仪器分析笔记 《高效液相色谱分析》
高效液相色谱分析实验讲义
高效液相色谱分析实验一、实验目的1．了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握HPLC的基本操作2．学习苯-甲苯混合物的定性分析方法3．评价色谱柱效4．了解色谱定量操作的主要方法以及各自特点；5．学习未知样品的定量分析方法。
二、实验原理不同组分因在互不相溶的流动相与固定相中的分配比不同，当两相做相对运动时，组分在两相之间反复进行多次分配，最终实现不同组分的分离。
色谱仪器的构成：包括高压输液系统、进样系统、分离系统，检测系统等1．色谱定性分析方法（1）利用保留值与已知物对照定性A 保留时间定性 b 峰高增量定性 C 其他方法定性（保留值经验规律定性，文献保留数据定性）2．色谱定量分析方法⑴校正因子：a绝对校正因子；b 相对校正因子。
⑵常见的色谱定量分析方法主要有：a 归一化法。
特点：简单、方便、准确，但要求所有组分必须全部出峰。
b内标法。
特点：使用相对校正因子定量，结果准确，但操作繁琐，由于需要增加内标物，增大分离的难度。
c 标准曲线法（外标法）。
简单、方便，由于采用绝对校正因子定量，结果受到操作技术因素以及具体色谱条件影响较大。
d 内标标准曲线法。
三、仪器与试剂LC-1000型高效液相色谱仪P3000A-UV3000型高效液相色谱仪甲醇(色谱纯) 二次去离子水苯甲苯苯－甲苯四、高效液相色谱仪操作步骤1. 流动相的预处理用甲醇和二次去离子水配成500 mL (V/V=90:10)的甲醇溶液，用0.45μm 有机滤膜过滤，超声波清洗器脱气10～20 min，装入流动相贮液瓶。
2. 苯-甲苯混合试样和苯、甲苯标样的准备3. P3000A-UV3000型高效液相色谱仪操作a 依次打开六通阀控制电路、高压输液泵和检测器电源开关；b 打开CHTX3000色谱工作站，在仪器控制面板中，设置波长，点击！，并开灯；c打开三通阀，在仪器控制面板中，设置流速为5ml/min, 启动高压泵，排除流路中的气泡。
排气结束后，点击停止按钮，停止高压泵。
HPLC实验高效液相色谱分析实验
仪器分析实验报告实验名称：高效液相色谱分析实验一、实验目的1. 了解HPLC的结构，了解仪器的开、关程序。
2. 了解流动相的制备和样品溶液的制备。
3. 知道仪器的运行程序和进行样品分析。
二、仪器和试剂仪器：美国安捷伦1200型HPLC、10μL的微量注射器试剂：磷酸乙腈溶液(PH=3)、重蒸水、邻氯苯甲酸三、实验步骤1.流动相的准备流动相只有一组：PH=3的磷酸乙腈溶液，进过脱气，用蠕动泵输送。
2.开机，色谱柱平衡当1完成后，开机，待色谱柱平衡。
3.样品溶液的准备配置好邻氯苯甲酸溶液，按要求选好滤纸的孔径大小。
用低压过滤装置过滤，由于美国安捷伦1200型HPLC配有脱气装置，因此滤液无需事先脱气就可以进行分析。
4.基线的查看由于仪器内部压力的变化可以引起基线的不断波动，因此，需等待压力稳定后，基线平稳才能进行进样。
5.样品进样分析用10μL的微量注射器取5μL的邻氯苯甲酸，微量注射器中不能有气泡，将微量注射器的针头插入到注射的孔时，打开微量注射阀，将邻氯苯甲酸注射进去后，迅速关闭阀门，抽出针头，等待仪器的分析结果。
6.色谱柱的清洗分析工作结束后，要清洗进样阀中的残留样品，也要用适当的液体来清洗色谱柱。
7.关机实验完毕后，关闭仪器和电脑。
四、实验数据及处理1.LC参数2.色谱柱参数3.四元泵状态A：0.0％流速：1.000ml/minB：0.0％压力：91barC：0.0％D：0.0％5.色谱分析谱图见附页，经过注射5μL的邻氯苯甲酸，得到三组实验色谱图，根据谱图列表数据如下：色谱柱长(L)、理论塔板高度(H)与理论塔板数(n)三者的关系为：n = L / H理论塔板数和色谱参数之间的关系为：n = 16 ( t R / W b ) 2 = 5.54 ( t R / Y1/2 ) 2则取第五组数据计算得：t R=2.437 min = 146.22s Y1/2 = 2.354(0.1375min / 4 ) = 4.855125 sn = 5.54 ( t R / Y1/2 ) 2 =5025 (块)五、实验分析与讨论见图分析：（色谱图见附页）图中第一个峰是出现在1.188min的一个小峰，第二个峰是出现在1.420min的一个小峰，第三个峰是出现在1.531min的一个小峰，第四个峰是出现在1.816min 的一个小峰, 第五个峰是出现在 2.437min的一个大峰，第六个峰是出现在3.196min的一个小峰。
仪器分析 高效液相色谱法
第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。
高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。
梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。
也称为梯度淋洗。
低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。
它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。
高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。
它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。
两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。
柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。
柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。
液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。
K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。
液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。
分配系数较大的组分保留值也较大。
正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。
反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。
化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。
《仪器分析》第八章 液相色谱分析
Si Cl
+ R H N 2
Si N R H
热和化学稳定性比酯型好。 热和化学稳定性比酯型好。
Si C l
+ R M X g
Si R
从理论上讲，这种结构具有更好的稳定性， 从理论上讲 ， 这种结构具有更好的稳定性 ， 特别是对于微碱性流动相， 而且R基可以多 特别是对于微碱性流动相 ， 而且 基可以多 次氯化，形成聚烷基键合相， 但是制备困难。 次氯化 ， 形成聚烷基键合相 ， 但是制备困难 。
柱体为直型不锈钢管，内径1～ 柱体为直型不锈钢管，内径 ～6 mm， ， 柱长5～ 柱长 ～40 cm。发展趋势是减小填料 。发展趋势是减小填料 粒度和柱径以提高柱效。 粒度和柱径以提高柱效。 以提高柱效
(7)检测器 检测器
♥ 紫外检测器
70％应用，氘灯，适用于梯度淋洗 对流动相速度变化不敏感 溶剂选择时紫外检测器波长不能小于溶剂的紫外截至波 长；
(5)进样器 进样器
♥ 高压进样阀－用微量注射器将样品注入样品环管（10µL到 2mL）
(6)色谱柱 色谱柱
♥ 色谱系统的心脏 ♥ 优质不锈钢管，内壁光洁平滑 ♥ 接头死体积尽可能小 ♥ 为了保护色谱柱不被污染，有时候需要在分析柱前加一根 短柱，称为卫柱。为了防止由于卫柱而过分增加压力，在 卫柱中使用的颗粒大小约10－30 µm。
3. Si-O-Si-C键型（硅胶和有机硅烷的反应）
R Si O + R SiX H 3 Si O Si R R
目前用得最多的类型。 目前用得最多的类型 。 具有良好的热合 化学稳定性， 能够在pH2~8.5的介质中 化学稳定性 ， 能够在 的介质中 使用。 使用。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的仪器分析方法，广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域。
本文将介绍HPLC的原理、仪器组成、操作步骤以及应用领域。
HPLC的原理是利用样品在液态流动条件下在固定相上的分配行为进行分离和定量分析。
相比于传统的色谱法，HPLC具有操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点。
HPLC的仪器组成主要包括溶液配制系统、进样系统、柱温控制系统、分离柱、检测器和数据处理系统。
其中，溶液配制系统主要用于调配流动相，进样系统用于将样品注入分离柱，柱温控制系统用于控制柱温度，分离柱用于实现样品的分离，检测器用于检测样品，数据处理系统用于处理和分析检测结果。
HPLC的操作步骤如下：1.首先，需要根据需要选择合适的固定相和流动相，然后将固定相充填到分离柱中。
2.将样品溶解于合适的溶剂中，并按照一定的稀释比例稀释溶液。
3.将稀释后的溶液注入进样器中。
4.打开柱温控制系统，设置合适的柱温。
柱温的选择应考虑到样品的性质以及分离柱的要求。
5.打开溶液配制系统，调配合适的流动相，并将流动相以一定的流速通过分离柱。
6.启动检测器，并设置适当的检测波长和灵敏度，以便对样品进行检测。
