SMMC-7721人体肝癌细胞株的建立及其生物学特性的初步观察
沙利度胺对人肝癌细胞株SMMC-7721体外增殖影响
与空白对照组比较。Ｆ＝３．０９３。。ｑ＝４．０２～５．３７，Ｐ＜０．０５、０．０１
（下转第４２３页）
万方数据
５期
吴宁．高美华．糖尿病病人突变ＣＤ５９蛋白在真核细胞中的表达
方式抑制攻膜复合体（ＭＡＣ）的生成，保护自身正常 组织细胞免受补体损伤。近年来研究显示，糖尿病 人的血管内皮细胞及肾脏ＭＡＣ沉积增多，导致从 ＭＡＣ靶定的内膜释放生长因子，如基底成纤维生 长因子和血小板源性生长因子等［４］，而生长因子的 释放可以刺激血管壁细胞增殖并可导致增殖性血管 并发症的发生。人ＣＤ５９作为补体调节分子，可以 抑制ＭＡＣ的形成，从而抑制由于ＭＡＣ插入内皮 细胞促使生长因子释放而导致的血管增殖性并发症 的发生。但糖尿病病人的持续高糖血症可使ＣＤ５９ 发生非酶糖化并损伤其功能，因此糖尿病血管增殖 性病变的发生与ＣＤ５９糖基化失活可能有关。人 ＣＤ５９的ＮＭＲ结构显示，易于糖基化的氨基或靠近 咪唑基团，或为赖氨酸双体结构，因此，离咪唑基团 约０．５ ｒｉｍ的氨基基团最容易糖基化［５’６］。ＣＤ５９糖 基化位点位于Ｋ４１和Ｈ４４，Ｋ４１与Ｈ４４ＤＩ咪唑氮 的距离约（０．５９土０．１４）ｎｍ，且靠近活性位点Ｗ４０， 而Ｈ４４具有协助Ｋ４１糖基化作用，已证实Ｋ４１的 糖基化可能防碍ＣＤ５９的活性［３］。如果缩小赖氨酸 与组氨酸的距离，或同时增加了赖氨酸的数量，理论 上将使赖氨酸更易糖基化。因此，我们认为糖尿病 病人体内可能存在两种易糖基化的ＣＤ５９突变基 因，一种为ＨＭ７，即４２位苯丙氨酸、４３位谷氨酸均 突变为赖氨酸，缩小了赖氨酸与组氨酸的距离，同时 增加了赖氨酸的数量；另一种为ＨＭ８，即４３位谷氨 酸突变为赖氨酸，缩小了赖氨酸与组氨酸的距离。 这两种突变基因在理论上均更易糖基化。 有研究显示，可溶性ＣＤ５９在原核细胞中可以 获得表达［６］，但活性较低。本课题转染选用的ＣＨＯ 细胞是目前公认的较理想的一种哺乳动物表达系 统。ＣＨＯ细胞易培养和产业化，表达的蛋白质具有 良好的天然构象，遗传稳定性好，表达效率高。 ｐＡＬＴＥＲ可在大肠杆菌中大量复制，也可在哺 乳动物细胞中高效表达。其多克隆位点两端分别有 Ｔ３、Ｔ７启动子，可直接用于测序。ＨＭ—ｐＡＬＴＥＲ 重组表达质粒含有人突变基因ＣＤ５９的全长ｃＤＮＡ 序列，保证了表达产物具有较好的天然构象，利于活 （上接第４２０页）
pEGFP-N2-ECM1重组质粒的构建及其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达
Ｓ ＭＭＣ ７２ 一７ １肝癌细胞 系。方 法
术构建 ｐ Ｇ ＰＮ 一Ｃ 真核表 达载体 ， Ｅ Ｆ — ２Ｅ Ｍ１ 经酶切 、 测序鉴定正
确后 ， 脂质体 转染 Ｓ 用 ＭＭＣ７２ 一７ １细胞 ， ４ ８药 物 筛选 稳 定 Ｇ１ 转染 的细胞 系。荧 光显微镜检测融合 蛋 白表达 ， ＴＰ Ｒ技 Ｒ —Ｃ 术检测 Ｅ Ｍ１ 因表达 。结果 构建 的重 组质 粒经 双酶 切 Ｃ 基 及 测序分析鉴定 ， 结果证实 ｐ Ｇ ＰＮ ．Ｃ Ｅ Ｆ — ２Ｅ Ｍ１构建成功 ； 筛选
