第八章 液相色谱分离方法
第8章液固-液液色谱法
宋敏
中国药科大学药分教研室
（4）常用于HPLC-GC联用技术
❖由于流动相为有机溶剂，易于气化，所以目 前90%的HPLC-GC中的HPLC部分采用液－ 固吸附色谱，进行正相HPLC。
宋敏
中国药科大学药分教研室
二、液－液分配色谱法
宋敏
中国药科大学药分教研室
33
1、液-液分配色谱法的定义
液－液分 配色谱
基于样品组分在固定液和流动相之 间分配系数不同而分离的色谱法称 为液-液分配色谱法（Liquid-Liquid Chromatography，LLC）。
宋敏
中国药科大学药分教研室
❖ 流动相极性小于固定相极性的液－液色谱法称为正 相液－液色谱法，如以烷烃作为流动相，以含水硅 胶作为固定相的色谱系统。正相液－液色谱法适合 于分离极性化合物。
宋敏
中国药科大学药分教研室
氧化铝
❖ 氧化铝与硅胶相似，但对水溶液、酸性或碱性水溶 液更加不稳定，所以，极少用作键合固定相的基质。
❖ 氧化铝适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非 强离解型的化合物，尤其适合于分离芳香族化合物。
❖ 当样品为碱性化合物时，用硅胶分离会造成严重吸 附，此时可选用氧化铝进行分离，但酸性易离解的 化合物容易在氧化铝上形成死吸附。
宋敏
中国药科大学药分教研室
竞争模式
❖ 竞争模式认为在被溶剂平衡的色谱柱中，弱极性或 中等极性的溶剂分子先被吸附剂吸附，覆盖于吸附 剂表面形成单分子层，当溶质分子进入色谱体系后， 便竞争置换（或顶替）溶剂分子而形成吸附。
X. 溶质分子 Y. 溶剂分子 s. 吸附剂 m. 流动相
宋敏
中国药科大学药分教研室
双层吸附模型
❖ 双层吸附模型假定吸附剂表面先被流动相中极性较 强的组分以双层溶剂分子的形式所完全覆盖，双层 的结构及形成的程度取决于流动相中极性溶剂的浓 度，溶质通过柱子时与双层溶剂的第二层发生取代 或缔合而使溶质保留。
液相色谱的原理以及操作要点
液相色谱的原理以及操作要点液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）是一种常用的分离和分析技术，它基于不同物质在流动相中的分配行为来实现分离。
本文将介绍液相色谱的原理，同时探讨液相色谱的操作要点。
一、液相色谱的原理液相色谱的原理主要基于两个关键概念：分配系数和吸附性质。
1. 分配系数分配系数（Distribution coefficient）是指样品在固定相和流动相之间的分配比例。
它是液相色谱中物质分离的基础。
分配系数的大小决定了物质在固定相上停留的时间，从而实现了不同成分的分离。
2. 吸附性质液相色谱还涉及到物质在固定相上的吸附行为。
当样品溶液通过固定相时，固定相表面上的吸附剂与样品物质发生相互作用，使得物质被吸附，从而发生分离。
二、液相色谱的操作要点为了有效地进行液相色谱实验，以下是一些操作要点需要注意：1. 样品制备样品制备是液相色谱分析的首要步骤。
样品应准备恰当，并考虑到溶解度、稳定性以及待分析物之间的相互干扰。
此外，样品需要经过适当的前处理（如过滤、稀释等）以达到分析要求。
2. 流动相选择流动相的选择对液相色谱分离效果起到至关重要的作用。
合适的流动相应能够与待分析物有良好的相容性，并且具有适当的溶解性和流动性。
常用的流动相包括水、有机溶剂和缓冲溶液。
3. 固定相选择固定相是液相色谱中的另一个关键部分。
不同的固定相具有不同的化学性质，因此会影响到分离的选择性和效果。
根据待分析物的特性，选择合适的固定相对于分离效果至关重要。
4. 色谱柱选择色谱柱是液相色谱系统中用于分离的核心组成部分。