7.数据处理系统会自动记录检测结果，并进行相应的数据处理和分析。
HPLC广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域，常见的应用包括药物分析、环境污染物检测、食品成分分析等。
例如，可以利用HPLC对药物中的成分进行分离并进行定量分析，以保证药物的质量和疗效。
在环境科学中，HPLC可以用于检测空气、水体和土壤中的有机污染物。
在食品科学中，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂和重金属等。
总之，HPLC是一种常用的高效仪器分析方法，通过流动相在固定相上的分配行为实现样品的分离和定量分析。
由于其操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点，成为化学、药学、环境科学、食品科学等领域中不可或缺的分析工具。
仪器分析-高效液相色谱法
流动相的选择与制备
选择合适的流动相
根据被分析化合物的性质， 选择适当的流动相，如有 机溶剂、缓冲液等。
流动相的配制
按照实验要求，准确称量 流动相组分，混合均匀， 并进行过滤和脱气处理。
流动相的梯度洗脱
对于多组分分离，可以采 用梯度洗脱技术，以提高 分离效果。
仪器的开机与平衡
开机
按照仪器说明书，打开仪器电源， 启动仪器操作系统。
药物制剂质量控制
高效液相色谱法可以用于药物制剂的质量控制， 检测制剂中药物的含量、纯度和稳定性等指标。
环境样品分析中的应用
污染物检测
高效液相色谱法可以用 于检测环境中的有机污 染物，如农药、多环芳 烃等，为环境污染控制 和治理提供依据。
饮用水质量检测
通过高效液相色谱法可 以检测饮用水中的有害 物质，如消毒副产物、 微量有机物等，保障公 众的饮用水安全。
粒径
色谱柱的粒径影响分离效 果和分离时间。粒径越小， 分离效果越好，但分离时 间越长。
长度
色谱柱的长度影响分离效 果和载样量。长度越长， 分离效果越好，但载样量 越小。
检测器
类型
常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧 光检测器、电导检测器等，根据被测物质 的性质和检测需求选择合适的检测器。
响应速度
线性范围
质。
测定水体、土壤、空气 中的污染物和有害物质。
用于蛋白质、核酸、细 胞等生物大分子的分离
和检测。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择 性、应用范围广。
局限性
需要专业操作人员、仪器昂贵、 样品前处理复杂、耗时长。
02 高效液相色谱法的仪器构成
CHAPTER
卫生化学笔记：高效液相色谱法
高效液相色谱法（一）概述高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）又称高压液相色谱法多组分分离柱效高：使用键合固定相，分离效率高。
♠柱效（理论塔板数）：100000/m灵敏度高：使用高灵敏度检测器（紫外、荧光、电化学等）。
自动化程度高：可自动采集和处理数据。
同时，可以调整和选择分析条件。
高效液相色谱法：在气相色谱法的理论和实验技术基础上发展起来的分析方法，与气相色谱法有若干异同点。
高效液相色谱法不受样品挥发性和热稳定性的影响，只要把样品制成溶液便可进行分析。
一些生物大分子可应用高效液相色谱法进行分析测定。
气相色谱法：流动相是惰性气体，起载带作用。
高效液相色谱法：流动相可选用不同极性的液体，参与对组分的分配作用，分离效率得以提高。
高效液相色谱法的缺点：★使用有机溶剂，使用费用较高，对操作者的健康和环境有不利影响。
★仪器较复杂、价格较高。
（二）高效液相色谱仪高效液相色谱仪的组成：高压输液系统—进样系统—分离系统—检测系统—记录和数据处理系统一、高压输液系统一般由贮液器、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻尼器等组成，其中高压输液泵是高效液相色谱仪的核心部件。
高压输液泵: 高效液相色谱使用的固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，很难较快流动。
高压输液泵：提供动力，以便流动相被连续不断地送入色谱柱。
要求：（1）密封性好，耐腐蚀；（2）有足够的输出压力，使流动相能顺利通过色谱柱；（3）输出压力平稳，脉冲小；（4）输出流量恒定，可调范围宽，其流量精度在1%2%之间；（5）泵室体积小（＜0.5 ml），易于清洗，便于迅速更换溶剂。
高压输液泵分为恒流泵和恒压泵。
恒流泵：输出流量恒定，不受色谱柱阻力和流动相粘度等因素的影响。
恒压泵：输出压力恒定，而流量则随色谱系统阻力的变化而变化，因此保留时间的重现性差。
恒流泵：柱塞往复泵柱塞往复泵的泵室体积小（仅几毫升）易于清洗和更换溶剂，适合于梯度洗脱操作。
仪器分析笔记《高效液相色谱分析》.
