黄色须腹菌液体菌剂保存温度及活性研究
活化菌种的方法
活化菌种的方法菌种是微生物学研究中非常重要的一部分，它们可以用于制备各种发酵产品，如酸奶、酒、酱油等。
但是，菌种经过一段时间的保存后，会出现休眠或死亡的现象，这就需要进行活化处理，使其恢复生命活力。
本文将介绍几种常见的活化菌种的方法。
一、温度法温度法是最常用的活化菌种方法之一。
该方法是将被保存的菌种移至适宜的温度环境下进行培养，使其恢复生命活力。
具体方法是将菌种从冰箱中取出，放置于适宜的温度环境中进行培养。
一般情况下，大多数菌株的培养温度为30℃左右。
二、营养法营养法是通过添加适当的营养成分来活化菌种。
该方法适用于营养成分缺乏、菌种处于休眠状态的情况。
具体方法是将保存的菌种接种到含有适量营养成分的培养基中进行培养。
常用的营养成分包括葡萄糖、酵母粉、胰蛋白胨等。
三、pH法pH法是通过改变培养基的pH值来活化菌种。
该方法适用于菌种处于休眠状态、培养基酸碱度不适宜的情况。
具体方法是将保存的菌种接种到pH值适宜的培养基中进行培养。
一般情况下，大多数菌株的适宜pH值为6.5-7.5。
四、氧气法氧气法是通过调节培养环境氧气含量来活化菌种。
该方法适用于需氧菌株、培养环境氧气含量不足的情况。
具体方法是将保存的菌种接种到含有适量氧气的培养基中进行培养。
常用的氧气供应方式包括摇床培养和搅拌培养。
五、复苏法复苏法是通过多种活化手段的组合来活化菌种。
该方法适用于菌种处于极度休眠状态、多种单一活化手段无法恢复生命活力的情况。
具体方法是将保存的菌种接种到含有多种活化成分的培养基中进行复苏培养。
常用的活化成分包括葡萄糖、酵母粉、胰蛋白胨、氧气等。
总之，活化菌种是菌种保存和利用中的重要环节。
选择合适的活化方法可以使菌种恢复生命活力，保证其在后续的利用中发挥更好的作用。
菌种的保藏方法
菌种的保藏方法菌种保藏是微生物学研究中必不可少的一环。
菌种保藏的目的是保存菌种的遗传信息、保持菌种的稳定性和纯度，为后续的研究提供保障。
本文将介绍几种常见的菌种保藏方法。
1. 冻干法冻干法是一种常用的菌种保藏方法。
将菌株培养在适宜的培养基上，生长到适当的密度后，用无菌的冻干管吸取菌液。
将冻干管放入液氮中，冷冻至-80℃，待冻干后，将管子密封，保存在-80℃的冰箱中。
冻干菌株可以保存多年，但是需要注意菌株的密封性和保存温度。
2. 静态液氮法静态液氮法是一种高效、长期保存菌株的方法。
将菌株培养在适宜的培养基上，生长到适当的密度后，用无菌的冻存管吸取菌液。
将菌液加入等量的甘油（最终甘油浓度为20%），混合均匀后分装到冻存管中。
将冻存管放入液氮中，冷冻至-196℃，保存在液氮罐中。
静态液氮保存的菌株可以保存数十年，但是需要注意菌株的密封性和保存温度。
3. 冷藏法冷藏法是一种简单、易行的菌株保存方法。
将菌株培养在适宜的培养基上，生长到适当的密度后，用无菌的冻存管吸取菌液。
将冻存管放入4℃的冰箱中保存。
冷藏法保存的菌株可以保存数个月，但是需要注意菌株的密封性和保存温度。
4. 活体保存法活体保存法是一种将菌株保存在活体状态下的方法。
将菌株培养在适宜的培养基上，生长到适当的密度后，用无菌的冻存管吸取菌液。
将菌液加入等量的甘油（最终甘油浓度为20%），混合均匀后分装到冻存管中。
将冻存管放入冰箱中，温度为4℃-8℃。
活体保存法可以保存数个月，但是需要注意菌株的密封性和保存温度。
5. 长期培养法长期培养法是一种将菌株保存在活体状态下的方法。
将菌株培养在适宜的培养基上，生长到适当的密度后，用无菌的冻存管吸取菌液。
将菌液加入等量的甘油（最终甘油浓度为20%），混合均匀后分装到冻存管中。
将冻存管放入冰箱中，温度为4℃-8℃。
每隔一段时间，将菌株转移到新的培养基上进行培养，以保持菌株的纯度和稳定性。
总之，菌种保藏是微生物学研究中必不可少的一环。
菌肥适宜温度
菌肥是一种以微生物为主要成分的有机肥料，其中包含有益的微生物，如细菌和真菌。
这些微生物在不同的温度条件下表现出不同的活性水平。
适宜的温度范围对于这些微生物的生长、繁殖和分解有机物质是至关重要的。
一般而言，菌肥中的微生物活动适宜的温度范围通常在较宽的区间内，但确切的适宜温度取决于具体的微生物种类。
以下是一些常见的微生物在菌肥中的适宜温度范围：
细菌：
1.嗜热细菌：通常在较高的温度范围内活跃，适宜温度可能在 40°C 到 75°C
