生化技术实验指导书(20学时)
(第五册)生化室作业指导书
ISO15189质量管理体系范本文件（第五册）生化室作业指导书文件编号：PYK-3-SH-01~61第I版编制：郭莎莎审核：郭莎莎批准：杨到凤生效日期：2016年6月1日濮阳市第二人民医院检验科目录修订页血清总胆红素(T-BIL)测定1. 实验原理血清中的胆红素分为直接（结合）胆红素和间接（未结合）胆红素。
大多数方法是在1883年Ehrlich提出的重氮法胆红素测量法1，一些改良的方法已被用来增进反应。
这些改良的方法是使直接胆红素直接和重氮化合物进行反应，生成一种有颜色的化合物，而间接胆红素需要一种溶剂，如表面活性剂后才能进行反应。
申能总胆红素试剂是改良的重氮法。
使用一种稳定的重氮盐，2,4-二氯苯胺重氮盐（DCA），与胆红素反应，形成红色偶氮化合物，它在540nm吸光度最大。
在540/600nm时的吸光度与标本中总胆红素的浓度成正比。
胆红素+DCA 红色偶氮化合物表面活性剂2. 标本：2.1 病人准备：无特殊要求。
最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。
2.2 类型：血清、肝素或EDTA血浆，应避光保存。
3. 标本存放：15～25℃保存可稳定2天；2～8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月，如冰冻保存，不可反复冻融！。
4. 标本运输：常温条件下避光保存运输。
5. 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染、脂血、非避光保存运输的标本。
6. 实验材料6.1 试剂：申能总胆红素试剂盒（141 0817170 1 试剂1＋试剂2）6.1.1 试剂组成试剂1：6×64 ml磷酸缓冲液40mmol/L氯化钠9g/L表面活性剂,稳定剂适量试剂2：6×16 ml2,4-二氯苯胺重氮盐1mmol/L盐酸30mmol/L表面活性剂适量6.1.2 试剂准备：试剂为即用式。
6.1.3 试剂稳定性与贮存试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂有效期为18个月。
试剂2必需避光保存。
试剂不可冰冻。
生化实验指南解读
生物化学检验技术课程学习指南（适用于医学检验专业专科使用）生物化学及检验教研室编一、课程简介《生物化学检验》(临床生物化学检验、临床生化检验、生化检验、生化检验学、临床生物化学和生物化学检验、临床生物化学及生物化学检验、临床生物化学、临床化学等)是对人体健康和患病时化学状态的研究以及用于诊断、治疗和预防疾病的化学试验方法的应用。
它的主要任务是研究人体器官、组织、体液的化学组成和进行着的生化过程，以及疾病、药物对这些过程的影响，为疾病诊断、病情监测、药物疗效、预后判断和疾病预防等各个方面提供信息和理论依据。
因此，《生物化学检验》既是一门研究人体健康和疾病时生理生化过程的医学基础理论学科，又是一门应用各种技术和方法分析机体健康和疾病时体液或组织样品中各种化学成分的医学应用技术学科，它在医学理论和医学实践中均具有相当重要的地位，是高等医学检验专业的一门主干学科和必修课程。
（一）课程目标通过本课程的学习，要求学生掌握生物化学检验的基础理论、基本知识和基本技能，能够从事检验医学的生化实验诊断操作、评价和应用，培养成为医学检验技术专业高级专门人才。
具体归纳为：1、掌握生物化学检验的基本理论、基本知识；2、具有娴熟的生物化学检验的操作技能；3、能够从事医学检验的生物化学实验诊断操作、评价和应用，具有独立的工作能力和解决实际问题的能力及创新意识；4、树立和培养学生良好的职业道德和从业素质。
根据《生物化学检验》课程在检验医学中的作用和地位，为便于学生对《生物化学检验》课程的学习，该该课程分为三个不同程度的要求：“掌握、熟悉和了解”。
“掌握”的内容，在授课时需要重点讲解，要求学生能全面理解，必须牢记并能融会贯通；“熟悉”的内容，要求学生能理解和记住概念与特点；“了解”的内容只扼要介绍有关知识概念或通过学生自学来认识和理解，有些则属于学科进展以及扩展知识面的内容。