第二章高效液相色谱分析§2.1 高效液相色谱法概述（掌握）2.1.1 高效液相色谱法的特点1、与经典液相色谱法比较2、与气相色谱法比较3、高效液相色谱法的发展A、固定相的变化填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构固定相；亲和固定相。
目前，出现使用1.0µm填料的超高压液相色谱。
B 、流动相变化目前，出现120～220℃超热水为流动相、FID 和FPD 检测器的HPLC 。
C 、全新方法剪切流路液相色谱；不同分离机制组合的多维液相色谱以及HPLC 与MS 、NMR 、IR 联用的多维液相色谱法。
4、高效液相色谱法的特点①高压 ：采用高压输液设备，（150~350）× 105 Pa ②高速：分析速度快； ③高效：柱效很高。
（n>30000），可以在数分钟内完成数百种物质的分离；④高灵敏度：10—9g （UV ）；10—11g （荧光检测）。
5、高效液相色谱法的局限①溶剂用量太大；②缺乏诸如气相色谱使用的TCD 、FID 通用型检测器； ③不能替代气相色谱法，难分离化合物(柱效10万以上)，必须使用毛细管气相色谱法进行分离； ④不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能承受200kPa ～1MPa 压力。
§2.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素（了解）2.2.1 影响色谱峰的扩展的因素高效液相色谱法的基本概念及理论基础，与气相色谱法是基本一致的，其区别主要在于流动相的不同。
现根据速率理论及色谱峰扩展及色谱分离的影响讨论如下：高效液相色谱的范氏方程：2222m p sm p s fd m p mm s C d C d C d C D H d u u u D D D λ⎛⎫=++++ ⎪ ⎪⎝⎭ 若将上式简化，可写作：BH A Cu u=++这与气相色谱的速率方程形式是基本一致的，主要区别在于纵向扩散项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质项。
仪器分析 第三章高效液相色谱分析
主要分离机理
吸附能，氢键 疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力 立体效应 生化特异亲和力
主要分析对象或应用领域
异构体分离、族分离，制备 各种有机化合物的分离、分析与制备 高分子分离，分子量及其分布的测定 无机离子、有机离子分析 手性异构体分离，药物纯化 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
同时消耗样品少。
2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
（1）速度快-通常分析一个样品在15～30 min，有些样 品甚至在5 min内即可完成。 （ 2 ）分辨率高 - 可选择固定相和流动相以达到最佳分离 效果。 （3）灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学 检测器可达0.1pg。 （ 4 ）柱子可反复使用 - 用一根色谱柱可分离不同的化合 物。 （ 5 ）样品量少，容易回收 - 样品经过色谱柱后不被破坏， 可以收集单一组分或做制备。
基本要求： ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定 量的准确性至关重要；②流量准确可调，0.1～10 ml/min， ③输出压力高，一般应能达到 150 ～ 300kg/cm2 ；④液流稳 定，无脉动；⑤ 死体积小，要求小于0.5ml。⑥密封性能好， 耐腐蚀。
泵的使用及注意事项： ①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂 质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预 先过滤除去流动相中的任何固体微粒，泵的入口都应连接 砂滤棒。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动 相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况 下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏， 甚至只是由于溶液的静臵，就可能析出盐的微细晶体，这 些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。 因此，用后必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于 色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（如对于反相键合硅胶 固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
