高效液相色谱演示实验
高效液相色谱操作步骤演示幻灯片
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流动相 ： 1、 流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸 碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系 膜和油系膜的使用范围； 2、 水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止 长菌变质；
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1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用 范围，如pH值范围、流动相类型等； 2、 使用符合要求的流动相； 3、 使用保护柱； 4、 如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后， 先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲 醇冲洗。
数据处理系统。
6、色谱工作站
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1：有机溶剂的过滤（使 用 0.45um的一次性水系 滤膜过滤）
2：流动相超声脱气 （10~30min）
滤膜
开关
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1：样品过滤（过滤装置： 一次型注射器;一次性滤 头）进入高效液相色谱仪 样品液都必须经过样品过 滤装置过滤
2:把经过称量、定容、超声 处理后的样品溶液，用一 次性注射器和一次性滤头 过滤后，加入2ml具塞试管 中备用。
顺时针旋转
量注射器将经过0.45um滤
膜过滤的标准溶液和样品
溶液逐次注入品的出峰时间定性
2：根据样品的峰面定量
（在一定的色谱操作条件下，流入检测器的待测组分的 含量、质量或浓度与检测器的响应信号：峰面积或峰 高成正比。）
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色 谱 图 示 例
1.环境污染物分析：大气、水、土壤和食品中的多环芳烃、 多环联苯，阴离子表面活性剂，有机氯农药、有机磷农药， 除草剂，酚类胺类、黄曲霉毒素等污染物的分离与测定。
2.精细化工 ：在精细化工生产中使用的具有较高分子量和 较高沸点的有机化合物，如高碳数脂肪族或芳香族的醇、 剂、药物、农药、燃料、炸药等工业产品的醛、酮、醚、 酸、酯等化工原料，以及各种表面活性分离与测定。
高效液相色谱分析实验
高效液相色谱分析实验高效液相色谱(HPLC)是一种用于分离、检测和定量分析化学样品的分析技术，具有高分辨率、高灵敏度和高选择性。
在实验室中，HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。
本文将介绍HPLC的实验原理、步骤及关键技术。
一、实验原理HPLC的原理是将混合物通过高压注射，经过固定相柱进行分离。
在HPLC中，固定相柱是最重要的组成部分之一，它可以根据样品之间的化学性质选择不同的固定相柱，如反相柱、离子交换柱、手性柱等。
在HPLC实验中，样品可以通过两种方式进样，一种是自动进样器，另一种是手动进样。
进样器将样品注入进样站点后，通过高压泵将样品推入柱子中，样品在柱子中分离后，被通过光学检测器检测，进而得到分离的结果。
二、实验步骤1.样品准备：根据实验要求，准备需要进行分析的物质样品，将其溶解或稀释到适当的浓度。
2.选择柱子：根据样品的性质选择适当的固定相柱。
例如，如果样品是极性的，则选择反相柱。
3.设定实验条件：根据样品的特征和实验需求，设置高压泵的流速、检测器、柱温等参数。
4.样品进样：将样品使用自动进样器或手动进样器进行进样。
5.柱子分离：开启高压泵，将样品推入柱子中。
样品将在柱子中根据化学性质进行分离。
6.数据检测和记录：通过光学检测器检测样品的峰值，并记录分离结果。
可以使用计算机软件进行数据分析。
