高效液相色谱分析实验

仪

器分析实验报告

实验名称：液相色谱分析实验学院：化学工程学院

专业：化学工程与工艺班级：化工113班

姓名：学号

指导教师：张侃

日期： 2014年5月6日

一、实验目的

1.了解HPLC的结构，了解仪器的开、关程序；

2.了解流动相的制备和样品溶液的制备；

3.掌握外标法计算浓度的方法。

二、实验原理

液相色谱由泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，试剂瓶中的流动相被泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。

高效液相色谱分析的流程。由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。

高效液相色谱的分离过程。同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。

三、仪器与试剂

仪器：液相色谱仪（大连依利特）、10μL的微量注射器。

试剂：乙腈和重蒸水溶液6:4混合液、2,2-双[4-（4-氨基苯氧基）

苯基]丙烷（BAPP）

四、实验步骤

1.流动相的准备

准备所需的流动相乙腈和重蒸水，将其分别用有机滤膜和水膜过滤，再以6:4的比例混溶，然后超声脱气。

2.开机，色谱柱平衡

当步骤1完成后，开机，待色谱柱平衡。

3.样品溶液的准备

取合适计量的样品(如取50mg的BAPP溶于50mL的水中)，在重蒸水里溶解，最后用容量瓶里定溶，最后用有机滤膜过滤，把它注入子弹头里。

4.基线的查看

由于仪器内部压力的变化可以引起基线的不断波动，因此，需等待压力稳定后，基线平稳才能进行进样。

5.样品进样分析

用25mL的微量注射器取5mL的BAPP溶液，微量注射器中不能有气泡，将微量注射器的针头插入注射器的孔时，打开微量注射器阀，将BAPP注射进去后，迅速关闭阀门，抽出针头，等待仪器的分析结果。

6.色谱柱的清洗

分析工作结束后，要清洗进样阀中的残留样品，也要用适当的液体来清洗色谱柱。

7.关机

实验完毕后，关闭仪器和电脑。

五、实验数据

Y=701.393x+14.513

峰高与浓度的关系图

Y=30830.8x-796.07

峰面积与浓度的关系图由上图可得以下结论：

该样品的主峰出现在12.983min，在此之前与之后分别存在杂质峰。主峰的峰宽为0.3326min，峰高为1619.79114mAU，峰面积为93.3238×104mAU*s。

查浓度与峰面积以及浓度与峰高关系图可以读出：当峰面积为9.33238×104mAU*s时，浓度C=3.05mg/mL；当峰高为1619.79114mAU 时，浓度C=2.29mg/mL。

综上所述，该未知液的浓度为2.29mg/mL。

六、实验结论与分析

由于实验组分比较简单，只要在实验过程中，严格控制且定量进样，就能得出准确的实验结果。若采用归一化法或内标法，虽然能得到准确更高的实验结果，但由于实验操作及计算均较为复杂，实验及数据处理的时间长，效率相对不高，故实验中采用外标法作为定量的方法。

最佳色谱条件的选择是本实验准确度的关键。进样针进样时确保进样针中没有残留气泡，另外，在进不同浓度或不同的物质前因先用甲醇溶液润洗干净，以免相互影响。下面两幅图是标准溶液在不同浓度时峰面积图和峰高图。

由给定的数据关系可做峰高与浓度，峰面积与浓度的关系图，在根据所得的结果，在一下图上找点，如下：

由色谱图和实验结果可知，我们组该实验做的还是比较成功的。

但实验中还是应该注意以下几点：

1.注意注射器的选择，应选用平头的注射器。

2.实验过程中要注意仪器在运行中不能进入气体，气泡会使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

3.不能用纯乙腈等作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进

液。

4.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

5.液相色谱柱应选择C-18反相色谱柱。

6.使用缓冲溶液时，先用5%的乙腈和95%水冲洗，再用纯的乙腈清洗40分钟以充分洗去离子。

7.流动相的浓度不可以太高。