在考试内容中，掌握的部分约占60％～70％，熟悉的部分约占20％～30％，了解的部分约占10％。
生化实验报告操作流程
一、实验目的1. 学习并掌握酶活性测定的基本原理和方法。
2. 掌握使用紫外分光光度计测定酶活性的技术。
3. 了解酶活性受底物浓度、pH值、温度等因素的影响。
二、实验原理酶活性是指酶催化一定化学反应的能力。
在一定条件下，酶催化反应的速率与酶的浓度成正比。
本实验通过测定在一定时间内酶催化底物反应产生的产物浓度，来计算酶的活性。
三、实验材料1. 酶制剂2. 底物溶液3. 紫外分光光度计4. pH计5. 恒温水浴6. 移液器7. 试管8. 离心机9. 试剂：缓冲液、标准品等四、实验步骤1. 准备实验器材和试剂：将酶制剂、底物溶液、缓冲液等试剂准备好，确保所有试剂均在有效期内。
2. 设置实验组：- 在试管中加入一定量的酶制剂和底物溶液。
- 调整pH值至适宜范围。
- 将试管放入恒温水浴中，设定反应温度。
3. 测定酶活性：- 使用移液器准确量取一定体积的底物溶液和酶制剂。
- 将试管放入紫外分光光度计中，设定波长和灵敏度。
- 记录反应前后的吸光度值。
- 重复上述步骤，设置不同底物浓度、pH值、温度等条件，进行对比实验。
4. 数据处理：- 根据吸光度值和标准曲线，计算产物浓度。
- 根据反应时间和产物浓度，计算酶活性。
- 分析不同条件对酶活性的影响。
5. 结果分析：- 对实验数据进行统计分析，得出结论。
- 对实验过程中出现的问题进行分析，提出改进措施。
五、注意事项1. 实验过程中应严格遵守操作规程，确保实验安全。
2. 使用移液器时，注意准确量取试剂，避免误差。
3. 调整pH值时，应使用精确的pH计，确保pH值稳定。
4. 实验过程中应保持实验环境清洁，避免污染。
5. 仔细观察实验现象，及时调整实验条件。
六、实验结果与分析（此处根据实际实验数据填写）七、结论（此处根据实验结果填写）八、讨论（此处对实验过程中出现的问题进行分析，并提出改进措施）九、参考文献（此处列出实验过程中参考的文献）十、附录（此处可附上实验数据表格、图片等）注意：以上实验报告仅为示例，具体实验步骤和结果分析需根据实际实验情况进行调整。
生物实验操作作业指导书
生物实验操作作业指导书一、实验目的本实验旨在让学生通过实际操作掌握生物实验的基本操作方法，并提高对生物实验安全性和实验数据处理的认识。
二、实验材料和设备1. 实验材料:- 试剂：X溶液、Y溶液、Z溶液等（根据具体实验需求）- 培养基：A培养基、B培养基等（根据具体实验需求）- 实验动物/植物样本等（根据具体实验需求）- 实验器材：试管、培养皿、移液管、显微镜等2. 实验设备：- 离心机- 恒温培养箱- pH计- 显微镜三、实验前准备1. 仔细阅读实验原理和实验步骤，了解实验目的和要求。
2. 检查实验设备是否齐全，确保实验器材的完好和洁净。
3. 准备所需的试剂和培养基，确保其质量和浓度符合实验要求。
4. 检查实验动物/植物样本，确保其健康并符合实验要求。
四、实验步骤1. 实验准备：a) 将所需试剂和培养基按照实验要求配制好。
b) 调节pH值：使用pH计将培养基的pH值调节至所需范围内。
c) 温度控制：将培养基置于恒温培养箱中，使其温度达到实验要求。
d) 样本处理：根据实验要求，对实验样本进行必要的处理，如清洗、消毒等。
2. 实验操作：a) 实验操作步骤一：详细描述实验操作步骤，确保操作的准确性和安全性。
b) 实验操作步骤二：详细描述实验操作步骤，确保操作的准确性和安全性。
c) 实验操作步骤三：详细描述实验操作步骤，确保操作的准确性和安全性。
d) 实验操作步骤四：详细描述实验操作步骤，确保操作的准确性和安全性。
3. 实验记录：a) 记录实验操作过程中的关键数据，包括观察结果、实验条件、实验时间等。
b) 结果分析：根据实验数据，进行结果分析和解释。
五、实验安全注意事项1. 实验操作过程中，需佩戴实验手套、实验眼镜和口罩，确保个人安全。
2. 使用有毒、腐蚀性或易燃的化学试剂时，注意采取相应的防护措施，避免危险事故发生。
3. 遵守实验室规章制度，保持实验环境整洁有序。