7.清洗和重用：实验完成后，需要对HPLC仪器进行清洗和重置，以便下次使用。
三、关键技术1.换柱：为了保证实验结果的准确性和可靠性，柱子需要定期更换。
柱子的寿命取决于样品的特性和使用情况。
2.校准标准品：在实验中使用标准品校准HPLC仪器，以确保仪器的准确性和灵敏度。
3.优化实验条件：通过改变流速、温度、柱子等实验条件，可以优化分离效果。
4.检测器选择：根据样品的性质选择合适的检测器，例如紫外检测器、荧光检测器等。
5.数据分析：使用HPLC软件对数据进行分析，生成和保存分析报告。
四、实验安全1.注意个人防护：在操作HPLC仪器时，应佩戴安全防护眼镜和手套，避免接触有害物质。
实验高效液相色谱法详解演示文稿
5.将电极插入到被测液中,调节pH到所需值
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前处理
(1)过滤：0.45um或更小孔径滤膜
目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤
其是使用无机盐配制的缓冲液。
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐
醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水溶剂 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于 强酸，不适用于二甲基甲酰胺。
泵头 进口单向阀
单向阀结构
注意： 请不要分解阀心A和阀心B
重新组装后性能不被保证，输液可能不稳定
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线路过滤器
线路过滤器 压力传感器
故障：堵塞
现象：系统压力偏高
措施：异丙醇（或5％稀硝酸），
超声波清洗 判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速
1mL/min，如压力>0.5MPa，则堵塞。
再生纤维素滤膜：同样适用于水溶性样品和有机溶剂
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3.测定
色谱条件: 色谱柱:C18 ,4.6mm×150mm; 流动相: 甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液(5+95); 流速:1ml/min 检测波长:230nm
取样品处理液和标准系列溶液各10µl注入高效液 相色谱仪进行分离,以其标准溶液峰的保留时间为依 据进行定性。以标准溶液的浓度为横坐标, 相应的峰面积为纵坐标,分别绘制标准曲线(或计算回归 方程),从标准曲线上查出(或根据回归方程求出)样液中 被测物质的含量,按下式计算:
r
1
1
1
线性范围(mg/mL)
0～0.2
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告高效液相色谱法，基本原理为影响柱效的主要因素是涡流扩散和传质阻抗。
分为液固吸附色谱法，流动相为液体，固定相是固体吸附剂；液分配色谱法，固定相几乎全是化学键合硅胶，又称化学键合相色谱法等。
（二）塔板理论：塔板理论方程式（高斯方程式）：理论塔板式数：理论塔板高度：（三）速率理论： h=a+b/u+cu影响塔板高度的因素：1、涡流扩散 2、纵向扩散 3、传质阻抗二、气相色谱仪：（1）色谱柱：固定相与柱管组成。
填充柱、毛细管柱；分配柱、吸附柱（2）紧固液：低沸点的液体，操作方式下为液态。
甲基硅油、聚乙二醇等选择原则：按相似性、按主要差别、按麦氏差别选择。
（3）载体：化学惰性的多孔性微粒（4）毛细管色谱柱：开管型、填充型（5）检测器：1、浓度型检测器：热导检测器和电子捕捉检测器2、质量型检测器：氢焰离子化检测器中国药典对气相色谱规定：除检测器种类、紧固液品种及特定选定的色谱柱材料严禁任一修改外，其他均可适度发生改变，色谱图于30min内记录完。
第四节高效液相色谱法1、基本原理：影响柱效的主要因素就是涡流蔓延和传质电阻。
分类：1、液固吸附色谱法：流动相为液体，固定相是固体吸附剂。
2、液——液分配色谱法：紧固二者几乎全系列就是化学键再分硅胶，又称化学键再分相色谱法。