之间。
2.嗜冷细菌：在较低的温度下活跃，适宜温度可能在 0°C 到 20°C 之间。
3.中温细菌：适宜温度通常在 20°C 到 40°C 之间。
真菌：
1.温度耐受范围较广：大多数真菌对温度有一定的适应性，适宜温度可能在
20°C 到 40°C 之间。
注意事项：
▪菌肥中的微生物群落通常是多样性的，包含多种细菌和真菌。
因此，整体而言，菌肥的适宜温度范围可能相对较广。
▪菌肥的使用应避免在极端的高温或低温条件下，以免影响微生物的活性和功能。
总体而言，为了保持菌肥中微生物的活性，建议在适宜的温度条件下存储和使用。
在农业和园艺上使用菌肥时，了解微生物的适宜温度范围对于最大化其效益是至关重要的。
益生菌的储藏条件
益生菌的储藏条件益生菌是一种有益的微生物，可以帮助人体维持肠道菌群平衡，增强免疫力，促进营养吸收等作用。
在日常生活中，我们可以通过食用含有益生菌的食品或者口服益生菌制剂来摄入益生菌。
但是，益生菌的储藏条件也是非常重要的，它关系到益生菌的活性和效果。
本文将介绍益生菌的储藏条件和注意事项。
一、储藏温度益生菌的储藏温度是非常重要的。
益生菌适合生长的温度一般在15℃~30℃之间，过高或者过低的温度都会影响益生菌的生长和存活。
因此，在储藏益生菌时，应该选择温度适宜、稳定的地方，避免暴露在高温或者低温环境中。
一般来说，室温（20℃~25℃）是比较适宜的储藏温度。
二、储藏湿度益生菌的储藏湿度也是需要注意的。
过高的湿度会导致益生菌失活或者变质，过低的湿度则会使益生菌失去活性。
因此，在储藏益生菌时，应该选择相对湿度适宜的地方。
一般来说，相对湿度在50%~70%之间是比较适宜的。
三、储藏时间益生菌的储藏时间也是需要注意的。
长时间的储藏会导致益生菌失活或者变质，影响益生菌的效果。
因此，在储藏益生菌时，应该注意保持新鲜度，尽快食用或者使用。
一般来说，开封后的益生菌制剂应该在一周内食用完毕，未开封的益生菌制剂则应该在保质期内使用。
四、储藏容器益生菌的储藏容器也是需要注意的。
储藏容器应该具有密封性和防潮性，可以有效地保持益生菌的新鲜度和活性。
一般来说，玻璃瓶、塑料瓶和铝箔袋等密封性好、防潮性好的容器都可以用来储藏益生菌。
五、其他注意事项除了上述几点之外，还有一些其他注意事项需要注意：1.避免阳光直射：阳光会导致益生菌失活或者变质，因此应该避免阳光直射。
2.避免高温烹饪：高温烹饪会破坏益生菌的活性，因此应该避免高温烹饪。
3.避免与抗生素一起使用：抗生素会杀死益生菌，因此应该避免与抗生素一起使用。
4.注意保质期：在购买益生菌制剂时，应该注意保质期，选择新鲜的产品。
总之，益生菌的储藏条件和注意事项非常重要，关系到益生菌的活性和效果。
常用菌悬液的制备及保存方法使用期限
常用试验用菌种的生物学特征。
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆形，染色均匀，芽孢椭圆形或圆柱形，位于菌体中央，革兰氏染色阳性，能运动。
培养特性：a 肉汤琼脂平板：菌落表面粗糙，圆形，灰黄色，边缘锯齿状，分离时应挑选粗糙形菌落。
b普通肉汤培养基：呈少量浑浊并产生沉淀，在液体表面形成皱状厚膜粘附于试管壁上。
C最适宜培养温度30~37℃，生长温度范围：15~35℃，兼性厌氧或需氧。
抵抗力：菌体湿热55℃1小时被杀死，芽孢100℃3小时或120℃40分钟被杀死。
短小芽孢杆菌[CMCC（B）63 202]形态与染色：杆状，革兰氏染色阳性，无荚膜，芽孢偏生，椭圆形有动力。
培养特性：平板分离时应挑选光滑菌落，其它与枯草芽孢杆菌相似。
藤黄微球菌[CMCC（B）28 001或A TCC 9341a]形态与染色：球形排列成立体状呈八叠。
革兰氏染色为阳性。
培养特性：a肉汤琼脂平板菌落为黄色，圆形，光滑，凸出，表面润湿光亮，平板分离时应挑选光滑菌落。
b普通肉汤呈黄色沉淀，很少浑浊。
c需要氧菌，最适生长温度为25℃。
金黄葡萄球菌[CMCC（B）26 003]形态与染色：圆球形排列成典型的葡萄串状，肉汤琼脂平板培养多呈短链状或双球状，无鞭毛，不能动，不产生芽孢，革兰氏染色阳性。
培养特性：a在28~38℃生长较好，pH生长范围为4.5~9.8，pH7.4左右生长最好。
b平板分离时应挑选光滑菌落。
大肠埃西菌[CMCC（B）44 103]形态与染色：短形杆菌，两端钝圆，无芽孢，革兰氏染色为阴性。
