三疣梭子蟹抗菌肽基因的克隆
三疣梭子蟹线粒体基因组单核苷酸多态性
共有２２对 引物 的扩增 区域含有ＳＮＰ突变位 点 ，共包含２４个ＳＮＰｓ。统计 结果 显示，三疣梭
子蟹线粒体基 因组 中的ＳＮＰ分布 频率为０．１５／１００ ｂｐ，其 中转换 突变比例为７９．１％、颠换 突
变 比 例 为 １６张．６％ ；Ｃ／Ｔ（Ｇ／Ａ）突 变 比率 为７９．１％、 Ｇ／Ｔ（Ｃ／Ａ）突 变 比率 为 ８．３％、 Ａ／Ｔ突 变 与 Ｇ／Ｃ突变的比培率均，各 占４．１６％。本研 究 中所获 得的ＳＮＰ位 点分布 于三疣梭子蟹线粒体 基 因
ｈｔｔｐ：／／ｗｗ ｗ ｓｃｘｕｅｂａｏ ｃｎ
２期
赵 莲 ，等 ：三疣梭 子蟹 线粒 体 基 因组单 １．１ 实 验 材 料
本实验所 用 的４４只三疣梭子蟹均 为野生成体 ， ２０１５年 １ １月随机采 集于 山东莱州湾地 区（Ｌｚ）（２２只）、 连 云港 海 州湾 地 区 （ＨＺ）（２２只），其 体 质量 分 别 为 （１８２＋１７．５）ｇ、（２２３．１＋２１．０）ｇ。采 集 的三 疣 梭子 蟹 活体 运 回实验 室 ，一８０。Ｃ超低 温保 存 。
１．２ 样 品ＤＮＡ的提 取
工 具 。
蓓
关键 词 ：三疣梭 子 蟹 ； 线粒 体 基 因组 ；ＳＮＰ； 高分 辨 率 熔 解 曲线
中图分 类号 ：Ｑ ７８１；Ｓ ９６８．２５
文献 标志码 ：Ａ
与 随机 扩增 多 态 ［￣ＤＮＡ（ｒａｎｄｏｍｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ，ＲＡＰＤ）（第 一 代分子 标记 技术代 表）、简单 重 复序列 （ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ，ＳＳＲ１ （第二 代分 子标记技 术代表 ）等分 子标记技 术相 比， 单核 苷 酸多 态 ［￣（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ． ＳＮＰ）具 有 分 布广 、遗 传 稳 定性 强 、易 于 高通 量 分 型 等 独 特优 点 ，因此 成 为 第 三 代 分子 标 记 的 典型代 表 ］。 目前 ，ＳＮＰ标 记技术 已广泛应用 于遗 传多 样性 分析 、种质 鉴别 、性状关 联 分析 等 领域 中。ＳＮＰ标 记在 高 密度遗 传 连锁 图谱 的构建 方 面也 被 广 泛应 用 ［５－６］，但 仅 限 于核 基 因组 ， 目 前 尚无 线粒 体基 因组 ＳＮＰ图谱构 建 的研 究报 道 。
拟穴青蟹抗菌肽CrusSp基因克隆表达及抑菌活性分析
黄青霉 Ｐ ｎｃｌ ｍ ｃｒ ｏｅｕ Ａ ． ８０ 和 绿 色 ｅｉｌｕ ｈｙ ｇｎｍ（ Ｓ３３ ９ ） ｉｉ ｓ 木 霉 Ｔｉ ｏｅｍ ｉｄ （ Ｓ３ ２４ ） 于 广 州 市 微 ｒｈｄｒ ａｖ ｉｅ Ａ ． ９２ 购 ｃ ｒ
华 南师范大学学报 （自然科 学版 ）
２ １ 年 ２月 ０１
Ｆｂ ０ １ ｅ ．２ １
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ Ｓ ＴＨ ＯＵ ＣＨＩ ＮＯＲＭＡＬ ＵＮＩ ＮＡ ＶＥＲＳＴＹ Ｉ
２１ 第 １ ０ １年 期
Ｎｏ ．１。２ １ ０１
（ Ａ Ｕ ＡＬＳ Ｉ Ｎ ＥＥ ＩＩ Ｎ） Ｎ Ｔ Ｒ ＣＥ Ｃ Ｄ ＴＯ
白的抗真 菌和 细菌 的生 物 活 性 ， 为进 一步 探 讨 其 抗 菌 感染 机 制奠 定 了基 础 ．
１ 材 料 和 方法
１１ 材 料 ．
１ １ １ 供 试 蟹 和 菌 种 拟 穴 青 蟹 （ ｃｌ ａａ ． ． Ｓｙｌ Ｐ ｒ． ａ ｍ ｍｏａｎ 购 于深 圳 南 澳 海 鲜 街 ． 黄 色 葡 萄 球 菌 ａ ｓｉ） 金 Ｓａｈｌｃｃｕ ｕｅｓＣ Ｃ２０ ３ 、 ｔ ｙｏｏｃｓ ｒ （ ＭＣ ６０ ） 大肠 埃 希 氏菌 ｐ ａ ｕ Ｅｃｅｉ ｉ ｃｌ Ｃ Ｃ４ ８５ 、 ｓ ｒｈａ ｏｉ ＭＣ ４ ２ ） 短小 芽 孢 杆 菌 Ｂｅｉ ｈ ｃ （ ｒ — ｖ
不 仅具 有广 谱 抗各 种 革 兰 氏 阳性 菌 、 兰 氏阴性 菌 革 和真 菌 的活性 ， 而且 具 有抗病 毒 、 原生 动 物和肿 瘤 细 胞 等作 用 Ｊ ． 自 １９ ９ ３年 美 国学 者 Ｄ Ｐ Ｃ Ａ Ｋ等 首 次 从 牛 ．．Ｌ Ｒ 蛙 皮肤 内发 现抗 菌肽 Ｒ ｎｌ ｉ ＿ ， ａａｅ ｎ后 ４ 国外 学者 对 其 ｘ Ｊ