了 ｐ Ｇ ＰＮ － Ｃ Ｅ Ｆ —２Ｅ Ｍ１的真核表 达载体 ， 在肝 癌 Ｓ 并 ＭＭＣ７２ －７ １
细胞 中稳定表达 ， 为研究 Ｅ Ｍ１在肝癌进展 中的作 用奠定 了 Ｃ
实 验基础 。
公司； 胰酶购于江苏碧 云天公 司； 高糖Ｈ ｃｏｅ公 司 ； ４ ８购 于美 国 Ｒ ｓｅ ｙｌｎ Ｇ１ ｏｈ 公 司 、 培养 板 购 于 Ｃ ｒｉｇ公 司 ；Ｒ ｖｒ 反 转 ６孔 ｏｎｎ ｅｅｔ Ａ 录试 剂盒 购 于 Ｆｒ ｎａ 公 司。Ｌ ｅｍｅｔｓ Ｂ—Ｋ ｎ ａａ琼脂 培养
安徽 医科 大学学报
Ａｔ ｎｖｒｔｔ ｄ ｉ ｌ ｎ ｕ ２ １ ｅ ；７ ２ ｃ Ｕ ｉ ｓａｉＭｅｉｎ ｉＡ ｈ ｉ ０ ２Ｆｂ ４ （ ） ａ ｅｉ ｓ ｃａｓ
・１ ３・ ３
ｐ Ｇ ＰＮ －Ｃ Ｅ Ｆ —２Ｅ Ｍ１ 重组质粒 的构 建 及其在人肝癌细 胞 系 Ｓ ＭＭＣ７２ 一 １中的表达 ７
生 物学 功能 提供 依据 。
１ 材料 与方 法
Ｂ ｍ 及保护性碱基 ， ａ ＨＩ 并保持 Ｅ Ｍ１阅读框正确 ； Ｃ 所 有 引物 由上 海生工 生 物技术 有 限公 司合 成 。扩增
人肝癌SMMC-7721细胞培养体会①
人肝癌SMMC-7721细胞培养体会①作者：王玥李应东来源：《中外医疗》2011年第02期【摘要】根据长期培养人肝癌SMMC-7721细胞的经验,总结出了一套培养细胞的方法,使得复苏细胞成活率大为提高,为进一步的实验研究奠定了基础。
【关键词】人肝癌SMMC-7721细胞细胞培养方法【中图分类号】 R73 【文献标识码】 A 【文章编号】 1674-0742(2011)01(b)-0026-01目前细胞培养技术已成为很重要的生物技术之一,它是医学、新药开发等实验研究的基础技术,其作用不容忽视。
人肝癌SMMC-7721细胞属于肝癌细胞系,现已广泛用于药物毒理、抗肿瘤等方面的研究,目前关与人肝癌SMMC-7721细胞的培养文献还比较少,我们对于人肝癌SMMC-7721细胞的培养条件和方法上进行了探索,现总结出一些经验。
1资料与方法1.1一般材料1.1.1实验细胞人肝癌SMMC-7721细胞株由甘肃兰州大学附属二院泌尿研究所惠赠。
1.1.2主要试剂D ulbcco’s Modified Eagle’Medium(DMEM)培养基:北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司磷酸盐缓冲液(PBS):氯化钠8.00g、十二水磷酸氢二钠2.885g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钾0.20、三蒸水配制,0.22μm滤膜过滤除菌,PH7.2～7.4,4℃保存。
新生牛血清(NBCS):杭州四季青生物材料工程研究所-20℃保存,使用前4℃溶解,56℃灭活30min。