培养特性：需氧菌，也兼性厌氧。
检定菌的基本要求1.显示临床特点，对抗生素主要组分敏感，对杂质，降压物质及毒性物质无作用或作用很低。
2.灵敏、稳定，抑菌圈边缘清晰，测定误差小。
3.易于培养、保存，又无致病性。
4.与其它国家药典的试验用菌最好一致，便于单位统一。
标准品的保存与稀释标准品的保存：标准品应置5℃以下保存，安瓿开启后应将标准品转移到小瓶中，将此小瓶封口放在盛有硅胶或氯化钙的干燥瓶内，置5℃以下冰箱中保存。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
2、传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5克）置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤最大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。
益生菌的保存方法
益生菌的保存方法
以下是保持益生菌的最佳存储方法：
1. 温度：将益生菌保持在适当的温度是非常重要的。
大多数益生菌需要存储在2-8C（冰箱温度）的环境中，但也有一些益生菌可以在室温下存放。
请查看产品包装上的说明。
2. 光照：益生菌对光照非常敏感，因此应避免暴露在强光下。
将产品存放在阴暗的地方，远离阳光直射或强光。
3. 湿度：益生菌应保持在干燥的环境中。
湿度过高可能会导致益生菌失活或发生变质。
因此，存放在密封的容器中，以防止水分进入。
4. 时间：请确保在保质期内使用益生菌产品。
在过期日期之后，益生菌可能会产生变化或失去活性。
5. 合理使用：按照产品包装上的指导使用益生菌。
遵循剂量和使用频率建议，以确保最佳效果。
总之，将益生菌存放在冰箱中的适当温度，避免光照和湿度，注意产品的保质期，并按照使用说明来使用，将有助于保持益生菌的活性和效力。
标准菌株保藏要求
标准菌株保藏要求
为了保证菌株的可靠性和稳定性，菌株的保藏应符合以下要求：
1. 菌株应在适宜的培养基上培养，生长状态应处于稳定阶段。
2. 菌株应经过严格的鉴定和鉴定记录，确保其种类和特性的准确性和可靠性。
3. 菌株应在含有适当保藏剂的培养基上保存，如甘油、DMSO、乳糖等。
4. 菌株应在低温条件下保存，通常为-80℃或液氮温度。
5. 菌株的保藏容器应具有气密性和耐冻性，如冷冻管、玻璃瓶等。
6. 菌株的保藏过程应记录详细并保存完整，包括菌株来源、保藏方法、保藏时间等。
7. 菌株的保藏期限应根据不同的菌种和保藏条件确定，必要时应定期检测其稳定性和可用性。
8. 菌株的保藏和使用应符合相关法律法规和伦理规范，避免对环境和人类健康造成危害。
以上是标准菌株保藏的基本要求，保证菌株的可靠性和稳定性，为科学研究和应用提供基础保障。
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黄色须腹菌液体菌丝菌剂保存温度及活性研究 马仕波，叶建仁 (南京林业大学 森林资源与环境学院， 江苏 南京210037) 摘要：选择有代表性的胞外酶进行测定，发现TTC脱氢酶与菌丝活力呈现出极显著的正相关，说明TTC脱氢酶酶活值的大小可以反映菌丝菌剂活力的高低。4℃时菌丝的絮状形态和活性能较好的保存下来，有利于液体菌丝菌剂的田间应用。所以液体菌丝菌剂的保存温度以4℃为宜。 关键词：黄色须腹菌，保存温度，菌丝活性 中图分类号：S718.81 文献标识码：A Study on storage temperature and mycelium activity of Rhizopogon
luteous liquid mycelium agents