按固定相和流动相的极性2又分：正相色谱法和反相色谱法正相色谱法：流动二者极性大于紧固二者极性的色谱法。
用作拆分溶有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用作所含相同官能团物质的拆分。
极性强组分先流入反相色谱法：……………大于……………………… 用于分离非极性至中等极性的分子型化合物2、高效率液相色谱仪：1、高压输液泵2、色谱柱3、进样阀4、检测器：紫外稀释检测器、荧光检测器、热法折光检测器、电化学检测中国药典对高效液相色谱法规定：除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意更改外，其余均可适当改变，色谱图于20min内记录完毕。
第五节色谱系统适用性试验和定量分析方法一、系统适用性试验1、色谱柱的理论板数：2、分离度：应大于1.53、重复性3、拖尾声因子：0.95-1.05之间二、定量测定法：1、内标法加较正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量2、外标法测量供试品中某个杂质或主成分含量3、加较正因子的主成分自身对照法不加较正因子的主成分自身对照法。
高效液相色谱实验
1、了解HPLC的结构和流程及操作方法；2、了解流动相的制备和样品溶液的制备；3、掌握该仪器的运行程序和具体操作内容；4、学会用HPLC对样品进行分析，并从图谱中获得有用数据。
二、实验原理高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。
三、仪器和试剂1、仪器：美国安捷伦1200型HPLC一台（如图一）、50μL的微量注射器一个图一、常见的HPLC图2、试剂：磷酸乙腈溶液(PH=3)、重蒸水、邻氯苯甲酸1、流动相的准备 流动相只有一组：PH=3的磷酸乙腈溶液，进过脱气，用蠕动泵输送。
2、样品溶液的准备配置好邻氯苯甲酸溶液，按要求选好滤纸的孔径大小。
用低压过滤装置过滤，由于美国安捷伦1200型HPLC 配有脱气装置，因此滤液无需事先脱气就可以进行分析。
3、开机 当2完成后，开机，待色谱柱平衡。
4、基线的查看由于仪器内部压力的变化可以引起基线的不断波动，因此，需等待压力稳定后，基线平稳才能进行进样。
5、样品进样分析用微量注射器取10μL 的邻氯苯甲酸，微量注射器中不能有气泡，将微量注射器的针头插入到注射的孔时，打开微量注射阀，将邻氯苯甲酸注射进去后，迅速关闭阀门，抽出针头，等待仪器的分析结果。
6、色谱柱的清洗分析工作结束后，要清洗进样阀中的残留样品，也要用甲醇溶液来清洗色谱柱。
7、关机实验完毕后，关闭仪器和电脑。
五、实验数据及处理1、LC 参数表5-1 LC 参数数据表温度 流速 停止时间VWD 信号 后运行时间 最大压力 最小压力 25.0℃ 1.000 mL/min0.00 min236 nm0.00 min300 bar0 bar2、色谱柱参数 色谱柱柱子 柱长 柱子内径 运行压力 C18150 mm4.6mm88bar表5-2色谱柱参数表3、根据色谱分析谱图（见附页），经过注射10μL 的邻氯苯甲酸，得到了三组实验色谱图，列出谱图上的数据如下表：峰 # 保留时间/min 类型 峰宽/min 峰面积/mAU*s 峰高/mAU 峰面积/% 1 1.411VV 0.3191 76.03598 3.25529 0.3692 2 2.444 VV 0.1151 2.03350e4 2806.48608 98.7468 33.220VBA0.1189159.4780720.732140.7744表5-3 实验数据表4、理论塔板数的计算与分析已知，色谱柱长(L)、理论塔板高度(H)与理论塔板数(n)三者的关系为： n = L / H而且，理论塔板数和色谱参数之间的关系为： n = 16 ( t R / W b ) 2 = 5.54 ( t R / Y 1/2 ) 2 取第1组的数据计算可以得到： t R = 1.411 min = 84.66 sY 1/2 = 2.354(0.3191 / 4 ) =0.1878min= 11.27 s 则：n 1= 5.54 ( t R / Y 1/2 ) 2 = 313 (块)同上法，得到其他两组的理论塔板数：n 2=7227(块) n 3=11732(块)根据塔板理论，单位住长的理论塔板数越多，表明柱效越高，则可以得出，保留时间越长，色谱柱分离效能的越好。