《环境仪器分析》第九章 高效液相色谱法
2019/10/31
东华大学Hale Waihona Puke 相表面存在的某种特异性亲和
力，进行选择性分离。
先在载体表面键合上一种
具有一般反应性能的所谓间隔
臂(环氧、联胺等)，再连接上配
基(酶、抗原等)，这种固载化的
配基将只能和具有亲和力特性
吸附的生物大分子作用而被保
留，没有这种作用的分子不被保留。
2019/10/31
东华大学
六、亲和色谱（Affinitychromatograph）
定相上的吸附作用不同来进行分离。 固 定 相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、硅
-镁吸附剂等，较常使用的是5～10μ m的硅胶吸附剂。 在高效液相色谱法中，表面多孔型或全多孔型都可作吸附色谱
中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小、孔穴浅等优点，能极 大提高柱效。
但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多 孔型微粒填料。
• 选择溶剂还必须与检测器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、 甲苯、氯仿、二甲基酰胺和水等。
• 分离对象：以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品， 以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。
2019/10/31
东华大学
六、亲和色谱（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定
（2）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力， 即不产生作用力，仅起到载气作用。而HPLC流动相可选用不 同极性的液体，对组分产生作用力，流动相对分离起很大作用。
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第二章高效液相色谱分析§2.1 高效液相色谱法概述（掌握）2.1.1 高效液相色谱法的特点1、与经典液相色谱法比较2、与气相色谱法比较3、高效液相色谱法的发展A、固定相的变化填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构固定相；亲和固定相。
目前，出现使用1.0µm填料的超高压液相色谱。
B 、流动相变化目前，出现120～220℃超热水为流动相、FID 和FPD 检测器的HPLC 。
C 、全新方法剪切流路液相色谱；不同分离机制组合的多维液相色谱以及HPLC 与MS 、NMR 、IR 联用的多维液相色谱法。
4、高效液相色谱法的特点①高压 ：采用高压输液设备，（150~350）× 105 Pa ②高速：分析速度快； ③高效：柱效很高。
（n>30000），可以在数分钟内完成数百种物质的分离；④高灵敏度：10—9g （UV ）；10—11g （荧光检测）。
5、高效液相色谱法的局限①溶剂用量太大；②缺乏诸如气相色谱使用的TCD 、FID 通用型检测器； ③不能替代气相色谱法，难分离化合物(柱效10万以上)，必须使用毛细管气相色谱法进行分离； ④不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能承受200kPa ～1MPa 压力。
§2.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素（了解）2.2.1 影响色谱峰的扩展的因素高效液相色谱法的基本概念及理论基础，与气相色谱法是基本一致的，其区别主要在于流动相的不同。
现根据速率理论及色谱峰扩展及色谱分离的影响讨论如下：高效液相色谱的范氏方程：2222m p sm p s fd m p mm s C d C d C d C D H d u u u D D D λ⎛⎫=++++ ⎪ ⎪⎝⎭ 若将上式简化，可写作：BH A Cu u=++这与气相色谱的速率方程形式是基本一致的，主要区别在于纵向扩散项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质项。
1、涡流扩散项e H2e p H d λ=式中——λ：填充不规则因子；d ：填料平均直径。
它与载体流速无关；若柱子填充均匀，填料的颗粒也均匀，则0λ→⇒0e H →⇒柱效高；若填充不均匀，λ↗⇒e H ↗⇒柱效低。