三疣梭子蟹病原副溶血弧菌的分离与鉴定
三疣梭子蟹病原副溶血弧菌的分离与鉴定阎斌伦;秦国民;暴增海;张晓君;毕可然;秦蕾【摘要】从养殖病死三疣梭子蟹肝胰脏及心脏血淋巴液中分离到大量优势生长的细菌,人工感染试验证明分离菌对三疣梭子蟹有较强的致病性;对分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性等表型生物学性状及16S rRNA和gyrB两种基因的分子鉴定.菌株(JGX080708-1)所扩增的16S rRNA基因序列长度为1 453bp(GenBank 登录号:FJ824663),所扩增的gyrB基因序列长度为1191bp(GenBank 登录号:GQ372985);两种基因序列在NCBI通过blast检索,结果均与弧菌属细菌的基因序列自然聚类;根据分离菌的表型及分子特征,判定分离菌为弧菌属(Vibrio Pacini 1954)的副溶血弧菌[Vibrio parahaemolyticus(Fujino et al 1951)Sakazaki Nakamura and Takizawa 1963].分离菌的药敏试验结果显示,对供试49种抗菌药物中的安曲南等42种药物高度敏感,对林可霉素敏感,对青霉素G 等6种药物耐药.【期刊名称】《海洋通报》【年(卷),期】2010(029)005【总页数】7页(P560-566)【关键词】三疣梭子蟹;副溶血弧菌;16SrRNA基因;gyrB基因【作者】阎斌伦;秦国民;暴增海;张晓君;毕可然;秦蕾【作者单位】淮海工学院,江苏省海洋生物技术重点实验室,江苏,连云港,222005;淮海工学院,江苏省海洋生物技术重点实验室,江苏,连云港,222005;淮海工学院,江苏省海洋生物技术重点实验室,江苏,连云港,222005;淮海工学院,江苏省海洋生物技术重点实验室,江苏,连云港,222005;淮海工学院,江苏省海洋生物技术重点实验室,江苏,连云港,222005;淮海工学院,江苏省海洋生物技术重点实验室,江苏,连云港,222005【正文语种】中文【中图分类】S945;Q939.1Abstract:Dominant bacteria were isolated from diseased Portunus trituberculatus L.,and have strong pathogenicity to Portunus trituberculatus L.by artificial challenge.The phenotypic biological characters were examined,including morphological characteristics,physiological and biochemical characteristics; and the activity of extracellulase and hemolysin.The molecular identification were also conducted,and the 16S rRNA and gyrB genes were partially sequenced and compared with sequences deposited in databases,moreover molecular phylogenetic trees were constructed.The sequenced 16S rRNA gene of strain JGX080708-1 (GenBank accession No.FJ824663)is 1,453bp in length,and the sequenced gyrB gene of strain JGX080708-1 (GenBank accession No.GQ372985)is1,191bp in length.Blasting of 16S rRNA and gyrB genes in NCBI showed high homogeneity between