高效液相色谱实验报告
联苯、甲苯、萘和菲以及它们混样的高效液相色谱分析实验目的1.熟练掌握高效液相色谱相关仪器的操作流程。
3.通过谱图分析，掌握运用谱图数据处理目标物质的方法。
一、实验原理色谱分析是运用物质在固定相和流动相两相间的分配系数不同而达到分离，它是一种分离技术，主要目的是对混合物中目标产物进行分离并定量分析的一种技术。
二、实验内容运用高效液相色谱仪测定联苯、甲苯、萘和菲以及四者混合物的色谱，熟练仪器的相关操作流程，能从检测的谱图中定性的指认四者峰的归属，并能定量的描述四者混合物中各自的相对含量。
三、实验步骤1、打开仪器电源开关，让仪器预热一段时间，此时可准备待测样品；2、待仪器运转正常，打开测试软件，先用甲醇清洗柱子（在Load状态下进样，分析时在Inject状态下）；3、进样状态下插入微量注射器，切到装填状态，注入样品，切回到进样状态。
4、点击分析按钮，输入分析的样品名；5、数据分析，通过软件查看积分面积。
五、实验结果液相色谱图0.00.51.01.52.0 2.53.0 3.54.0 4.55.0 5.56.0min0.01.02.03.04.05.06.0mV(x100)Detector A:254nm1.722/156063.034/11168863.383/7097684.037/25429775.046/7069594（2）联苯0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5mV(x100)Detector A:254nm1.7312.5784.1475.2130.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0mV(x10)Detector A:254nm1.7213.0433.4084.0845.152（4）甲苯0.01.02.03.04.05.06.07.0min0.00.51.01.52.02.53.03.5mV(x10)Detector A:254nm1.7213.0565.193（5）菲0.01.02.03.04.05.06.07.0min0.01.02.03.04.05.06.07.0mV(x100)Detector A:254nm1.7303.4065.075谱图分析：依据各个物种标样的色谱图可以知道他们各自的出峰时间大致为：菲：5.075min ；联苯：4.147 min ；萘：3.408 min ；甲苯：3.032 min ；故此可以判断混样中出峰位置所对应的物种，5.046 min 对应为菲，4.037 min 对应为联苯，3.383 min 对应为萘，3.034 min 对应为甲苯。
高效液相色谱实验
高效液相色谱实验The document was prepared on January 2, 2021高效液相色谱实验I. 色谱柱的评价请在实验前预习基础分析化学实验第二版137－140页.目的(1)了解高效液相色谱仪的工作原理；(2)学习评价液相色谱反相柱的方法.原理高效液相色谱是色谱法的一个重要分支.它采用高压输液泵和小颗粒的填料,与经典的液相色谱相比,具有很高的柱效和分离能力.色谱柱是色谱仪的心脏,也是需要经常更换和选用的部件,因此,评价色谱柱是十分重要的.而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常.评价色谱柱的性能参数主要有：（1） 柱效理论塔板数n式中t r 为测试物的保留时间,W 1/2为色谱峰的半峰宽.（2） 容量因子k’式中t 0为死时间,通常用已知在色谱柱上不保留的物质的出峰时间作死时间.(3)相对保留值选择因子α式中k 1’和k 2’分别为相邻两峰的容量因子,而且规定峰1的保留时间小于峰2的.(4)分离度R s式中t r1、t r2分别为相邻两峰的保留时间,W b1、W b2分别为两峰的底宽.对于高斯峰来讲,W b =2.为达到好的分离,我们希望n 、α和R s 值尽可能大.一般的分离如α=,R s =,需n 达到2000.柱压一般为104 kPa 或更小一些.本实验采用多核芳烃作测试物,尿嘧啶为死时间标记物,评价反相色谱柱.