不同的色谱柱具有不同的长度、直径和固定相材料，这些参数会影响到分离性能和分析时间。
根据待分析物的特性和分离要求，选择合适的色谱柱尤为重要。
5. 色谱条件优化为了获得最佳的分离效果，需要进行色谱条件的优化。
例如，可以调整流速、梯度程序和柱温等参数，以达到更好的分离和峰形。
6. 数据处理和解释液相色谱实验完成后，需要对得到的色谱图进行数据处理和解释。
中药化学第八章三帖类化合物详解演示文稿
第38页，共80页。
第四节 三萜类化合物的提取与分离 一、三萜类化合物的提取 1．醇类溶剂提பைடு நூலகம்法
为提取皂苷首选方法
第39页，共80页。
glc
6-1
O glc2-1 glc
H OH
HO HH
结构特点
基本碳架与羊毛脂烷型不同的是 9位连有β-CH3，C5、C8、均连 β-H， C10连α-H。
雪胆甲素 R=Ac
glc1-6 glc O
罗汉果甜素Ⅴ
雪胆乙素 A=H
（比蔗糖甜约256倍）
（急性痢疾、肺结核、慢性气管炎）
第11页，共80页。
产生沉淀。 C. 三萜皂苷与胆甾醇产生沉淀没有甾体皂苷稳定。
第29页，共80页。
3.水解反应 (1)酸水解 三萜皂苷所连多是α-OH糖，因此要进行剧烈水解：
由于条件剧烈，因此常使苷元产生脱水，双键移位，构 型
异构酸，水环解合虽的然反易应引。起苷元结构的改变，但可使皂苷中的全部 单糖被水解，有助于了解成苷的单糖种类。
第41页，共80页。
先提总皂苷，再水解苷键，继用石油醚、苯、溶剂汽油、 CHCl3等弱极性有机溶剂提取苷元
第42页，共80页。
3．碱水提取法 提取含羧基皂苷
第43页，共80页。
二、三萜类化合物的分离 1．分段沉淀法
第44页，共80页。
2．胆甾醇沉淀法 利用三萜皂苷能与胆甾醇生成不溶性分子复合物进行分离。
三、双环三萜
OR4
28 29
27
结构特点是基本碳架 OH O O
液相色谱法
色谱法的分类
4. 利用大小不同的分子在多孔固定相中的选 择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或分 子排阻色谱法。
最近，又有一种新分离技术，利用不同组分 与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行 分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分 离。
整理课件
色谱法的分类
吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同； 分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同； 离子交换色谱：不同组份在固定相（离子交换剂）上的 亲和力不同； 凝胶色谱（尺寸排阻色谱）:不同尺寸分子在固定相上 的渗透作用。
需 需
R≤ 1
整理课件
第二节 柱色谱法
一、液－固吸附柱色谱法 二、液－液分配柱色谱法 三、离子交换柱色谱法 四、凝胶柱色谱法 五、柱色谱法的应用
整理课件
第二节 柱色谱法
将固定相均匀填在金属或玻璃制成的管中做 成层析柱，并以此进行分离的方法叫柱色谱法。 根据作用原理，可分为： 吸附柱色谱法 分配柱色谱法 离子交换柱色谱法 凝胶柱色谱法
对吸附剂的要求： 1. 具有较大的表面积与适宜的活性。 2. 与流动相极其样品中各组分不发生化学反
应，在流动相中不溶解。 3. 吸附剂颗粒应有一定的细度，并且颗粒要
均匀。
整理课件
第二节 柱色谱法
常用的吸附剂有： 氧化铝、硅胶、聚酰胺
硅胶： 呈微酸性 适用于分离酸性和中性物质，如：有机酸、
氨基酸、萜类、甾类等的分离。
流动相) 中分布的差异，使固定相对各组分的保 留作用不同产生差速迁移而得到分离的一种物理 化学分离分析方法。