胰蛋白酶消化液:胰蛋白酶(Trypsin 1:250,GIBCO公司)用PBS液配制成浓度为0.25%溶液,0.22μm滤膜过滤除菌,4℃保存。
青霉素、链霉素溶液:0.22μm滤膜过滤除菌,4℃保存。
1.1.3实验仪器二氧化碳培养箱:BB16UV德国Heraeus公司;超净工作台:VS-1300L型,苏净集团苏州安泰空气技术有限责任公司;倒置相差光学显微镜:IX71型,日本Olympus公司产品;恒温水浴锅:DZW-4型,金坛市恒丰仪器厂;纯净水系统:Milli-Q Biocel美国Millipore公司;电热恒温干燥箱:风热式,101型,北京科伟永鑫实验仪器设备厂;台式灭菌器:TMQ.J-2540型,山东新华医疗器械股份有限公司。
科罗索酸对SMMC-7721细胞生长抑制作用的初步研究
・
临床研 究 ・
科 罗索 酸 对 Ｓ ＭＭＣ７２ 一７ １细胞 生长 抑 制 作用 的初 步研 究
李 海艳 ， 徐燕 丰 ， 辛海 量 ， 昌全 凌
（ 第二 军 医大学 ， 海 ２ ０ ３ ） 上 ０ ４ ３
摘要 ： 目的 法
研究 中药猫人参中提取的三萜化合物科罗索酸 （ Ｒ 对 人肝癌 Ｓ Ｃ７２ 细胞生长的影 响。方 Ｃ Ａ） ＭＣ －７ １
４ ４
山东 医药 ２ １ 年第 ５ 卷第 ５ ０１ １ ２期
培 养液 后 ， 孔 加入 １ ｌ ０ １ ｌ Ｍｉ Ｃ ｐｕｅ 每 ０ 含 ． 的 ｔ ａ ｔｒ ｏ
对 照 ６ ｈ １ ２ｈ
预 热 的孵育 缓 冲液 ， 于 ３ 并 ７℃ 下 孵 育 １ ｎ Ｐ Ｓ ５ｍｉ， Ｂ 冲洗 ， 埋 培养板 并 于荧光 显微 镜 下显 色拍 照 。 包 １６ 蛋 白分 析和 Ｗｅｔ ｎｂ ｔ ． ｓ ｒ ｌ 检测 ｅ ｏ 用细 胞 色素 Ｃ 释 放试 剂 盒 检 测 线 粒 体 释 放 人 胞 质 中 的细 胞 色 素 ｃ， 收集 胞 质和 线 粒体 蛋 白。Ｐ Ｓ冲洗 细 胞 ， 浮 于 Ｂ 悬 ＲＰ ＩＡ裂解 液 和含有 蛋 白酶抑 制剂 的提 取缓 冲液 中 。
验组， 另取不含 Ｃ Ａ的单纯细胞培养液为对照组 ， Ｒ 用 Ｐ Ｓ收集贴壁和悬浮细胞 ， Ｂ 以浓度为 １ １６ｍ 重悬 于 × ０／ ｌ
２０ 结合缓冲液 ， ０ 加入 ５ ａｎｘｎＶＥ Ｆ ｎｅｉ －Ｇ Ｐ避光孵 育 １ ｉ， 加入 Ｐ， ５ｍｎ然后 Ｉ即刻用流式 细胞仪分析 。 １５ 线 粒体 膜 电位 测 定 ． ＭｉＣ ｐ ｒ 粒体 凋 亡 ｔ ａｔ ｅ线 ｏ ｕ 检测试 剂盒 检测膜 电位 改变 。细胞 以 １×１ ｍ 浓 ０／ ｌ 度种 于 ６孔 板 中 ， 分别 加 入 ３ ｍ ｌＬＣ Ａ和溶 质 ５Ｉ ｏ Ｒ ｘ ／
牛樟芝抗肝癌的效应与机制研究
牛樟芝抗肝癌的效应与机制研究[背景与目的]全球每年新确诊的恶性肿瘤中约有9.2%为肝癌,在肝癌的新发病例中,亚洲约占70%,其中,我国的肝癌发病率居首位,且我国HCC患者的年死亡人数占全球HCC患者死亡人数的55%左右。