仪器和试剂Waters 510高效液相色谱仪由Waters 510高压输液泵,Rheodyne 7725i 进样器,440检测器和记录仪组成色谱柱：5 cm × mm ., YWG-C 18H 37 ODS,10 μm流动相：甲醇－水80+20样品I ： 含尿嘧啶 mg ·mL －1、萘 mg ·mL －1、联苯 mg ·mL －1、菲 mg ·mL －1的甲醇混合溶液；样品I I ：尿嘧啶的甲醇溶液；萘的甲醇溶液；联苯的甲醇溶液；菲的甲醇溶液.溶液浓度约为·mL －1；实验内容（1） 准备流动相.将色谱纯甲醇和色谱纯水按比例配制200mL 溶液,混合均匀并经超声波脱气后加入到仪器储液瓶中.（2） 检查电路连接和液路连接正确以后,接通高压泵、检测器和记录仪的电源.设定操作条件为：流速 mL ·min －1,压力上限2′104 kPa 约3000 psi,检22/1r )/(54.5W t n =00r /)('t t t k -=12'/'αk k ＝)/()(2b2b1r1r2s W W t t R +-=测波长254 nm 该仪器检测波长已固定,灵敏度 AUFS,记录仪走纸速度 cm ·min －1,记录灵敏度为5 mV.开启记录仪走纸开关记录基线.并调节基线到合适位置一般为距右10%处.（3） 待基线平稳后建议观察检测器的读数显示,将进样阀手柄拨到“Load ”的位置,使用专用的液相色谱微量注射器取5μL 样品注入色谱仪进样口,然后将手柄拨到“Inject ”位置,同时按一下检测器的标记按钮,同时计时,记录色谱图.（4） 重复3的实验两次.（5） 用同样方法进纯样品的甲醇溶液,确定出峰顺序.（6） 根据三次实验所得结果计算色谱峰的保留时间、半峰宽,然后计算色谱柱参数n 、k’,以及相邻两峰的α、R s（7） 将流速降为0,待压力降为0后关机.思考题1. 高效液相色谱与气相色谱相比有什么相同点和不同点2. 如何保护色谱柱延长使用寿命高效液相色谱实验II固相萃取水样中的多核芳烃并以内标法测定其含量目的（1） 学习固相萃取法处理样品；（2） 用内标法定量.原理固相萃取法是色谱法的一个重要的应用.在此方法中,使一定体积的样品溶液通过装有固体吸附剂的小柱,样品中与吸附剂有强作用的组分被完全吸附；然后,用强洗脱溶剂将被吸附的组分洗脱出来,定容成小体积被测样品溶液.使用固相萃取法,可以使样品中的组分得到浓缩,同时可初步除去对感兴趣组分有干扰的成分,从而提高了分析的灵敏度.固相萃取不仅可用于色谱分析中的样品预处理,而且可用于红外光谱、质谱、核磁共振、紫外和原子吸收等各种分析方法的样品预处理.C18固相萃取小柱具有疏水作用,对非极性的组分有吸附作用,因此可以从水中将多核芳烃萃取出来,完成浓缩样品的作用.固相萃取小柱还有其他类型,如极性、离子交换等.内标法的原理是,设在V mL 样品中含有W i g 待测组分i,加入W S g 内标物S,混匀后进样,得组分i 及内标物S 的峰面积分别为A i 及A S .由于峰面积正比于通过检测器的物质量,所以有：W i =f i A iW S =f S A S式中f i 、f S 分别为组分i 和内标S 的校正因子.两式相除,得所以,组分i 的体积浓度为：S Si S i i W A A f f W ⋅⋅=V W A A f V W A A f f VW SS i i S S i S i i '⋅⋅=⋅⋅=fi’可用已知被测物i和内标物浓度的样品进样分析得到.内标法是一种相对测量方法,因此,进样量不必准确,操作条件稍有变化对结果没有什么影响.仪器和试剂Waters 510高效液相色谱仪由Waters 510高压输液泵,Rheodyne 7725i进样器和440检测器组成色谱柱：5 cm× mm ., YWG-C18H37ODS,10 μm流动相：甲醇－水80+20 流速： mL·min－1检测波长：254 nmC18固相萃取小柱：2支25 mL移液管：1支50 mL医用注射器：1支10 mL医用注射器：2支2 mL容量瓶：2个样品I：内标标准样,含萘 mg·mL－1、联苯 mg·mL－1、菲 mg·mL－1的甲醇溶液.样品II：内标物溶液.含联苯 mg·mL－1的甲醇溶液.样品III：含萘、菲的被测水样.实验内容（1）固相萃取小柱预处理：用10 mL注射器将2 mL甲醇压过小柱,再将2 mL 纯水压过小柱.