整理课件
色谱法基本原理
分配系数与保留行为的关系
溶质在色谱柱中被保留的程度常用保留比 （retention ratio）R 表示。
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
中药化学 第八章 三萜类化合物
25 26 23
27
19 18
30 5
28 29
羊毛脂甾烷型
28 29
达玛烷型
H H H
大戟烷型
HO H
大戟醇
HOOC OH
H3COCO
H
茯苓酸
30 29
30 20 21
H
13
17 22
1 25
26 14
2
10
34 5
27 7
6
23 24
28
1 25
26
3
H
27
HO
H
23 24
29
29
30
20
【分离方法】
⑵胆甾醇沉淀法
利用胆甾醇能和皂苷生成复合物的性质， 但三萜皂苷与胆甾醇形成的复合物没有甾 体皂苷与胆甾醇形成的复合物稳定。先将 皂苷和胆甾醇充分反应，然后用水、醇、 乙醚顺次洗涤沉淀，以除去糖类、色素、 油脂和游离的胆甾醇，再将沉淀干燥，乙 醚回流，提去胆甾醇，剩下为较纯皂苷。
思考题
何谓皂苷，其主要分类依据有哪些？
何谓溶血及溶血指数，其意义何在？
皂苷溶血的机理为何，如何用化学方法解除其 溶血作用。
解释大孔树脂法用于皂苷纯化的特点及工艺流 程。
解释分段沉淀法用于皂苷分离纯化的原理及工 艺流程。
解释正丁醇提取法用于皂苷提取的原理及流程。
【分离方法】
（3）高效液相色谱法 目前最常用， 一般选用反相柱，流动相为甲醇-水， 乙腈-水。
（4）凝胶色谱法 应用较多的是能 在有机相使用的Sephadex LH-20。
第五节 三萜类化合物检识
【理化检识】
1.泡沫试验 中药水提取液振摇后，产生 持久泡沫（15分钟以上），注意假阳性反 应。
五、液相色谱分离法
五、液相色谱分离法（一）色谱法分离原理色谱法（Chromatography）又称层析法，是一种高效分离方法，它利用物质在两相中的分配系数（由物理化学性质：溶解度、蒸汽压、吸附能力、离子交换能力、亲和能力及分子大小等决定）的微小差异进行分离。
当互不相溶的两相做相对运动时，被测物质在两相之间进行连续多次分配，这样原来微小的分配差异被不断放大，从而使各组分得到分离。
本节主要介绍经典的液相色谱法，包括柱色谱、纸色谱和薄层色谱。
1、固定相和流动相色谱分离体系有两个相构成，固定的一相称为固定相（stationary phase），移动的一相称为流动相（mobile phase）。
固定相，在经典柱色谱中也称为柱填料。
通常是一些具有特定的分离性质，具有一定粒度和刚性的颗粒均匀的多孔物质，如吸附剂、离子交换剂、反相填料等。
流动相有气体和液体两种。
在经典柱色谱中流动相也称为洗脱剂，液相色谱的流动相通常由混合溶剂以及一些添加剂（如无机盐、酸等）组成。
流动相对样品组分要有一定的溶解度；粘度小，易流动；纯度要高。
色谱分离应根据被分离物质的结构和性质，选择合适的固定相和流动相，使分配系数K值适当，以实现定量分离的目的。
因此，固定相和流动相的选择是色谱分离的关键。
2、色谱分配系数在色谱分离时，溶质随着流动相向前迁移，在这个过程中，它既能进入固定相，又能进入流动相，即在两相之间进行分配。
分配系数定义为对于确定的色谱体系，K值在低浓度和一定温度下是个常数，它的大小取决于的溶质的溶解、吸附、离子交换等性质。
在色谱分离过程中，K值大的溶质，在固定相的停留时间长，移动速度慢。
两个化合物之间的K值相差越大，越容易分离。
（二）柱色谱柱色谱（Column Chromatography）是最常见的色谱分离形式，它具有高效、简便和分离容量较大等特点，常用于复杂样品分离和精制化合物的纯化。
