第10章 色谱分离

第八章 色谱分离
chromatographic separation
第一节 色谱法概述
generalization of chromatograph separation
一、 色谱法的概述、分类和作用
1.概述
混合物最有效的分离、分析方法。 俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置： 色谱原型装置，如图。 色谱法是一种分离技术， 试样混合物的分离过程也就是试样中各组 分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的 分配过程。 其中的一相固定不动，称为固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流 体（气体或液体），称为流动相。
8.2.3 色谱柱的效能－塔板理论
在50年代，色谱技术发展的初期，
Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，
并把分馏中的半经验理论－塔板理论用
于色谱分析法。
8.2.3 色谱柱的效能－塔板理论（二）
这理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有n
个塔板，在每个塔板高度间隔内，试样各组分在两相
中分配并达到平衡，最后,挥发度大的组分和挥发度小 的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后） 逸出。尽管这个理论（概念）并不完全符合色谱柱的 分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的 差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一 直沿用。
（5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相) 选择是否合适的依据．
8.2 色谱分析法理论基础
8.2.1 流出曲线及有关术语
在气相色谱分析 法中，将以组分浓 度为纵坐标， 流出 时间为横坐标，绘 得的组分及其浓度 随时间变 化的曲线 称为色谱图，也称 色谱流出曲线。下 面是单个组分的色 谱图，用以说明 色 谱分析法的相关术 语。
下对某种物质的最佳载气 流速。
8.2.5 分离效率的表示方法－分离度
一个混合物（设只有A、B两种组分）经色谱分离后， 得到的谱图可能为：
分离效率的表示方法 －分离度（分辨率）
试评价（1）（2）（3）的分离效果。
（考虑两方面因素：溶质的保留值和溶质区带的区域宽度） 色谱分离效率用参数分离度（分辨率）R来表示。
8.2.3 色谱柱的效能－塔板理论（三）
按照塔板理论，色谱柱的分离效能可以用 塔板数来表示，由塔板理论导出的理论塔板数 n 的计算公式是： n=5.54(tR/y1/2)2＝16(tR/Wb)2
注：使用该公式，分子分母应取相同单位。
8.2.3 色谱柱的效能－塔板理论（四）
由于死体积VM (或死时间tM)内并没有发生分配作用， 在考虑柱的实际分离效能时应予扣除，扣除死时间后色谱 柱效用有效塔板数n有效 和有效塔板高度H有效。
（2）用体积表示的保留值
保留体积VR：指从进样 到柱后出现待测组分浓 度极大值时所通过的载 气体积。 VR＝tR ×F0 F0 － 色谱柱出口处载气 流速 （mL/min）
死体积VM：指色谱柱内 除了填充物固定相以外的 空隙体积、色谱仪中管路 和连接头间的空间及检测 器的空间的总和。 VM＝tM×F0 调 整 保 留 体 积 V'R ： 指扣除了死体积后的保留 体积。
2.色谱法分类
(1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。 按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱； 按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱
(2)液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。
离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂
为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。
（ 1）分配系数 Kp ：定温定压下物质在固定相和流动相中的 浓度比。 KP＝[A]s / [A]m （s－固定相； m－流动相） （ 2 ）容量因子 K' ：分配系数与两相体积有关的参数，表示 溶质A在两相中的质量之比。 K'=[mA]s / [mA]m =KP×VS/Vm
分配系数Kp和体积保留值VR的关系
色谱法
当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发 生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异， 与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相 的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各 组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中 流出。 与适当的柱后检测方 法结合，实现混合物中各 组分的分离与检测。 两相及两相的相对运 动构成了色谱法的基础