（2）用移液管取25 mL水样,用50 mL注射器压过小柱,这时水样中的萘和菲被吸附在小柱上.在小柱下端承接一2 mL的容量瓶,将约 mL甲醇用10 mL 注射器压过小柱到容量瓶中,加入一定量内标联苯溶液,定容摇匀,得到浓缩的样品.（3）按“实验I”中的步骤,进样分析内标标准样和浓缩样品各三次.（4）取平均结果,计算峰面积A s和A i；根据内标标准样的浓度计算f i’,再计算出浓缩样品中的萘和菲的浓度,进而计算出原水样中的浓度mg·mL－1.思考题1.内标法与外标法各有哪些特点本实验为什么采用内标法为好2.为什么要对色谱分析中的样品进行预处理简单列出三个以上的原因.。
高效液相色谱仪(HPCL)的演示应用
（1）类胡萝卜 素的HPLC色 谱行为特征： 通常会选择 450nm左右 的波长。当其 吸光系数已知 时,就可以根 据其峰面积对 化合物进行定 量分析。
（2）固定相 的选择： 在类胡萝卜 素的正相HPLC 分离中,最常 用的固定相是 硅胶
（3）温度 由于其线型 和刚性结构, 类胡萝卜素 分子HPLC条 件的改变比 其它化合物 要敏感的多
食品的化学安全性问题是人们关注的热门课题。食品 是人类生活中不可缺少的必需品。各种食品具有不同的 特性和营养成分，直接关系人体的健康。在食品生产过 程中往往需要添加防腐剂、抗氧化剂、人工合成色素、 甜味剂、保鲜剂等化学物质，其含量过高对人体健康不 利。此外食品在生产、包装和运输过程中可能会被化学 物质污染，如发生农药残留[1]、兽药残留[2]等危害人 体健康。通过食物链的富集，人类从食品中摄取了种类 繁多且浓度高于环境浓度的有毒、有害物质，而这些有 害物质的化学结构与性质经动植物体后变得更为复杂。 因此，食品分析的重要性日益重要。
（1）材料破碎
天然类胡萝卜素是 存在于生物组织细胞 中的。如不把细胞破 碎，是不可能将其中 的类胡萝卜素有效地 萃取出来的。因此， “材料的破碎”，准 确地讲是指细胞的破 碎，破碎的程度应达 到“亚细胞级”。
（2）萃取 类胡萝卜素的 萃取一般与材料 的破碎同步进行， 方法包括研磨和 剪切。（化合物 的相似相容原理） 应注意的事项包 括:快速、除氧、 温度、PH
1.绿色蔬菜和水果：所有绿色植物组织的细胞的叶 绿体内包含有同样的主要色素:叶绿素a和b、β-胡 萝卜素、叶黄素、紫黄质和新黄质。 2.黄-橙-红色水果和蔬菜：黄-橙-红色水果中类胡 萝卜素的组分是十分多样化的。同样的颜色可以由 不同的类胡萝卜素来产生。最典型的例子为番茄(番 茄红素)和红辣椒(辣椒红素)。
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分离色谱柱
色谱柱时色谱分析的核心
• 分离就是发生在色谱柱上 • 热力学因素
– 分离物资与固定相相互作用机理 – 填料的设计、合成与选择 – 理论塔板数：Martin & Synge,
1941 • 动力学因素
– 分离过程中操作参数对分离的影 响
– 速率理论：Van Deemter,紫外吸收 按选择性分类 • 选择性检测器：紫外检测器、荧光检测器、电导检测器 • 通用性检测器：示差折光检测器
紫外-可见波长检测器
应用范围最广泛的检测器 • 大约占使用的70% • 紫外光区：190~370nm；可见光区：370~700nm
紫外-可见波长检测器工作原理
朗伯-比尔定律：
上样(load)状态
进样(inject)状态
手动进样阀的进样
load位置
inject位置
注意：一定使用平头微量进样针
六通阀工作流程
进 样—进 样 量
•全定量环进样 准确，但浪费样品 至少需要2.5倍进样体积的样品 •部分定量环进样 进样量 < 进样环体积的一半 无层流效应的影响 误差来源于进样针及操作人员 使用内标法将可以提高进样的准确度
• 实验后以强溶剂清洗色谱柱 • 对未知样品可经梯度找到适当的等度条件
溶剂输出泵
溶剂输出泵—往复泵
工作过程：电机带动偏心轮，驱动活塞往复运动 在高压下连续以恒定的流量输送液体
优点：溶剂不受限制 死体积小 溶剂混合均匀
缺点：会产生脉冲 需增加脉冲阻尼器
往复泵的工作原理
溶剂进入 活塞收回、腔内形成低压 入口阀打开，出口阀感应压差而闭和
HPLC用水
HPLC用水
