置，其次是臂的长短，以及次级缢痕或随体的有无等方面。
三株牌歧特生冲剂的小鼠睾丸染色体畸变试验
三株牌歧特生冲剂的小鼠睾丸染色体畸变试验摘要：目的：对三株牌歧特生冲剂进行小鼠睾丸染色体畸变试验，以测定其是否具有遗传毒性。
方法：参照《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中的试验方法。
结果：试验期间，所有组别动物症状表现正常，未见明显由于给予样品引起的异常症状，未见动物异常死亡。
各剂量组体重与Veh组比较均无显著差异（P>0.05）。
CP组染色体畸变细胞率与Veh组比较有明显差异（P＜0.01），其余各组与Veh组比较未见明显差异（P>0.05）。
结论：本试验条件下，受试样品剂量组的睾丸染色体结构畸变细胞率与阴性对照组（Veh）比较无显著性差异（P>0.05），无剂量反应关系，表明三株牌歧特生冲剂对小鼠睾丸染色体结构未产生明显影响，试验结果为阴性。
关键词：三株牌歧特生冲剂；小鼠睾丸染色体畸变试验睾丸染色体畸变是指睾丸细胞染色体数目和结构异常，包括裂隙、短篇、移位等[1]。
三株牌歧特生冲剂，由三株福尔制药有限公司生产，其主要作用在于调节肠道菌群平衡，从而改善肠道功能的作用。
三株牌歧特生冲剂，6 g/袋，白色粉末状固体，本品易溶于水，由三株福尔制药有限公司生产，批号为160403，常温保存，功效成分为水苏糖，含量每袋不少于3 g。
本品人体推荐食用方法及食用量为口服，每日1～2次，每次1袋。
溶媒为灭菌蒸馏水。
1实验动物及饲养环境小鼠，品系：KM，雄性，体重25~30 g，25只，来源：北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2012 0001。
实验动物质量合格证号：11400700166948。
经检疫观察4 d后使用。
饲养环境：屏障系统。
5只/笼（同性别、同剂量组），喂食SPF鼠料，自由饮水。
温度24.7～26.0 ℃，相对湿度50～60 %，人工光照，明暗12 h/天。
SPF大小鼠生长维持饲料，来源：北京华阜康生物科技股份有限公司，动物饲料生产许可证号：SCXK（京）2014 0008。
细胞致畸实验报告
本实验旨在探究甲、乙两种化学物质是否具有致畸作用，并通过比较二者的毒性强度，为相关领域的科学研究提供实验依据。
二、实验材料1. 实验材料：小白鼠胚胎、胰蛋白酶、动物细胞培养液、动物细胞固定液、适宜浓度的龙胆紫溶液、滴管、培养皿、剪刀、锥形瓶、细胞培养箱、载玻片、盖玻片、光学显微镜。
2. 实验试剂：甲、乙两种化学物质。
三、实验方法1. 制备细胞悬液：用胰蛋白酶处理小白鼠胚胎组织，使其离散成单个细胞，制成细胞悬浮液。
2. 细胞培养：取A、B、C三个洁净的培养瓶，分别加入等量的细胞悬浮液。
向A、B两个培养瓶中加入化学物质甲、乙，并将培养瓶摇匀；C瓶不作处理，作为对照。
3. 培养条件：将3个培养瓶放在37℃的细胞培养箱中培养。
4. 观察与统计：待细胞生长至一定阶段后，制作临时装片。
使用显微镜观察有丝分裂中期的细胞，并与C组对比，以确认发生变异的细胞。
统计该期变异的细胞占该期细胞总数的百分数（Q值）。
5. 数据分析：比较A、B两组的Q值，判断甲、乙两种化学物质的致畸作用。
四、实验结果1. A组：Q值为0.1%，表明化学物质甲具有致畸作用。
2. B组：Q值为0.2%，表明化学物质乙具有致畸作用。
3. C组：Q值为0.05%，作为对照组，无致畸作用。
五、实验结论通过本实验，我们得出以下结论：1. 甲、乙两种化学物质均具有一定的致畸作用。
2. 在比较毒性强度方面，化学物质乙的致畸作用强于甲。
1. 本实验采用动物细胞培养方法，观察化学物质对细胞的影响，具有较好的准确性和可靠性。
2. 实验结果表明，化学物质甲、乙均具有一定的致畸作用，提示我们在日常生活中应避免接触这些物质。
3. 本实验为相关领域的科学研究提供了实验依据，有助于进一步探讨化学物质致畸作用的机制。
4. 在后续研究中，可以进一步探究化学物质致畸作用的阈值、作用机制以及预防措施等。
七、实验建议1. 实验过程中，应严格控制培养条件，确保实验结果的准确性。
2. 可增加实验重复次数，提高实验结果的可靠性。
小鼠染色体标本制作、染色及观察
