目的基因的分离和克隆
基因克隆过程及注意事项
以猪APOA2基因为例一．提取总RNATRIzol法提取RNATRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和总蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用Trizol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织的总RNA，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。
TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。
所有的操作可以在一小时内完成。
TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。
故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。
并且利用DNA、RNA和蛋白质在不同溶液中的溶解性质，可以通过分层分别将不同层中的RNA（上层）、DNA（中层）、蛋白质（下层）分离纯化出来，效率极好。
Trizol试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。
例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。
当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8使用TRIzol注意事项TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。
目的基因T载体克隆实验步骤
目的基因T载体克隆实验步骤目的基因T载体克隆实验步骤PCR产物的T载体克隆一. 重组质粒的构建：重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。
pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。
这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。
因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶二. 感受态制备原理细菌在0 C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。
三. β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。
基因工程基本原理
基因工程基本原理
基因工程是通过改变生物体的基因组来实现对其性状的调控的技术。
其基本原理包括以下几个步骤：
1. 基因选择：从目标生物体中选择具有所需性状的基因。
2. 基因克隆：将目标基因从生物体中分离出来，通常通过
PCR等方法进行基因扩增。
3. 基因构建：将目标基因插入到载体DNA中，构建重组DNA。
载体可以是细菌、酵母或其他生物的染色体片段，一
般被称为质粒。
4. 基因转导：将重组DNA导入到宿主生物体中。
这通常使用
基因枪、电穿孔和细菌介导等技术来实现。
5. 检验与筛选：对转导后的宿主生物进行筛选，确认目标基因达到预期效果。
这可能需要对基因表达进行检测，例如通过PCR、基因表达测定等方法。
6. 基因表达：在宿主生物中，目标基因会被表达为蛋白质，进而影响其性状。
这可能需要使用特定的启动子、RBS和终止
子等元件来调控基因表达水平。
基因工程的基本原理就是通过这些步骤来实现对基因组的改造，从而达到人为调控生物性状的目的。
这项技术在农业、医学和
生物工程等领域有广泛应用，例如改良植物品种、生产特定药物和生物材料等。
基因的克隆与表达
PL启动子---温度
诱导
插入位点--HpaI
（三）分泌型表达载体： 1、主要元件： 启动子和SD序列
信号肽序列 ： SD 下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。
分泌型表达载体----pINIII-ompA1
分泌型融合表达载体----pEZZ18
六．提高表达水平的手段 1、选择合适载体，提高翻译水平 • 强启动子----提高转录水平
1、启动子：建立表达载体时，选择强 启动子。
常见原核强启动子：
• Plac ：受 Lac 阻遏蛋白负调，受 IPTG 的 诱导 • Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。
• Ptac :Lac 启动子和 Trp 启动子的杂合启 动子。 • PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启 动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度 诱导。
1973年Cohen完成第一个基因工程实验 经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌
所需元件：
限制性内切酶
连接酶
载体
受体细胞
基因克隆（分子克隆molecular cloning）----通过体外重组技术,将一 段目的DNA经切割、连接插入适当载 体，并导入受体细胞，扩增形成大量 子代分子的过程。
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是重 组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
四、体外重组的策略
1、粘末端连接
1）全同源粘末端连接
• 最方便简单
• 高背景-载体自身环化 • 双向插入
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌 至胞周间隙
第四章 目的基因的获得-PCR
5’ ATCTTGAAC
模板
Taq
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA 5’
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
Taq
模板