MA Shi-bo, YE Jian-ren* (College of Forest Resources and Environment Nanjing Forestry University, Nanjing 210037) Abstract：It measured three typical extracellular enzyme activity. TTC dehydrogenase was significantly related to hyphal activity at 0.01 level. The TTC dehydrogenase activity could better reflect the dynamic strength of the fertilizer should be used as inocula vitality flag. In 4℃, the floc form of mycelium could be preserved, which was conducive to liquid mycelium agents direct application in the field. So, it should be appropriate to save liquid mycelium agents in 4℃. Key words：Rhizopogon luteous；Storage temperature；Enzyme activity
液体菌剂的活性指标是外生菌根菌菌剂的保存效果的重要体现，目前用于检测外生菌根真菌菌剂的活性指标研究还鲜有报道[1]。黄色须腹菌菌丝发酵液能产生胞外酶，而且方便测定，本实验研究保存过程中的三种典型胞外酶活性，确定菌丝体活性的指标，为黄色须腹菌液体菌丝菌剂的菌丝活性检测提供理论依据[2]。同时研究菌丝的保存温度条件，以确定黄色须腹菌液体菌丝菌剂的最佳保存温度。
1材料与方法
1.1材料 1.1.1实验材料 发酵罐发酵所得的黄色须腹菌菌丝体。 1.1.2试剂 葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素B1、氢氧化钠、盐酸、磷酸、聚乙烯醇、聚乙二醇、琼脂、马铃薯、有机硅消泡剂、对硝基磷酸钠、对硝基酚、邻苯二酚、浓硫酸、乙酸乙酯、TTC、连二亚硫酸钠。
收稿日期：2013-06-23 修回日期： 基金项目：国家林业局林业行业公益性项目No.201004061；国家“十二五”科技支撑项目(2012BAD19B0703) 作者简介：马仕波 (1988-)，男，硕士。 通讯作者（Corresponding Author）：叶建仁，男，教授，博士生导师。 1.1.3仪器 摇床、恒温培养箱、电子分析天平、pH计、超净工作台、立式电热压力蒸汽灭菌锅、粉碎机、恒温电热鼓风干燥箱、上海国强自动搅拌新概念高级液体发酵罐。
1.2试验方法
1.2.1酸性磷酸酶的测定 取发酵液菌丝若干，用滤纸吸干发酵液，称取1g菌丝样品，用5mL研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm下离心10min。吸出上清液，即为酶粗提取液。放在冰箱储存备用。 取酶液0.5mL，加水至1mL，然后加入缓冲液1mL和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL。空白对照用1mL研磨缓冲液代替酶制剂。充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min，不时摇动。10min后，加入1mL0.5molNaOH溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。在400nm波长下测吸光度A。 以每毫克种子每分钟水解底物的nmol数表示。
W109V3.1AV/0.01mgmin/nmol1酶活性
式中0.019为pH=14时，对硝基酚的μmol吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L时的吸光度；3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将μmol化为nmol乘上1000；V为酶制剂总体积；V1为每次用酶体积。
1.2.2多酚氧化酶的测定 0.1 mol/L 邻苯二酚 2ml，加入 0.05mol/L pH6.0 的磷酸缓冲液 2ml，再加 0.5ml 酶液，28℃保温 30min，测 400 nm 波长处的 OD 值。定义每分钟引起 0.01个吸光度的增加所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