Y1 / 2 2 2ln 2 2.354
注意：由于半峰宽容易测量， 使用方便，所以一般用它来表 示区域宽度。
区域宽度（三）
（3）峰基宽度Wb：即通 过流出曲线的拐点所作的 切线在基线的截距，如图
I J所示。
Wb与σ的关系： Wb ＝4σ
8.2.2 色谱法中的主要参数和关系式
分配系数Kp和容量因子K '
t R 2 t R 2 n有效＝5.54 ( ) 16( ) Wb Y1 / 2
H有效＝L / n有效 由于同一色谱柱对不同物质的柱效能不同，故用H、 n、H有效、n有效等指标表示柱效能时应注明被测物质和色 谱条件。
8.2.3 色谱柱的效能－塔板理论（五）
n有效也可以用下式表达：
r 21 2 n有效＝ 16 R ( ) r 21 1
基线和保留值
1. 基线：图中的O t 表示只有载气通过 检测器时响应信号 的记录。在条件稳 定时为一直线。 2. 保留值：表示试 样中各组分在色谱 柱内停留的时间数 值。通常用时间或 相应的载气体积来 表示。
（1）用时间表示的保留值
保留时间 tR：指 待测组分从进样到 柱后出现浓度最大 值时所需的时间, 如 图中的O' B。
（3）分离比a
色谱分析法中A、B两种物质的分离效率可 用分离比表示。当两相体积一定时，分离比与保 留值的关系为： a＝Kp(B)/Kp(A)＝K'(B)/K'(A)＝t'R(B)/ t'R(A)＝γB，A 在色谱法中，分离比等于被分离两种物质 的调整保留值之比。 t'R(B)/ t'R(A)＝γB，A也称相对保留值。
8.2.5 分离效率的表示方法－分离度（一）
色谱分离效率用分离度（分辨率）R来表示：
tR ( B ) tR ( A) 2(tR ( B ) tR ( A)) R 或R 1 / 2(Wb ( A) Wb ( B )) 1.699(Y 1 / 2( A) Y 1 / 2( B ))
• 有效塔板数（高度）：扣除了死体积或死时间 后的塔板数（高度）。色谱柱内的死体积或相 应的死时间实际上并没有参与分配作用。
8.2.4 影响色谱柱效能的因素 ——速率理论（一）
前面已知，用塔板理论来说明色谱柱内各组
分的分离过程并不合理，因为色谱柱内并没有塔
板。当同一试样进入同一色谱柱，当流动相速度
死时间tM：指不 与固定相作用的气 体（如空气、甲烷 等）的保留时间， 如图中O'A'所示。
（1）用时间表示的保留值（二）_
调整保留时间 t ‘R：指扣除了死时间 的保留时间，如图中 的A'B。 即：t'R = tR－ tM 注意：当固定相一 定，在确定的实验条 件下，任何物质都有 一定的保留时间，它 是色谱分析法的基本 参数。
扩散的严重与否，关键是取决于流动相的线速
度。
8.2.4 影响色谱柱效能的因素 ——速率理论（五）
C － 固定相传质阻力项
(非平衡状态作用) 此两项对色谱峰的影响均与流速成正比。在流速很 高的情况下，由于没有足够的时间建立平衡，偏离更为 严重。 对于一定的色谱体系，速率方程中A、B、C、D其 值为一定。速率方程描述了流动相的平均线速度对柱 效能的影响。
气液(液液)两相间的反复多次分配过程。
从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：
（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组 份 的最少个数． （2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性 分析． （4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱 分离效能的依据．
(3) 根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析．
H A B/ U CU DU
该式称为速率方程（范氏方程）。
下面我们将对公式中的各项进行讨论
8.2.4 影响色谱柱效能的因素 ——速率理论（三）
H A B/ U CU DU（范氏方程）。
式中 ；ū － 流动相的平均线速度
A —— 涡流扩散项, 反映溶质分子受固定相颗 粒障碍改变移动方向，形成涡流引起扩散。与填 充颗粒的大小及填充的均匀性有关，而与流动相 的流速无关。A越大，色谱峰变宽更严重。
（1）标准偏差σ： σ＝1/2EF＝1/4IJ（1/4Wb） 即0.607倍峰高处色谱峰宽 度的一半。
峰高 h 是色谱峰顶到基线 的距离。h、σ是描述色谱 流出曲线形态的两个重要 参数 。 h 、与σ的关系如何？
区域宽度（二）
（ 2 ）半峰宽 Y1/2: 峰高一半 处 色 谱峰的 宽 度。如图中 的GH。 半峰宽与标准偏差的关系为：
VR = VM + KpVs 即：VR = VM（1+ K'） 或：K'＝（VR－VM）/ VM 当流动相流速一定时有： K'＝（tR－tM）/tM ＝ t'R/tM 从上两式可以看到，色谱分析法中各组分保留值 随K' 而变化，而tM 、tR都可以从色谱图上测得，从而 可以求出K'。容量因子K'是描述溶质保留行为的一个 重要参数。
8.2.4 影响色谱柱效能的因素 ——速率理论（四）
H A B/ U CU DU速率方程（范氏方程） B/ U：分子扩散项
由于溶质区带前后存在着浓度差，因而产生纵
向扩散使区带（色谱峰）扩宽。由于分子在液体 中的扩散速率大约是在气体中的 1/105，所以该项 对液相色谱来说很小，而对气相色谱则很重要。