那些进展为HCC的患者几乎都在12个月内死亡,证明HCC进展极快且预后极差,因此,急需寻找有效的治疗药物。
ANCA-E-D是牛樟芝菌丝体的二氯甲烷提取物。
台湾当地居民一直用牛樟芝来治疗食物和药物中毒、腹泻、腹痛、皮肤瘙痒、改善免疫和肝功能等,而现代药理也证实,牛樟芝具有调节免疫、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化和神经保护等作用。
研究发现,牛樟芝与中药灵芝同属于多孔菌科的真菌,生长习性和性味相近,生物活性成分不同,尤其是牛樟芝的生物活性物质种类比单一种类的灵芝更多,且萜类和多醣等含量更高,故而近年来,牛樟芝的抗肿瘤和免疫调节等功效成为研究的热点。
我们认为牛樟芝具有扶正补虚和抗癌解毒的双重功效,是一种潜在的特异性的抗癌中药。
已有的研究证实,牛樟芝可以抑制肺癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的生长。
本研究中,我们利用SMMC-7721肝癌细胞株,通过体内和体外实验,利用基因芯片高通量的特点,初步探讨牛樟芝对肝癌细胞的体内外抑制作用和分子机制。
[方法]1.体内实验(1) SMMC-7721细胞(4×105 cell／只)接种至4～6周龄雄性BABL/c裸鼠右后肢皮下,建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型；(2)造模成功裸鼠随机分为3组(10只／组)：生理盐水对照组,25 mg/kg ANCA-E-D实验组、50 mg/kg ANCA-E-D实验组,腹腔注射,每天1次,连续治疗21天；(3)观察裸鼠的一般状况,测量各组裸鼠的体重、移植瘤体积等；血液学检测血清ALT和AST含量；病理切片HE染色检测移植瘤和肝肾组织,IHC检测移植瘤组织的MVD和PCNA的表达,TUNEL检测移植瘤组织的细胞凋亡。
2.体外实验(1)0、20、40、60、80mg/LANCA-E-D处理SMMC-7721细胞24、48、72h, MTT法检测SMMC-7721细胞的增殖抑制率；(2)0、20、40、60mg/LANCA-E-D处理SMMC-7721细胞24h,Hoechst33258及瑞氏染色观察细胞形态；(3) 0、20、40、60、80 mg/L ANCA-E-D 处理SMMC-7721细胞24h,流式细胞术(FCM)检测细胞周期和细胞凋亡；(4)0、20、40、60 mg/L ANCA-E-D处理SMMC-7721细胞24h,基因芯片检测差异基因的表达；[结果]体内实验：ANCA-E-D可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长,抑制裸鼠移植瘤中微血管的形成以及PCNA的表达,诱导移植瘤细胞的凋亡；ANCA-E-D对移植瘤裸鼠的ALT和AST无影响。
文蛤抗癌多肽抑制肝癌细胞SMMC-7721差异蛋白质组分析
１ 材 料 与 方法