d d md C D H u=式中——C ：常数；D ：扩散系数；u ：流动项的线速度。
由于分子在液体中的扩散系数比在气体中要小4~5个数量级，因此在液相色谱中，当流动相线速度大于10.5 cm s -⋅时，这个纵向扩散项对色谱峰扩展的影响实际上是可以忽略的，而气相色谱法中这一项却是重要的。
（1）固定相传质阻力项s H2s f s sC d H uD =式中——C ：与k （容量因子）有关的系数；d ：固定液厚度；D ：扩散系数。
固定相引起峰扩展解决办法：①液液分配色谱：使用薄的固定相；②吸附、排阻和离子交换色谱：使用小颗粒填料。
①流动的流动相中的传质阻力项m H2m pm mC d H uD =⋅式中——C m ：常数（与k 有关，其值取决于柱直径、形状和填充的填料结构）；D m ：流动相中扩散系数；d p ：为填充物的平均直径。
②滞留的流动相中的传质阻力项sm H✓ 原因：多孔固定相造成的部分流动相滞留。
2sm psm mC d H uD =⋅式中——C ：常数（与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关）。
固定相的粒度0→⇒其微孔孔径→∞⇒传质途径0→⇒传质效率→∞⇒柱效⇒→∞。
2.2.2 液相色谱的H u -曲线1、液相色谱与气相色谱H u -曲线的区别①HPLC 板高H 比GC 小一个数量级，说明HPLC 柱效高； ②对于HPLC ，为了取得良好的柱效，流速不一定要很高。
2、降低H ，提高柱效的方法①减小填料粒度； ②减小填料孔穴深度；③用低粘度溶剂作流动相；④采用低速流动相（通常：11 mL min u -=⋅）。
§2.3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理（理解）根据固定相和分离机理的不同，液相色谱法可分为： 1、液液分配色谱法（LLC ） 2、液固吸附色谱法（LSC ） 3、离子对色谱法（IPC ）4、离子交换色谱法（IEC ）5、离子色谱法（IC ）6、空间排阻色谱法（SEC ）2.3.1 液—液分配色谱及化学键合相色谱1、液—液分配色谱——基于组分在两相间的分配容量因子k 的差异而实现分离的。
A、固定相：载体+固定液全多孔型担体 β，β'-氧二丙腈 表面多孔型担体 聚乙二醇异三十烷（角鲨烷） B 、载体：硅胶； C 、分类：✓ 反相色谱： 由于液—液分配色谱固定相易流失，现已被化学键合相色谱所替代。
D 、原理：由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而溶质在两相间进行分配。
当达到平衡时，物质的分配同样服从下式：s m m sC V K k C V ==式中——K ：分配系数；k ：容量因子；s C ：溶质在固定相中的浓度；m C ：溶质在流动相中2、化学键合固定相色谱通过化学反应将有机基团键合到硅胶（载体）表面上，代替机械涂渍的液体固定相。
这种固定2.3.2 液—固吸附色谱法——流动相：液体，固定相：吸附剂 1、原理：基于组分在固体吸附剂表面上具有不同吸附能力而分离的。
『组分分子结构与吸附剂几何结构相适应时，易于吸附。
』2①极性的硅胶（应用最广）； ②氧化铝； ③分子筛；④非极性的活性炭 。
3、应用：①分离几何异构体；②分离含极性基团相同但数目不同的试样，但不能用于分离同系物； ③分离具有中等分子量的非极性或极性的、非离子型的油溶性样品。
4、缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象2.3.3 离子对色谱法分离强极性的有机酸、碱存在的问题：✓ 用正相色谱：保留值太大、峰拖尾，甚至不出峰✓ 用反相色谱：保留太小1、定义：将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对电子或反电子）加入到流动相或固定相中，使其于溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行 为。
2、分离机理离子对色谱的分离机理有不同的假说，现以离子对分配机理说明：在色谱分离过程中，流动相待分离的有机离子X +（也可以是带负电荷的离子）与固定相或流动相中带相反电荷的对离子Y —结合，形成离子对化合物X +Y —，然后在两相中分配：XY K X Y X Y +-+-−−−→+←−−−水相水相有机相 2.3.4 离子交换色谱法 1、固定相：离子交换树脂流动相：水缓冲溶液；甲醇；乙醇+水缓冲溶液2、原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。
亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R —SO 3H+M +＝R —SO 3M+ H + 阴离子交换：R —NR 4OH+X —＝R —NR 4 X+OH — 3、适合于分析：①在溶液中能形成离子的组分②有机物和生物物质，如：蛋白质、氨基酸、核酸等的分离。