六、实验结果和结论根据实验记录和结果分析，得出实验结果和结论，可以对实验中出现的问题进行讨论和解释。
生物技术大实验实验指导书
《生物技术大实验》实验指导书前言《生物技术大实验》是为生物技术专业本科高年级学生开设的综合实验课程，是在普通生物学实验、生物化学实验、微生物实验、细胞生物学和遗传学实验的基础上的综合实验课程。
该实验课程偏重于分子生物学实验教学，通过此实验课程，学生不仅学习到最基本的分子生物学技术，而且学习到前沿的生物技术。
分子生物学实验技术突飞猛进，日新月异。
分子生物学技术的广泛应用，在20世纪下半叶对生命科学的进步产生了举世公认的巨大推动作用，而且对人们的生活和整个社会的发展亦产生了巨大的冲击和影响。
分子生物学技术已广泛渗透和应用到生物学、遗传学、细胞学、微生物学、进化学、肿瘤学、免疫学、药理学、发育学、病毒学、神经生物学、生药学、法医学等与基础医学和临床医学有关的研究领域。
21世纪将更是分子生物学技术快速发展的时期，由此引起的生物技术革命并将更加深刻地影响社会的发展。
学生基本技能和动手能力的培养都离不开实验室，离不开实验课上的训练，很多理论上的原理都需要到实验课上去验证，很多理论上的知识都需要到实验课上去实践。
而实验课教材或实验指导书是开好实验课的基本条件之一。
虽然目前的分子生物学实验教材版本众多，但针对本科生的生物技术大实验教材尚无出版。
为了加强本学科的教材建设，促进本学科实验课的开设，我们参考了国外最新的有关分子生物学实验技术的专著，根据我校学生的特点及我们自己现有的基础和条件，特选择了部分实验容，并结合我们的经验与体会，汇编成了生物技术大实验实验指导书，以供参考。
在使用过程中，可根据不同的层次适当增减。
同时，对于新近产生和应用前景广阔的生物芯片技术、RNAi 技术和蛋白质组研究等，限于我们目前的条件，只能作些演示或作为动态给以介绍，条件一经成熟，即行开设。
由于分子生物学技术和生物技术的快速发展，加之我们是第一次这样系统地给学生开设生物技术大试验课程，许多工作还处于不断探索的过程中，难免有不妥和疏漏之处，恳切期望读者提出宝贵意见，以利不断修正完善。
生化实验教案
生化实验全套教案第一章：引言1.1 课程背景1.1.1 生化实验是生物科学领域的重要实践活动，通过实验可以让学生更好地理解生物学的理论知识。
1.1.2 生化实验能够培养学生的实验操作能力、观察能力和分析能力，提高学生的实践技能。
1.1.3 通过本课程的学习，学生将掌握基本的生化实验原理和方法，为今后的生物学研究或工作打下坚实的基础。
第二章：知识点讲解2.1 生化实验的基本原理2.1.1 生化实验是基于生物化学反应的原理进行的，学生需要了解各种生化反应的基本原理。
2.1.2 学生需要了解生化实验中常用的仪器设备及其使用方法。
2.1.3 学生需要掌握生化实验数据处理的基本方法，如标准曲线法、酶活性计算等。
第三章：教学内容3.1 实验一：蛋白质的提取与鉴定3.1.1 实验原理：通过盐析法提取蛋白质，使用SDSPAGE电泳鉴定蛋白质。
3.1.2 实验材料：鸡蛋白、盐、SDS、PAGE胶等。
3.1.3 实验步骤：包括蛋白提取、蛋白分离、蛋白鉴定等步骤。
第四章：教学目标4.1 知识目标4.1.1 学生能够理解生化实验的基本原理和方法。
4.1.2 学生能够掌握实验操作技能，如蛋白提取、电泳等。
4.1.3 学生能够分析实验数据，得出合理的结论。
第五章：教学难点与重点5.1.1 学生需要掌握生化实验的基本原理和方法。
5.1.2 学生需要熟练操作实验仪器，掌握实验步骤。
5.1.3 学生需要学会分析实验数据，得出合理的结论。
后续章节待补充。
第六章：教具与学具准备6.1 教具准备6.1.1 生化实验室所需的仪器设备，如显微镜、离心机、PCR仪器等。
6.1.2 实验所需的化学试剂和生物材料，如蛋白酶、底物等。
6.1.3 实验讲义和相关参考书籍，供学生参考学习。
6.2 学具准备6.2.1 学生实验室所需的个人防护装备，如实验服、手套、护目镜等。
6.2.2 实验报告表格，用于记录实验数据和结果。
6.2.3 笔记本电脑或平板电脑，用于展示实验相关资料或软件操作。
生物化学与分子生物学实验指导书-方成.