HPLC应用中要求超纯水，如检测器基线的校正和反相柱 的洗脱。 超纯水电导率>18 MΩ·cm）。 HPLC级水增加吸收特性：在1cm池中，用作空白，在 190nm、200nm和250~400nm的吸收度分别不得过 0.01、0.01和0.05。增加不挥发物，≤3ppm（中国药典 纯水≤10ppm）。
色谱柱形态
半制备 标准分析 窄径柱 微径柱
ID (mm)
8-20 4.6 2.0 1.0
Load (mg)
10-50 1 0.2
0.05
流速(ml/min)
5-30 1 0.2
0/05
柱温箱
检测器分类
按检测对象分类 • 整体性检测器：检测流动相的总体物理性质
如：示差折光检测器、电导检测器 灵敏度低、易受温度影响的波动、不适合梯度洗脱 • 溶质性检测器：测量溶质的某种特性或物化性质的变化 如：紫外检测器、荧光检测器
除气方法： • 超声脱气
流动相的准备—除气
• 氦气脱气 • 在线真空脱气
G1322A 标准真空脱气机
等度洗脱
等度洗脱不能完全分离样品
• 某些样品太复杂 • 较早洗脱出的色谱峰分离度太差 • 较晚洗脱出的色谱峰变宽或拖尾 • 考虑梯度洗脱
梯度洗脱
梯度洗脱时流动相强度随溶剂组成的改变而增强
• 梯度洗脱广泛适用于许多复杂样品与生物、聚 合物样品的分离
避免死体积、漏夜或损坏柱子
• 使用正确的接头 • 尽可能缩短连接管路长度、降低柱外效应 • 管路切口必須平整 • 在接上色谱柱前先将管路中的气泡赶净
色谱柱安装的方向性
• 接头不可拧太紧 • 打开输液泵、检查柱是否漏
色谱柱选择
除固定相选择外，还要考虑
• 内径、柱长、填料粒径
色谱柱内径
• 柱容量随柱内径增加而增加 • 小内径色谱柱柱效高，省溶剂
流动相的准备
配置流动相 • 混合、过滤、除气
溶剂的混合 • 每一组成的溶剂在混合前必须分 开测量体积再混合 • 两种溶剂混合后的体积通常不是 分开体积的总和
流动相的准备—过滤
将流动相中的颗粒除去
• 细小颗粒会阻塞色谱柱 • 影响泵的使用 • 影响检测器流通池
储液瓶加盖 溶剂进口加过滤头 加预柱保护色谱柱
高效液相色谱演示实验
石向群
九江学院分析测试中心
双黄连胶囊黄苓苷含量测定色谱条件
1、色谱仪器：Varian HPLC，配有ProStar230泵、 ProStar325UV检测器、手动进样器和柱温箱。 2、色谱工作站：Star6.4 HPLC Workstation 英文版 3、色谱柱：Varian C18柱(5μm，4.6mm×150mm)。 4、流动相：甲醇:水:冰醋酸=（50：50：1）。 5、检测波长：274nm，采样时间15min。 6、柱温：25℃ 7、对照品：黄苓苷；样品：双黄连胶囊。
液相色谱基本理论
液相色谱基本概论定义公式
液相色谱仪硬件
液相色谱仪器结构组成示意图
液相色谱仪器组成
溶剂传输系统（泵系统）
进样系统
工作站
组分收集（选相）
检测器
流动相导论
溶剂系统
• 可以是一种或多种水溶液 或有机溶剂 • 携带样品流经色谱柱至检测器 • 当与样品发生相互作用时，样品则发生分离
流动相： 甲醇：水：冰醋酸=（50：50：1）
溶剂输出 活塞推出、腔内压力增加 出口阀打开，入口阀感应压差而 闭和
单向阀的特点： 密封性能相当好 可以非常敏感地感应压差而迅速闭和
多元泵Prostar230
低压比例分配，高压/低压 梯度混合
• 適合開發應用在複雜移動相混合方法 • 多溶劑依比例閥快速切換而準確混合 • 一般入口單向閥感應開啟的壓力<1atm • 短暫的壓力降造成氣泡問題
如何解決氣泡問題
• 在線脫氣：效能隨時間變差 • 吹氦脫氣：成本高 • 瓦里安的專利方法
多元梯度，比例阀混合
• 三个微电子处理器控制比例阀 • 溶剂比例依%ABC编程控制 • 进入75ul混合腔内混合 • 有相当精确的混合比例控制
脉冲
•单活塞往复泵脉冲特点 正弦波 必须加脉冲阻尼器
•输液泵流速调节 进液速度固定在200毫秒 输液速度较慢 调节输液速度，从而改变流速 当流速为1ml/min时，输液速度为4.3秒
脉冲阻尼器
作用：消除输液泵造成的脉冲 瓦里安的设计
体积700ul的U型管 内管为弹性材料制成 外部以脱气、可压缩的液体包围 输液时 压力增加，弹力管膨胀 能量储存于液腔内 进液时 能量传递至管内，维持流速恒定
手动进样阀
•六通阀设计 耐高压，低死体积 可以手动或自动旋转进样阀 自动进样的重复性优于手动进样