2.3.5 离子色谱法离子色谱以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象，近30年有了迅速发展。
1、离子交换色谱存在问题：用电导检测器检测，流动相是强电解质，强背景完全掩盖待测离子信号。
2、抑制柱：使高背景电导的流动相转变为低背景的流动相。
⏹ 1975年Small 提出在离子交换柱后，再串结一根抑制柱。
⏹ 抑制柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。
如：分析阴离子样品Br —，NaOH 为流动相；抑制柱为R —H +；通过抑制柱后：NaOH +R —H + →H 2O +R —Na NaBr +R —H + → HBr +R —Na✓ 由于H +淌度为Na +的7倍，提高了检测的灵敏度； ✓ IC 还可以分析氨基酸、糖类及有机阳离子；✓ 由于抑制柱要定期再生，现代IC 中，多采用在离子交换柱后接抑制器来实现以上目的。
3、阴离子分析示例：七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离 各组分含量：3～50 ppm ；2.3.6 空间排阻色谱法（凝胶色谱法）——根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术1、分离原理：✓固定相凝胶内有一定大小的孔穴；✓分子体积大的不能渗入孔穴而被排阻，较早被淋洗出来；✓小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。
2、分离范围：相对分子质量2000～2000000之间合成高分子的分子量（分布）的测定。
3、空间排阻色谱的特点：①可提供分子尺寸、结构信息；②易检测——保留时间短，峰窄，可采用低灵敏度检测器；③柱寿命长——固定相与分子间作用力弱；☪总结：选择色谱分离方法的一般原则易挥发、分子量＜200的样品：GC；分子量在200~2000的样品：HLPC；分子量＞2000：GFC。
§2.4 液相色谱固定相（了解）2.4.1 液—液色谱、键合相色谱及离子对色谱固定相1、担体（1）全多孔型担体由直径为5~10μm 的硅胶微粒凝聚而成；颗粒细，孔较浅，传质速率快，柱效高；是目前应用最广泛的担体。
（2）表层多孔型担体实心玻璃球（30~40μm ）外面覆盖一层多孔活性材料；孔层厚度小、孔浅，出峰迅速、柱效高；多孔层厚度薄，容量低。
2、化学键合相固定相：✓硅氧烷型键合相应用最广泛。
✓十八烷基键合硅胶（Octadecylsilane, ODS ，C18）最常用制备：•正相色谱代表性固定相：改性硅胶、氰基柱；•反相色谱代表性固定相：C18；C8；•反相色谱是当今液相色谱的最主要分离模式。
※化学键合固定相特点：①固定相传质很快。
表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多②固定液不易流失，柱寿命长。
由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，增加色谱柱稳定性和寿命。
③可以键合不同官能团，提高了应用范围和选择性。
④特别适合于梯度洗脱，有利于高灵敏检测和收集馏分。
2.4.2 液—固吸附色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱固定相1、液—固吸附色谱法固定相✓硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。
✓常用5-10微米的硅胶微粒。
2、离子交换色谱固定相（1）薄层型离子交换树脂（2）离子交换键合固定相3、空间排阻色谱固定相（1）软体凝胶（2）半硬质凝胶（3）硬质凝胶§2.5 液相色谱流动相（了解）HPLC流动相是液体，选择余地大；它参与固定相对组分的竞争（与GC不同）。
1、对流动相溶剂的要求是：（1）能溶解样品，但不与样品反应。
（2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。
（3）粘度要尽可能小（保证高的渗透性和柱效）（4）与所用检测器相匹配。
（5）高纯度、易精制、价格尽量便宜。
正相色谱代表性流动相：正己烷。
反相色谱代表性流动相：甲醇/水、乙腈/水、水和无机盐的缓冲液2、在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据常用溶剂的极性顺序：水(最大)＞甲酰胺＞乙腈＞甲醇＞乙醇＞丙醇＞丙酮＞二氧六环＞四氢呋喃＞甲乙酮＞正丁醇＞乙酸乙酯＞乙醚＞异丙醚＞二氯甲烷＞氯仿＞溴乙烷＞苯＞四氯化碳＞二硫化碳＞环己烷＞己烷＞煤油(最小)在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。