实验五：血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳（验证性；4学时）【实验目的】1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。
2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作过程。
3.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点和应用范围。
【实验原理】1．聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺（Acrylamide简写为Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N，N¹-methylene-bisacrylamide，简写Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）的作用下，聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交联形成就具有三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。
为了加速聚合，在合成凝胶时还加入四甲基乙二胺作为加速剂。
聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，能起分子筛作用。
用它作电泳支持物，对样品的分离不仅取决于各组分所带电荷的多少，也与分子大小有关。
凝胶网孔的大小主要受成胶物的总浓度及Acr和Bis的比例的影响。
一般电泳采用成胶物质总浓度为7.5%，此浓度称为标准凝胶浓度。
如果改变总胶浓度，也应相应改变Acr和Bis的比例。
2．不连续聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳的原理根据凝胶各部分缓冲液的种类及pH值，孔径大小是否相同等，可分为连续系统和不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。
连续系统是指电泳槽内缓冲液的pH值与凝胶中的相同，不连续系统则不同。
不连续圆盘电泳一般是在小玻璃管内进行的。
把三种性质不完全一样的聚丙烯酰胺凝胶重叠起来。
上层为样品胶，中间为浓缩胶，这两层胶的凝胶浓度为3%是大孔胶，应用Tris-HCl 缓冲液，其pH6.7。
下层是分离胶，此层凝胶总浓度为7.5%，是小孔胶，也用Tris-HCl缓冲液，pH8.9。
上下电泳槽缓冲液是Tris-甘氨酸缓冲液，pH=8.3。
由于凝胶的孔径和缓冲液的pH值不同，产生浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，使电泳的灵敏度、分辨率提高。
（1）浓缩效应：无论哪种电泳方式，要想得到良好的分离效果，电泳开始前必须使样品中各种成分同处于同一起跑线上。
生物化学实验指导.pdf
的要求进行独立操作与观察。 3．独立操作与观察 除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实
验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。 4．示教 每次的实验都备有示教内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在
液面处，眼睛平视标线，加溶剂至液体凹与标线相切，盖瓶塞倒转，使气泡升到顶，将瓶震荡数次，再倒
置，重复操作 10 次以上，才能混合均匀。（注意：不再定容了，防止溶液漏掉）
2 液体稀释 用移液管移取一定体积的溶液于容量瓶中，再按上法进行。如果稀释时产生热量，可先
于小烧杯中加少量溶剂溶解，冷却后移到容量瓶中，再按上法进行。
用容量瓶定容后，装入试剂瓶，帖上标签。
标签应注明以下内容：药品浓度，名称，配制人和日期等。
（六）清理实验场所。
（二） 缓冲溶液的配制
1 概念
由一定物质组成的溶液，在加入一定量的酸或碱时，其氢离子浓度改变甚微或基本不变，此种溶液称