ACGTACGTA 5’
4. 1个循环的结果
5. 新一轮循环开始 变性—复性—延伸。
DNA elongation
理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。
（2）合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的 二核苷酸聚合。
2. 亚磷酸三酯法 原理
将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH
与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接， 然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去，所使 用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具 体的合成和延伸过程如图。
人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所 要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。
模板
5’ ATCTTGAAC 引物
5’ ATCTTGAAC 3’ 3’ TAGAACTTG
TGCATGCAT 3’ 3’ ACGTACGTA 5’
引物
模板
ACGTACGTA 5’
3. DNA链的延伸
72 oC
DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链
(d)
3’
3’ 5’ 引物1 3’ 引物1互补链 5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’ 3’
3’ 5’
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
（四）PCR的特点
大学《基因工程学》教学大纲
《基因工程学》课程教学大纲（Genetic Engineering）一、课程说明课程编码：02200200课程总学时（理论总学时/实践总学时）：48（48/0）周学时（理论学时/实践学时）：4（4/0）学分：31．课程性质：专业必修课。
2．适用专业与学时分配：适用生物技术专业。
教学内容与学时分配3．课程教学目的与要求：本课程的授课对象是生物技术专业的本科生。
课程简介：《基因工程》是生物技术专业的专业必修课程。
其以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段而建立起来的一门技术学科。
基因工程兴起于20世纪70年代初，它的问世带动了生物技术的兴起和发展，是现代生物技术的核心内容。
基因工程课程的主要内容包括基因的分离、基因的克隆、基因的表达、植物基因工程、动物基因工程、药物基因工程和基因治疗等。
它是生命科学学院生物技术专业本科生的主干专业课程之一，它是生物工程（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程）中最重要的课程，其它三大工程是建立在基因工程基础之上的，同时也为生物技术制药等后继学科奠定了重要的理论基础。
课程目标：设置本课程是为了让生物技术专业的学生理解和掌握基因工程的技术原理，通过本课程学习，掌握基因操作的工具酶，基因克隆常用载体，目的基因的分离与合成，重组体的构建，重组体向宿主细胞的导入，重组体克隆的筛选与鉴定以及克隆基因的表达，同时了解基因工程在生物学领域中的应用与发展前景。
对学生达到毕业要求贡献如下：1）了解基因工程学的历史、发展和前沿知识。
2）掌握基因工程学的基础理论、基本知识和基本技能；教学要求：学完基因工程学后，学生将具备以下能力：1）具有良好的自学能力；2）综合运用所掌握的基因工程学理论知识和技能、从事生物科学及其相关领域科学研究的能力。
4．本门课程与其它课程关系：先修课程为生物化学、微生物学、分子生物学、细胞学等，具备基础理论知识及实验能力是基因工程学课程的基础。
目的基因的克隆方法
目的基因的克隆方法
1. 直接克隆法呀，这就好比你直接去商店挑了一个你最喜欢的玩具，简单又直接！比如说，我们想克隆某个特定基因，就像你一眼看中那个可爱的小熊玩偶，直接把它拿过来就行啦。
2. 还有反转录克隆法哦，哎呀，就好像把一段声音录下来再倒放出来一样神奇！比如从细胞中的 mRNA 反转录得到 cDNA，不就是很有趣的过程嘛？
3. 载体介导克隆法呢，就好像给基因找了一辆专门的车来运输它！像把基因放到特定的载体里，让它顺利到达目的地。
4. 基因文库筛选法呀，哇，这就像是在一个超级大的宝库中找宝贝！比如说在庞大的基因文库中去努力找到我们想要的那个目的基因。
5. PCR 扩增克隆法哟，这就跟变魔术一样厉害呢！比如通过 PCR 技术把特定基因大量扩增出来，好神奇呀！
6. 杂交捕获克隆法，哈哈，就好像用一个小陷阱去抓住我们想要的基因！像是专门设计来抓住目标基因一样。
7. cDNA 末端快速扩增法，这不就像是跑步冲刺一样快速到达终点嘛！像快速扩增 cDNA 的末端，得到我们要的基因片段。
8. 人工合成克隆法，哇塞，这可真牛，就像自己动手做一个超级厉害的东西出来！比如人工合成一些小的基因片段呢。
9. 染色体步移克隆法，嘿嘿，就好像一步一步探索一个神秘的地方一样！像是沿着染色体逐步找到我们的目的基因。
我觉得这些目的基因的克隆方法都超级有趣，各有各的神奇之处呀！真的是让我们对基因世界的探索更加丰富多彩了呢！。
基因工程概论(3)
5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3’ … C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A… 5’
Zn2+
T-G-G-A-G-T… 3’
A-C-C-T-C-A… 5’
gap
核酸修饰酶 末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）：
TdT的基本特性：来自小牛胸腺
不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs 5’ p 3’ HO
3’ HO
TdT
5’ p 3’ HO AAAAAAAAAAA
Co2+
dATP AAAAAAAAAAAAAA OH 3’