科目细胞生物学实验题目小鼠染色体标本的制作、染色与观察姓名***系年级2011级生物基地学号*** 同组者***日期2013/05/23、302013/05/30小鼠染色体标本的制作、染色与观察【实验目的】1.初步掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的基本制作过程和Giemsa染色法，了解各操作步骤的原理。
2.了解常用实验动物染色体的数目及特点。
3.认识不同生物染色体的特征，学会做染色体组形图。
【实验原理】凡处于活跃增殖状态的细胞，或者经过各种处理后，任何动物组织的细胞就可进入分裂，均可用于染色体分析。
在正常动物体内，精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织。
给动物注射一定剂量的秋水仙素，即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期，然后采用常规空气干燥法制备染色体，即可得到大量可分析的染色体标本。
本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作，易于推广。
骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料。
但在取材方面，精巢又比骨髓要简易一些，故本实验选用小鼠的精巢为实验材料。
对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点: 1.用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期, 使中期染色体停留在赤道面处; 2.用低渗法使细胞膨胀, 以至于在滴片时细胞被胀破, 使细胞的染色体铺展到载玻片上; 3.空气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平,经Giemsa 染色后便可观察到染色体的显微图象。
Giemsa染色是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。
主要用Giemsa染液可以将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。
【实验材料】1.试剂：秋水仙素、生理盐水（0.9%的NaCl溶液）、0.3%KCl低渗溶液、固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）、Giemsa染液。
2.器具：解剖盘、镊子、眼科剪、小烧杯（×2）、吸管、玻璃刻度离心管、恒温水浴锅、离心机、铜网、预冷载玻片、记号笔、普通光学显微镜、玻璃等。
实验六：小鼠精巢细胞减数分裂标本的制备与观察
小鼠曲细精管管腔
曲细精管管腔
【实验材料及用品】
1、 材料：成年雄性小白鼠 2、 用品：注射器、平皿、尖头镊子、剪刀 （普通剪刀、眼科小剪刀）、吸管、离心 管、离心机、玻片等。
实验试剂
1、100g/ml秋水仙素。 2 、 2％柠檬酸钠溶液 3、 0.075M的KCI 4、31甲醇冰醋酸及11甲醇冰醋酸（应现配） 5、 PH6.8，0.01M的PBS缓冲液 6、Gimesa原液 7、 Gimesa工作液：1份Gimesa原液加9份PH6.8，0.01M的PBS 缓冲液，混匀。工作液应现用现稀释。
【实验操作】
4、游离并收集细胞。 将剪碎的曲细精管及溶液移入离心管中，用吸管反复吸打1 －2min，使尽量多的细胞从管腔中游离出来； 静置5 min（或300rpm离心2 min），使大的膜管状杂质下 沉； 吸上清液于另一管中，1000 rpm离心5 min，沉淀即为不同 发育阶段的细胞。 5、低渗处理，使细胞胀大。 加入5ml 0.075M的KCI，轻轻（为什么？）吹打混匀，静置 10 min。
【结果观察】
观察各期细胞核及染色体。
作业：
绘制所看到的中期Ⅰ和中期Ⅱ的染色体图， 说明其中染色单体组成情况。
骨髓细胞的收集
1、来源丰富、个体较小的小动物骨髓细胞收集法： （1）处死动物，取长骨 （2）去干净骨上所附肉（先用刀片刮，再用纱布擦） （3）用剪刀剪开骨头两端 （4）用注射器吸生理盐水或低渗液将骨髓腔中细胞 冲出，收集到离心管中 2、大动物骨髓细胞收集：骨髓穿刺法取红骨髓
二、减数分裂II
可分为前、中、后、末四个四期，与有丝 分裂相似。
实
验
目
的
学习滴片法制备单细胞悬液染色体的一般方法。 以小鼠精巢细胞染色体制片为标本观察减数分 裂过程中不同时期的染色体。