为缓冲溶液；这种作用称为缓冲作用；其溶液内所含物质称为缓冲剂，调节缓冲剂的比例可以配置成各种
【实验用品】
1．材料： 2．器材和仪器：烧杯，容量瓶，量筒，玻璃棒，试剂瓶。 3．试剂：NaH2PO4·2H2O，Na2HPO4·12H2O。
【方法步骤】
（一） 溶液的配制步骤 （一）实验准备
1 准备所需的药品和玻璃仪器。 2 洗涤。 （二）计算 1 百分比浓度计算：
（1） G/V 比 如：配 1%NaCl, 称 1 g NaCl 溶于 100 mL 水。 （2） V/V 比 如：配 75%乙醇 100 mL，乙醇 100 mL×75%=75 mL，蒸馏水 25 mL。 （3） G/G 比 用的较少，如计算灰分中某种元素如 Fe 的含量。 2 摩尔浓度的计算：(药品的分子量一般在标签中注明)
5生化室作业指导书
ISO15189质量管理体系范本文件（第五册）生化室作业指导书文件编号：ABCD-3-SF-01~61第A版编制：审核：批准：生效日期：2006年8月8日ABCD人民医院检验科目录修订页血清总胆红素(T-BIL)测定1. 实验原理血清中的胆红素分为直接（结合）胆红素和间接（未结合）胆红素。
大多数方法是在1883年Ehrlich提出的重氮法胆红素测量法1，一些改良的方法已被用来增进反应。
这些改良的方法是使直接胆红素直接和重氮化合物进行反应，生成一种有颜色的化合物，而间接胆红素需要一种溶剂，如表面活性剂后才能进行反应。
申能总胆红素试剂是改良的重氮法。
使用一种稳定的重氮盐，2,4-二氯苯胺重氮盐（DCA），与胆红素反应，形成红色偶氮化合物，它在540nm吸光度最大。
在540/600nm时的吸光度与标本中总胆红素的浓度成正比。
胆红素+DCA 红色偶氮化合物表面活性剂2. 标本：2.1 病人准备：无特殊要求。
最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。
2.2 类型：血清、肝素或EDTA血浆，应避光保存。
3. 标本存放：15～25℃保存可稳定2天；2～8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月，如冰冻保存，不可反复冻融！。
4. 标本运输：常温条件下避光保存运输。
5. 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染、脂血、非避光保存运输的标本。
6. 实验材料6.1 试剂：申能总胆红素试剂盒（141 0817170 1 试剂1＋试剂2）6.1.1 试剂组成试剂1：6×64 ml磷酸缓冲液40mmol/L氯化钠9g/L表面活性剂,稳定剂适量试剂2：6×16 ml2,4-二氯苯胺重氮盐1mmol/L盐酸30mmol/L表面活性剂适量6.1.2 试剂准备：试剂为即用式。
6.1.3 试剂稳定性与贮存试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂有效期为18个月。
试剂2必需避光保存。
试剂不可冰冻。
6.1.4 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
《生化实验技术》综合设计性大实验
加气压或水压（如上海高压匀浆泵厂生产的高压匀质机），达20.59～34.32MPa
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01
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（210～350kgf／cm2）的压力时，可使90%以上细胞被压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。
02
4.压破碎法
(三)生化及化学法
1．自溶法
即新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度，动物材料选在0～4℃，微生物材料则多在室温下进行。
在细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。操作时，将材料投入沸水中，在90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。