柱色谱主要有吸附色谱和分配色谱两类。
前者常用氧化铝或硅胶为柱填料。
现代色谱分析试题
现代⾊谱分析试题第⼀章⾊谱法概论1. 综述各种⾊谱法的特点及其应⽤。
2. 简要说明⽓相⾊谱法（GLC、GSC）、⾼效液相⾊谱法（HPLC的各类⽅法）特点及其应⽤范围？3. 试⽐较⾊谱法（GC、HPLC）之间的异同？第⼆章⾊谱基本理论例1 采⽤3M⾊谱柱对A、B⼆组分进⾏分离，此时测得⾮滞留组分的t M值为0.9min ，A组分的保留时间（t R(A)）为15.1min，B组分的t R为18.0min，要使⼆组分达到基线分离（R=1.5），问最短柱长应选择多少⽶（设B组分的峰宽为1.1 min）？解⽅法（1）：由已知条件，得n B=16(18.0/1.1)2=4284r i,B=18.0-0.9/15.1-0.9=1.20K/B=18.0-0.9/0.9=19则因为所以故⽅法（2）：同⽅法（1）得n B=4284；r i,B=1.20；K/B=19所以则n B (R=1.5)=16 (1.5)2(1.2/0.2)2[(1+19)/19]2=1425故L=n (R=1.5)H=14250.07=99.8cm1m1.A、B ⼆组分的分配系数之⽐为0.912，要保证⼆者的分离度达到1.20，柱长因应选择多少⽶？设有效塔板⾼度为0.95mm.。
2.有⼀液相⾊谱柱长25cm,流动相速度为0.5ml/min，流动相体积为0.45ml，固定相体积为0.25ml,现测得萘、蒽、菲、芘四组分（以A、B、C、D）的保留值及峰宽如表3-1。
根据已知条件试计算出：（1）各组分容量及分配系数；（2）各组分的n及n eff；（3）各组分的H 值及H eff值；（4）画出四组分的K/值之间的关系曲线表3-1 在HPLC柱上测得的A、B、C、D 的组分t R(min) W h/2(min)⾮滞留组分ABCD 4.06.513.514.620.10.420.971.101.38答：（1）K/（A=0.60；B=2.38；C=2.65；D=4.03）；（2）（A=4021；B=3099；C=2818；D=3394）n eff（A=595；B=1535；C=1486；D=2178）;（3）H（A=0.06；B=0.08；C=0.09；D=0.07）H eff（A=0.42；B=0.16；C=0.17；D=0.11）;(5)根据已有数据，绘出K/--n--n eff曲线，⾃⾏判断正确与否，并分析原因。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
流动相
正相分配
极性
非极性
反相分配
非极性
极性
分配色谱
充填剂：多孔聚合物
３、离子交换色谱
是根据固定相的离子交换基和样品成分中的 离子性基进行交换来分离的
4、凝胶色谱
凝胶色谱分离方法是 利用分子振动效应， 根据样品分子的大小 而进行分离。所以又 称为排斥色谱
充填剂多采用：一定 孔径的多孔性聚合物
HPLC的介绍及应用
一、HPLC的分离方式
1、吸附色谱 2、分配色谱 3、离子交换色谱 4、凝胶色谱
1、吸附色谱
根据填充剂吸附活性 点对样品的吸收系数 不同而分离
充填剂：硅胶
2、分配色谱
根据固定相与流动相的极性不同而分为 正相分配色谱和反相分配色谱 两者的区别如下图所示：
固定相
二、LC在环保方面的应用
1、农药残留量分析 ：含氯农药 、有机 磷农药 、除虫菊
2、致癌物质 ：霉素 、亚硝胺(香烟中的 亚硝胺) 、苯并芘
3、水质分析
三、LC在生化方面的应用
1、蛋白质分析 2、肽类的分析 3、核酸 4、氨基酸
四、LC在药物方面的应用
1、药品的预处理：片剂，油膏，水剂等 2、体液：血、尿、脊椎液、唾液等 3、抗菌素 ：青霉素 、甾族(激素)