1.2.3 TTC脱氢酶的测定 取发酵液菌丝若干，用滤纸吸干发酵液，称取2g菌丝于研钵中，加入6mL 0.5%TTC，在35℃下保温2h，后加2滴浓硫酸阻止反应，取出菌丝，用滤纸吸干TTC溶液，放入研钵中，加入4 mL乙酸乙酯，充分研磨菌丝。用移液枪吸出红色液体，并用乙酸乙酯洗菌丝到无红色液体出现，将洗涤液一并移到 25mL 刻度中，并定容至 15mL，以乙酸乙酯为参比，在 485nm 下测其吸光值。定义每克干物每小时引起 0.01 个吸光度的变化所需的酶量为一个酶活力单位(U)。 标准曲线的制作：在小烧杯中加入0.4ml pH为7.5 的 0.5%TTC 溶液，20ml 的乙酸乙酯和少量还原剂连二亚硫酸钠，然后混合摇动使生成红色的 TF，用移液枪分别吸取红色溶液 0.25、0.5、1.0、1.5 和 2.0ml，加入乙酸乙酯定容至 5ml，在 485nm 处测相应的光密度值，制作标准曲线。 TTC脱氢酶活性的定义：一定量的鲜菌丝，在一定温度和 pH 下，与 TTC 溶液反应单位时间内还原所生成的 TF 量(1U=1μgTF/h/m)。 1.2.4菌丝活力测定 将不同保存时间的菌丝菌剂接种到PDA固体平板上培养，培养120h后用十字交叉法测定菌丝生长的直径，计算菌丝日均生长速率。
1.2.5温度对菌丝菌剂保存的影响 设定-20℃、4℃、25℃三个温度梯度的保存条件，每隔20d对保存的样品进行取样无菌操作接入PDA固体平板上，测定菌丝活力。
2结果与分析
2.1保存过程中酸性磷酸酶酶活变化 酸性磷酸酶(acid phosphatase，AcPase)是溶酶体特有的酶[3]，酸性磷酸酶在菌根真菌菌丝侵染林木形成菌根的过程中发挥重要作用[4]，酸性磷酸酶是一种真菌比较常见的胞外酶[5]，不同保存时间下的菌液酸性磷酸酶活性测定结果图1表明， 酸性磷酸酶活性随着保存时间的延长呈现M型的变化规律，酶活在保存60d和100d时与最开始保存时的酶活值基本相当，在0-60d和60-100d期间均呈现先上升后下降的趋势，并且两个期间酶活的最大值也基本一致。
051015202530354045
020406080100保存时间(d)
酶活(U)
图1不同保存时间下的酸性磷酸酶酶活变化 Fig.1 Enzyme activity of acid phosphatase at different save time
2.2保存过程中多酚氧化酶酶活变化 多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,简称PPO)是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。1973年， Kubowitz在Warburg实验室中第1次分离出多酚氧化酶[6]。多酚氧化酶常常代表着很多时期很多物种都生命的活性。不同保存时间下的菌液TTC脱氢酶活性测定结果图4-2表明， 多酚氧化酶活性随着保存时间的延长都有下降的趋势，一开始时下降幅度较小，到保存两个月后酶活值下降幅度较大，至80d时基本失活。 01020304050020406080100保存时间(d)
酶活(U)
图2不同保存时间下多酚氧化酶酶活变化 Fig.2 Enzyme activity of polyphenol oxidase at different save time
2.3保存过程中TTC脱氢酶酶活变化 TTC脱氢酶也是一种典型的胞外酶[7]，常常用于检测种子的活力。TTC-脱氢酶是最直接反应菌种活力大小的物质，原则上说，菌龄越大，菌种活力越低[8]。不同保存时间下的菌液TTC脱氢酶活性测定结果图3表明， TTC脱氢酶活性随着保存时间的延长都有下降的趋势，下降幅度较多酚氧化酶酶活值下降幅度大，在常温下酶活在80d左右就降到接近0，基本失活。
010203040506070
020406080100保存时间(d)
酶活(U)
图3不同保存时间下TTC脱氢酶酶活变化 Fig.3 Enzyme activity of TTC dehydrogenase at different save time
2.4不同保存时间下的菌丝活力 菌丝日均生长速率是菌丝活力最直观的表现，测定不同保存时间下菌丝日均生长速率结果图4表明，菌丝的日均生长速率在保存的100d时间内呈下降的趋势，在开始的60d内菌丝日均生长速率下降幅度不是很大，在60-80d期间下降幅度较大，保存100d时，菌丝的生长速率变得十分缓慢了。