冷热交替法
3．超声波处理法
多用于微生物材料，处理的效果与样品浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种酶时，常用50～100mg／L菌体的浓度，在1KHz～10KHz（千赫兹）频率下处理10～15min。对于其他细菌，则视具体情况而定。操作中注意避免溶液中气泡的存在，制备对超声波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。
《生化实验技术》 综合设计性大实验
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课堂理论学习：辅导相关生化大分子提取分离纯化基本知识
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项目发布：了解项目内容
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网上预约：理论自学——设计实验方案——网上递交——教师修改及审核——实验室项目实施——论文上交——？何谓离子交换剂转型？
动植物总DNA或RNA提取的方法主要有哪些？以猪脾脏DNA提取为例试述每步骤主要原理是什么？如何判断所提取DNA的纯度？
蛋白质浓度测定方法有哪些？如何鉴定所提取蛋白的纯度？未知蛋白质分子量测定方法有哪些？
07级生物技术实验安排
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生化技术实验指导书湖北工业大学生物工程学院二0一0年三月修订实验一酵母RNA的提取及其组分的鉴定一、实验目的1.了解稀碱法提取RNA及提取物组分鉴定的基本原理；2. 掌握稀碱法提取RNA及提取物组分鉴定的具体操作方法。
二、实验原理酵母中RNA的含量比较丰富（2.67%~10%），而DNA的含量相对地较少（据资料报道，酵母DNA的含量低于RNA的20%），因此从酵母中提取RNA比较方便。
RNA溶于碱性溶液，碱性溶液使蛋白质带负电荷，促进RNA(带负电荷)与蛋白质的分离，碱性溶液可使酵母细胞壁变性，同时进行加热，可增加细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。
因此，酵母粉用稀碱液加热抽提时，可将其中的RNA抽提出来。
当碱性抽提液中和后，加入2倍体积的95%乙醇时，可以使抽提物沉淀出来。
抽提物的主要成分是RNA的钠盐，并带有少量的蛋白质。
用碱抽提时，RNA会有不同程度的降解。
地衣酚（3，5-二羟基甲苯）是比较灵敏的测定戊糖的试剂，常用于测定RNA。
核糖与地衣酚试剂反应呈现鲜绿色。
地衣酚试剂反应灵敏，也易被其他物质干扰。
DNA中的脱氧核糖也可与地衣酚反应，因此，单靠地衣酚显色实验不能作为RNA 与DNA鉴别依据。
二苯胺试剂是常用于测定DNA中脱氧核糖的试剂，脱氧核糖与二苯胺试剂反应产生蓝色物质，而RNA中的核糖一般不与苯胺起反应。
嘌呤碱可与硝酸银反应生成白色的嘌呤银化合物的沉淀。
双缩脲反应是检验蛋白质常用的颜色反应。
双缩脲或含有两个以上肽键的化合物（蛋白质、肽等）在碱性条件下与硫酸铜反应生成紫红色的配合物。
如果蛋白质含量很低时，此颜色反应不易观察到。
三、试剂与器材1. 试剂：（1）酵母粉（药用）；（2）0.5%NaOH溶液；（3）乙酸；（4）10%硫酸溶液；（5）氨水；（6）5%硝酸银溶液；（7）95%乙醇；（8）地衣酚试剂（硫酸铁铵1.35g，地衣酚2g，用蒸馏水配成50mL作为母液，保存于冰箱中。
使用前，取母液2.5mL，加浓盐酸41.5mL再加蒸馏水60mL）；（9）二苯胺试剂（1.5g二苯胺溶于100mL高纯度的冰醋酸中，再加1.5mL浓硫酸）；（10）10%氢氧化钠溶液；（11）1%硫酸铜溶液。
2. 器材：（1）离心机3000转/分以上（2）100mL离心管4支（3）100mL烧杯1支（4）试管5支（5）50mL量筒1只（6）水浴锅1只（7）电炉1台（8）台式天平1架四、实验操作1．提取取酵母粉4g，放入100mL烧杯中，加0.5%氢氧化钠溶液30mL，将烧杯置沸水浴上加热半小时，并不时搅拌。
加热完毕，加入乙酸约4~5滴使溶液呈微酸性（pH6），然后倒入离心管中离心15分钟（3000转/分）。