p 5’
3 基因工程的基本条件
B 用于基因克隆的载体
载体的功能及特征
质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DNA
考斯质粒（cosmid）
载体的功能及特征 载体的功能：
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
DNA pol I
5’ ppp dN Mg2+
3’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’
5’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） ：
Klenow 酶的基本性质：
大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得C端三分之二的大 肽段，即为Klenow酶。 Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，
5’ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH
3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
… 3’
… 5’
基因克隆
基因克隆的方法基因克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义DNA段同能够自我复制的载DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此基因克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA 技术。
根据这个定义，于是选择和使用不同的方法，最后得到含有目的基因片段的菌株。
针对目的基因的来源不同，可以选择多种克隆方法，但并没有放之四海而皆准的方法，要针对自己的目的基因的特点采取相应的且合适准确的方法来获得目的基因的克隆。
1当目的基因的序列完全已知时。
则可以根据文献上所查到的基因的注册序列号到相应的网上数据库去查找该基因的全序列结构信息，例如最常用的美国NCBI网站上的Genbank数据库。
然后查找到相应的目的基因的核苷酸序列信息和其来源。
然后使用生物信息学软件对基因的序列进行分析，设计通过PCR反应来扩增目的基因的核苷酸引物，并将设计的引物序列发给生物技术公司合成，最后得到引物核苷酸并用纯水进行合理的稀释。
接下来将采集含有目的基因的生物标本材料，使用合理的方法提取生物标本的基因组并进核酸浓度与纯度的测定，由于生物体的核酸从化学性质上来讲主要分为DNA和RNA两种，所以提取基因组后针对基因组的选择要尽可能去除另一种核酸的干扰与污染。
然后根据基因组的质量，浓度，PCR扩增设计引物的结构，目的基因的长度等因素设计PCR反应的条件，反复试验以找到能够通过PCR方法来准确扩增目的基因的最佳反应条件。
在目前的PCR反应中所采用工具酶为Taq DNA聚合酶，通常所用的Taq DNA聚合酶具有一个生物反应特性，在其扩增的PCR产物上，其3’末端总是会带有一个非模板依赖性的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A( dATP), 因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性，故可以针对这一点采取两种克隆策略。
其一，可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接；其二，可直接与一些T载体（切口处含有一个突出T碱基的克隆载体）连接并克隆。
基因重组技术
④ 转化
⑤ 筛选
5
⑥ 表达
3 基因重组技术 2 基因重组技术的工具酶 2.1 限制性核酸内切酶(Restriction endonuclease)——分子剪刀
定义
是一类以环状或线性双链DNA为底物，能识别 DNA中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使 每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具3’-OH和 5’-P基团DNA片段的内脱氧核苷酸酶(endodeoxyribonuclease)。
17
寡核苷酸片段组装基因的方式 基因的组装：按设计要求用许多寡核苷酸片段装 配成完整基因的过程。 第一种方法是先将寡核苷酸 激活，带上必要的5’-P基团， 然后再与相应的互补寡核苷 酸片段退火，形成带有粘性 末端的双链寡核苷酸片段。 把这些双链寡核苷酸片段混 合在一个试管中，加上T4 DNA连接酶，使它们彼此连 接组成一个完整的基因或者 是基因的一个片段。
在识别序列内部或 附近特异切割
十分有用
距识别序列下游 2426bp处切割
有用
8
识别序列
定义
限制性核酸内切酶在双链DNA分子上能识别的 特定核苷酸序列。又称为识别位点、靶位点或切割 位点。
长度
4、5、6或7个核苷酸。
结构特点
具有双重旋转对称结构，即：回文结构 （palindromic sequence）。
简称 限制性内切酶、限制酶、内切酶。
6
种类
目前，已从近300种不同的微生物分
离出约500种限制性核酸内切酶。 类型（ 三种类型）
型酶、 型酶和 型酶。
若无说明，通常的限制性核酸内切 酶就是指 型酶。
7
三种核酸限制性内切酶的主要特性比较
特 性
酶分子的结构与功能 辅助因子 识别序列
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将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸[ oligo(dT) ] 纤 维素中进行亲和层析
可编辑ppt
13
2.第一股 cDNA合成
1）以Oligo(dT) 为引物：从模板3’末端开始， 沿模板的3’→5’方向合成, 对于较长的 mRNA分子很难得到全长cDNA
2）随机引物：以6～8个核苷酸为随机引物，从 mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链 （RNA-DNA）
3.第二股cDNA的合成
可编辑ppt
14
⑴ 自身引导法： ⑵ 置换合成法 ⑶ 外加引物合成法