１２ ２ 第一 向等 电聚焦胶 电泳 （Ｅ ） ．． Ｉ Ｆ 自制胶 条 采用 ｐ 范 围在 ３～１ Ｈ ０和 ５～８的两 性
收 稿 日期 ：０ ８０ —５ ２０ －８１
基金项 目： 门市科技计划项 目（ ５２ ２ ０ ３ ２ ） 厦门市卫生局 厦 ３ ０ Ｚ ０ ６０ １ ， 资助项 目（ Ｋ ６ ２ 和厦 门 大学 科技 创 新工 程 基金 ＷＳ ０ ０ ） （ ＤＫ Ｃ ２ ０ ３０ ） Ｘ Ｊ Ｘ ０ ４ ０ １ 资助
贺 量 ，范成成 康 劲 翮 张 剑 ， ， ， 冷 波 石 艳 ， ，李文 岗 ， 陈清西ｈ
（ ． 门大学 生命科学学院 ， １厦 教育部细胞 生物学与肿瘤细胞工程重点实验室 ， 福建 厦 门 ３ １０ ； ６０ ５
２ 福建 医科大学附属厦门第一 医院 ， ． 福建 厦门 ３ １０ ） ６ ０ ４
料
肝癌细胞株 Ｓ ＭＭＣ ７ ２ －７ １购 自上 海 细 胞 所 细 胞
抑制 效 应 ， 肝 癌 细胞 Ｓ 如 ＭＭＣ－ ２ ， ７ １ 胃癌 细 胞 Ｂ 一 ７ ＧＣ ８ ３黑 色素瘤 细胞 等． 实验 室 已报道 过文 蛤 抗癌 多 ２， 本
肽对 胃癌细胞 Ｂ Ｃ－２ Ｇ ８ ３的抑制效应 ｕ ． 抗癌 多肽 对肝 Ｊ
引起了肝癌细胞 的凋亡 ， 一步 的抗癌多肽抑制肝癌细胞作用的研究提供了理论基础 ． 为进
关 键 词 ： ； 白质组 ； 肝癌 蛋 质谱
中图分类 号 ： １ Ｑ ５６
文献 标识 码 ： Ａ
文 章编号 ： ３ － ７（０８ ￥－ ８－ ０ ８ ４９ ２０ ）２ ０３ ４ ４ ０ ０ ０
文 蛤 肉质 鲜美 ，营养丰富 ， 且有极 高 的药 用价 值 ． 据 报道文 蛤具有 清热利湿 、 化痰 、 散结 的功 效 ， 癌 、 对肝 肺癌、 胃癌 、 甲状 腺肿 等也 有 明显 的抑 制 作用 ． 文蛤 抗
桔皮素对人肝癌细胞株SMMC-7721抑制作用的初步研究
生物学性状的改变） 每孔终 体积为 ２ ０ ｌ ， ０ ，。培养 ７ ｕ ２小时后 ， 每 孔再加 入 ５ ｍｇ・ｍＬ 的 ＭＴＴ储 存 液 ２ ｕ／ Ｌ 继 续 于 ５ １ Ｏ ｌ￣ ， ： Ａ ｏ
Ｃ ２饱 和湿度 ３ ￣孵箱中孵育 ４ ０， ７ Ｃ 小时后终 止实验 。小 心吸弃
每孔上清液 ， 并加入二 甲基亚砜 （ ＤＭＳ １ ％ ｌ Ｌ Ｏ）ｏ ／ 。于 １ ￣ Ｏ分 钟
（ｌ ｏ ｏｄ） 类 胡 萝 卜素 （ ａｏｅｏｄ ｆ ｖ ｎ ｉｓ 、 ａ ｃｒｔｎ ｉ）和 柠 檬 苦 素 类 （ｉ １ —
对照组加人与各 剂量组相对应 Ｄ Ｏ浓度 的完全培养基 ， 高 ＭＳ 最
Ｄ Ｏ 浓度 为 ０ １ （ 般认 为 ＤＭＳ ￣ ０ １ 时不 引起 细 胞 的 ＭＳ ． 一 Ｏ ．
群称 橘络 ， 均以理气 和 胃、 化痰 降逆人 方剂 ； 的幼 果称 枳实 ， 橘 不成熟 的青果横 切两半 称枳壳 ， 有破气 消积 、 具 化痰 消痞之 功 效。 ［ 。随着柑橘综 合利用 的深入 开展 和新技 术 的应用 ， 柑橘