取上清液于100mL的烧杯中，加入2倍体积的95%的乙醇，边加边搅拌，最后静置待其沉淀完全。
进行过滤，滤渣先用15mL95%乙醇分2次洗涤。
继用15mL无水乙醇分2次洗涤，洗涤时可用玻璃棒轻轻地把滤渣搅动，以免下层滤渣洗涤不到，待乙醇滤干后完成成分的鉴定。
2. 组成成分的鉴定（1）将上述提取到的沉淀物刮到100mL烧杯中后，溶于10mL 10% 的硫酸溶液中，直接在电炉上加热，煮沸1~2分钟进行水解；（2）取水解液0.5mL，加入地衣酚试剂1mL，直接加热，煮沸1分钟，观察颜色变化；（3）取2mL 水解液，加入氨水2mL及5%硝酸银1mL，摇匀后观察是否产生絮状的沉淀物（如不出现，放置10min再观察）；（4）取1mL 水解液，加10% NaOH 10滴，摇匀后再加1%硫酸铜溶液2滴，静置一会儿观察有无紫玫瑰色出现；（5）取1mL 水解液加2mL二苯胺试剂，摇匀后，沸水浴中加热10分钟，观察颜色变化；试从上述（2）~（5）四个反应的情况，说明从酵母中提出的物质是不是RNA。
五. 注意事项1. 乙醇试剂易燃，应远离火源；2. 用烧杯加热反应时，防止溶液外溅伤人；3. 离心时一定要将离心管和内容物在天平上称平衡后再对称放入离心机中离心，否则会损坏离心机并发生事故；4. 过滤前滤纸用乙醇湿润，不能用水湿润，因为RNA溶于水；5. 滤下来的乙醇应回收使用。
六、思考题1.本实验是根据RNA的哪些性质设计的？其设计思想如何？2.在提取RNA过程中所用试剂及加热的作用是什么？3.在进行组分鉴定前为什么RNA溶于10%的硫酸中进行水解？4.稀碱法提取RNA为什么先不破壁？5.提取RNA有哪些方法？如果提取具有活性的RNA最好采用哪一种方法？还应注意些什么？6.提取DNA又有哪些方法？如果提取具有活性的DNA最好采用哪种方法？7.试分析RNA水解液进行组分鉴定的现象并解释其现象产生的原因。
8.试分析本实验操作关键和注意事项，为什么？实验二地衣酚显色法测定RNA含量一、实验目的学习和掌握测定RNA含量的方法—地衣酚显色法的原理和操作方法。
二、实验原理在三氯化铁及盐酸存在下，RNA与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应，生成绿色复合物，其吸收高峰在670nm处。
当核糖核酸浓度在10~100ug/mL范围内，吸光度与其浓度呈线性关系。
三、试剂与材料（1）标准RNA母液：准确称取RNA10.0mg，用少量蒸馏水溶解（如不溶，可滴加浓氨水，调pH7.0），定容至10.0mL，此溶液每ml含RNA1mg。
（2）标准RNA溶液：取母液1.0mL，置10mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。
此溶液为100ugRNA/mL。
（3）样品溶液：将一定量的RNA粗品（用上次实验所提取的RNA代替）用蒸馏水溶解到一定浓度。
（4）地衣酚—三氯化铁试剂：将100mg地衣酚溶于100mL浓盐酸中，再加入100mgFeCl3.H2O（催化剂），临用时配置。
此配法与我们以前用稀碱法提取RNA的地衣酚（苔黑酚）试剂不同。
四、实验操作1. 标准曲线的制作分别吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL RNA标准溶液，用蒸馏水补充至2.0mL，各加入2.0mL地衣酚试剂，混匀，于沸水浴中加热45min。
自来水冷却后，测定OD670。
以RNA的量为横坐标，OD670为纵坐标，绘制标准曲线或求出回归方程。
2. 样品的测定取样品溶液2.0mL ，加入地衣酚试剂2.0mL ，如前述方法测定OD 670，从标准曲线查出或用回归方程计算RNA 含量。
五、注意事项1. 要注意RNA 标准试剂的配制。
2. 标准曲线的制作仔细准确。
六、思考题1. 凡戊糖均可与地衣酚反应，因此测定RNA 时，如何减小DNA 等杂质的影响？2. 如何保证标准曲线的准确性？如何判断标准曲线的准确性？3. 地衣酚反应中，干扰RNA 测定的因素有哪些？如何能减少它们的影响？4. 什么是分光光度检测？根据吸收光谱的不同，分光光度检测可分为哪几种？本实验是属于哪种分光光度检测？5. 用上次实验提取的RNA 配制样品溶液时，要注意什么？6. 分光光度检测的原理是什么？它有哪些优点？mL 2.0RNA ug/mL RNA 微克数样品中测得的）浓度（样品液中=%100m L ug/m L RNA %RNA ⨯⨯=样品的微克数）样品液体积（）的浓度（样品液中）含量（样品中实验三 氨基酸的纸层析一、实验目的1. 学习分配层析的原理和方法。