4.cDNA与
筛选目的基因
⑴ 核酸杂交法 特殊标记的寡核皿内所形成的菌落或噬 菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加 带标记的探针进行杂交，能显示特异结合 探针的点（克隆）便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取， 再用限制性酶切出cDNA基因片断，即为目 的基因。（如图）
第四章 目的基因的分离和克隆
• 第一节 • 第二节 • 第三节
目的基因的获得 获得目的基因方法的选择 目的基因重组体的构建
可编辑ppt
1
第一节 目的基因的获得
• 一、化学合成 • 二、聚合酶链反应（PCR） 方法扩增目• 五、其他方法
N = ——————————————— = 9.2×106
In （1－1.5×103／3×109）
可编辑ppt
8
• 若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb） 需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA 序列;若 用λ噬菌体载体可少到9×105, 而要用柯斯质粒 将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降 到3.5×105左右,均可满足建库要求。
•
酵母人工染色体
• ①基因组DNA +粘性质粒——重组DNA— —转化细菌 菌落
• ②基因组DNA + λ噬菌体 ——重组DNA— 包装成噬菌体——感染细菌 噬菌斑
• 1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆 群体就包含基因组的全部基因片段总和。
可编辑ppt7基因组大小的计算1975年L.Clar载量
转染率
λ噬菌体 粘性质粒 (Cosmid) 酵母人工染色体
(YAC)
9～22kb 30～45kb 100～1000kb
可编辑ppt
105～106转化子／μgDNA 104～106转化子／μgDNA
～500转化子／μgDNA
9
可编辑p裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端, 因此插入
载体之前还需要进行修饰加工，少用
②限制性内切酶降解（鸟枪法）
过去用EcoRⅠ,现在用Sau3A
断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与 处理过的载体连接。
可编辑ppt
6
• ⑶ DNA片断与载体的连接包装
• 常用载体：粘性质粒 λ噬菌体
4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白 5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA不同 6. 不能研究基因组的结构功能
可编：mRNA约占总RNA的1－5％，所以应选 用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材 料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛β细胞 为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原 或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料
可编辑ppt
2
一、化学合成法 自动化 DNA合成仪
• 1.要求：1）已知目的基因的核苷酸序列或其对 应的多肽链氨基酸序列
•
2）较短的DNA片段，有专一性和定
向性
• 2.原理：第一个核苷酸固定于不溶性的固相载
体上, 然后按预定顺序从该核苷酸开始，以3’、
5’-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应
（封闭非反应基团 ），其后用洗涤法除去多余
的反应物和副产物, 再用同样的步骤与下一个
核苷酸进行缩合反应, 如此循环将合成的寡核
苷酸链从载体上洗脱下来, 解除保护基, 进一步
纯化。
可编辑ppt
3
• 应用范围：1）合成PCR引物
•
2）寡核苷酸探针
•
3）人工接头及较小的基因
可编辑ppNA成分, 通常是分离供体细胞中的染色体DNA，酶 切后，将这些染色体DNA片段与某种载体 相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真 核细胞染色体DNA片断的克隆株, 这种克 隆株群体。
可编辑ppt
16
• ⑵ 免疫结合法
• 噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA 表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢 固地结合在膜上。然后将膜放入含有特 异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗 去未结合的抗体后，再与125 I 标记的第二 抗体结合, 从而找出带有放射性示踪信号 的斑点, 进而找出对应噬菌斑, 克隆扩增, 提取DN编辑ppt
11
特点：
1. cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操 作更为方便。
2. mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特 定功能基因工作量较小。
3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利 于获得较多的模板。（转录特征）
In（1－P）
N = ———————
In （1－f）P为在基因组目的基因出现的几率（一般为99％）；f为 插入的限制片断长度／整个基因组DNA总长度。
例如：从人为99％，那么这个基因组文 库要多大？
In（1－0.99）
1.特点：提供全套遗传信息, 即完整的基因组 DNA,可以研究基因组中5’端控制基因转录 的调控序列, 内含子的分布和作用, 以及重 复序列的数量分布及大小
可编化基因组DNA, 提取哺乳动物细胞染色体DNA ⑵制备全部基因组的DNA片断 ①机械断裂 法