果实 中具有抗现代疾病 ， 尤其 是抗 肿瘤 的功效成 分逐步被提取
ｅｎ ｎ ）证 实具有 较强 抗 口腔癌 ， ｕｏｅ， 喉癌 ， 癌 ， 肺 胃癌 ， 肤癌 肝 皮 癌， 乳腺癌 的作用 ， 还能抑制结肠 癌， 白血病等。 体外实 验 证 明 柑 橘 黄 酮 类 化 合 物 对 人 非 小 细 胞 肺 癌
Ａ５ ９ ］产黑 色素 的鼠黑色素细胞瘤 Ｉ ６ 黑色素瘤 ４ ， ４［ ， ３ ３ ， １ Ａ５ 人类 Ｔ细胞淋 巴瘤 Ｃ Ｆ ＨＳ －， 胃癌淋 巴结转移 细胞 ＴＧ Ｃ Ｉ Ｃ － Ｂ２人 ＢＩ Ｔ— Ｋ Ｂ有 很 强 的增 殖 抑 制 作 用 ， 对 正 常 人 类 细 胞 系 仅 有 较 弱 的 而 抗增殖活性¨ 。多 甲氧基黄 酮主要 包括川 陈皮素 和桔皮 素两 ４ ］ 种 。已经证实桔皮素 在体外 对人 乳腺癌 ， 结肠 癌 ， 癌细 胞等 肺 有 较 强 的抑 制 增 殖 作 用 ＿ ］ ５ 。本 研 究 的 目的 在 于 在 细 胞 水 平
低频超声联合微泡剂对肝癌细胞SMMC-7721的生物学效应
测
Ｒ Ｓ及 Ｓ Ｄ试 剂 盒购 于南 京 建成 生物 工 程研 究 Ｏ Ｏ
所 。按 说 明书进行 检测 操 作 ， 据 标 准 品 Ｏ 根 Ｄ值绘 制
超声探 头直径 ２ｅ 微泡 剂 由 ５ ｍ； ％碳 酸 氢钠 、 生素 ｃ 维
（２ ） Ｄ 组 （５ ） １０ Ｓ 和 １０ Ｓ 。
１ ３ ２ Ｍ Ｔ 法检 测 细胞存 活 率 ． ． １ｒ
用 ０ ２ ％胰 酶消 化 ．５
１ 材 料 与 方 法
１ １ 细胞及培 养 ． 人 肝 癌细胞 Ｓ ＭＣ ７ ２ Ｍ 一７ １由细 胞银行 提供 ， Ｒ — 用 Ｐ
１２ 主 要仪器 及微泡剂 ． 利用 东南 大学 （ 江苏 铁 医美 达 康 医 疗设 备 厂 ） 原
每次 同时接 种 ３块 板 。接 种完 放入培 养箱孵 育待其 贴
壁后 给予 不 同的 处 理 ， 理 后 继 续 放 入 培 养 箱 孵 育 。 处 分 别于处 理后 １２ 、８ｈ取 出 １ ９ 板 作 Ｍｒ’ 、４ ４ 块 ６孔 ｔ 检 Ｉ 测 。在 ５ ０ ｎ 波 长 下 测 定 Ａ 。 。 细 胞 存 活 率 ＝ ７ ｍ
ＭＩ ６ ０ 购 自 Ｇ Ｂ Ｏ ） ４（ １ Ｉ Ｃ 培养基 培 养 ， 该培 养 基含 １ ％ ０ 胎 牛血清 （ 杭州 四季 青生 物 工 程材 料 有 限公 司 ） ０ ，１０ Ｕ・ ｌ 青 霉 素 和 １０ ｍ ・ 链 霉 素 ，在 ３ Ｃ、 ％ ｍ ０ ｇ ｍｌ ７ｏ ５ Ｃ 养箱 中培养 。 Ｏ培
［ 中图分类号 ］Ｒ ３ ． ；Ｒ ３ ７ ５７ ・３
［ 文献标识码 ］Ａ
［ 文章编号 ］１７ —２４ ２０ ）４ ０ ６ ‘ ６ １６ ６ （０ ８ ０ —２ ０ ４ ４
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矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。