2. 掌握氨基酸纸上层析法的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色、鉴定）。
二、实验原理层析法又称色层分离法、色谱法。
是一种分离分析多组分混合物质的极有效的物理及物理化学分析方法。
色谱法是目前各种化学分离法中最重要的一种方法。
由于其分离效能高、分离速度快，试样用量少等特点，已经成为在与化学有关的一切领域中广泛应用的一种分离技术。
纸层析是以滤纸为载体（惰性支持物）的分配层析。
什么是分配呢？一般把物质在两种互不相溶的溶剂之间的溶解过程称为分配。
达到平衡时，溶质在两种溶剂中的浓度之比称为分配系数，又称平衡常数。
通常用K 表示，即：滤纸纤维与水有较强的亲和力，滤纸纤维能吸附25-29%的水分，其中6-7%的水以氢键与纤维素的羟基结合，在通常条件下较稳定，不易除去。
这种水分组成为固定相。
而有机溶剂与滤纸的亲和力甚弱，因而有机溶剂为流动相（在纤维间空隙中流动），它沿着滤纸移动。
溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动，称下行法。
将样品点在滤纸上（此点称为原点），然后进行展层。
样品中的各种溶质（如各种氨基酸）即在两相溶剂中不断进行分配。
由于分配系数不同，不同溶质随流动相溶质在流动相中的浓度溶质在固定相中的浓度）分配系数（K移动的速率不等，于是将这些溶质分离开来，形成距原点不等的层析点。
溶质在滤纸上移动的速率可用R f 值表示：只要条件（如温度、展层溶剂的组成、滤纸的质量等）不变，R f 值是常数。
故可根据R f 值作定性分析。
三、试剂与器材1. 试剂（1）酸性展开剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。
将20毫升正丁醇和5毫升醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分震荡，静止后分层，放出下层水层。
取扩展剂倒入培养皿中备用。
（2）显色剂：0.1%茚三酮显色液。
称取0.1g 茚三酮，溶于100mL 正丁醇中（用前配）。
（3）未知氨基酸溶液（4）标准氨基酸溶液。
2. 器材（1）毛细管； （2）层析缸；（3）新华滤纸一号（如果滤纸不干净，可用0.4mol/LHCL 浸包20小时或过夜后，用蒸馏水洗至中性，再用95%乙醇冲洗，晾干后用）；（4）喷雾器； （5）培养皿；（6）分液漏斗； （7）电吹风；（8）针线。
溶剂前沿到原点的距离离层析点中心到原点的距 f R四、操作1. 层析滤纸的准备在19cm×23cm的滤纸上一端距边缘3cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上每间隔3cm做一记号。
2. 点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这四个位置上；每点完一次后，吹干再点第二次。
点的直径应小于0.5cm，每点共点三到四次。
3. 平衡与展开将滤纸缝成圆筒形（注意纸的二边不相碰），挂在层析缸盖内的钩上，盖好盖子饱和0.5h。
然后将滤纸筒放入盛有展开剂的培养皿中（点样的一端在下，展开剂的液面需低于点样线1cm），待溶剂前沿上升到离顶端1cm时取出，吹干至无正丁醇气味为止,用铅笔画出溶剂前沿界线。
4. 显色用0.1%茚三酮溶液均匀喷雾显色，65℃烘干或吹干即可显出各种氨基酸的层析斑点。
五、定性鉴定计算各种氨基酸的R f值，与各种氨基酸的标准R f值（见主要参考书[1]的p49表2-4）进行对照，鉴定是什么氨基酸。
六、注意事项1. 滤纸要保持清洁，操作时勿用手接触，载手套或只拿边角。
2.点样斑点要尽量小，最大不超过0.5cm的直径，每次点样后用冷风吹干再点第二次。
3. 展开时点样点不要浸入有机溶剂中，至少要平衡半小时或1~2小时。
4. 显色时喷雾要均匀小点，不均匀会将斑点（溶质）冲下来。