the isolates and Vibrio sp.from GenBank database.The results showed that the identified strains belonged to Vibrio parahaemolyticus [(Fujino et al 1951)Sakazaki Nakamura and Takizawa 1963]of Vibrio (Pacini 1954)based on their phenotypic and molecular characteristics.Drug resistance of isolates to 49 antimicrobial agents was detected,and the results showed that isolates were high sensitive to 42 agents including aztreonam,and also sensitive to lincomycin,furthermorethey were resistant to 6 agents including penicillin G.Keywords：Portunus trituberculatus L.; Vibrio parahaemolyticus; 16S rRNA gene; gyrB gene三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)隶属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)，是一种大型海产经济蟹类，广泛分布于东南亚、东亚、非洲、美洲及澳大利亚等地的海域内，中国沿海从南至北均有分布。
三疣梭子蟹人工繁育流程
三疣梭子蟹人工繁育流程1 育苗设施育苗设施是一般常规的虾、蟹育苗室，配有供热、供气、供海（淡）水等设施，海水进排方便，盐度 25‰～35‰，pH 值 7.8～8.6，杂鱼贝类资源丰富，远离污染源，水质达到国家水质标准，水泥池容积25～40 m3；池深1.5～1.8 m。
蓄水池面积10～40亩，2～4个不等。
海水使用前用 60 目过滤网过滤，并且必须经过 24 小时沉淀，同时将乙二胺四乙酸钠盐与水按照说明书上的使用方法配制成溶液，全池泼洒以螯合水中的重金属离子，处理好的海水就可以用来培育梭子蟹了。
2 亲蟹暂养2.1 亲蟹的选择与运输亲蟹可选择自然海区的或养殖蟹，标准是：蟹体无伤、附肢齐全、活力好、体重250 g左右；若选用抱卵蟹，要求其腹部卵块完整紧实紧收，卵块的轮廓，形状完整无损。
亲蟹选好后，用橡皮筋绑住大蟹，防止其争斗、损伤。
短途运输干运、水运都可以，长途运输最好是带水运输。
2.2 入池亲蟹暂养池要充分刷洗、消毒处理，再铺上10 cm经消毒、冲洗干净后的细砂，在排水口一端留出30%面积作为投饵区，暂养池上面用黑布遮光。
调整好用水的温度、盐度、pH值，亲蟹入场后用500 ppm甲醛溶液浸泡5 min，捞出放入暂养池，密度3～5只/m2。
2.3 日常管理亲蟹入池后，稳定2～3 d开始升温，幅度每天0.5～1℃逐渐升至20℃，恒温待产。
饵料以活体沙蚕为主，辅以四角蛤蜊、杂色蛤、缢蛏，投喂量按亲蟹体重5%～15%计算。
以残饵略有剩余为宜。
充气石1个/2m2，充气量微波状即可。
每天换水80%～100%，换水时清除死蟹及残饵。
7～10 d对细砂消毒，翻洗一次。
经15～20 d培育，亲蟹开始抱卵并及时拣出，另池培养。
亲蟹抱卵后，每天升温0.5℃至22℃，恒温孵化，其它管理同上。
3 播苗当抱卵蟹腹部卵块呈黑灰色，镜检膜内无节幼体心跳达200次/min，及时捞出亲蟹，用500 ppm甲醛溶液浸泡5min，放入蟹笼，每笼一只，吊入培育池。
三疣梭子蟹血淋巴免疫功能的初步研究
合 , 25 ℃下 分别 孵育 0、0.5、 1.0、 1.5、2.0、2.5、 3.0、3.5、4.0 ｈ后取 0.1 ｍｌ, 用平板计数法测定菌 液浓度 。每个时间梯度设置 3个平行 。 抗菌活力 大小用细菌的存活指数 (ＳＩ)来表示 。
某时刻的 ＳＩ[ 6] =该 零时 时刻 刻细 细菌 菌数 数量 量 ×100
表 1 三疣梭子蟹血细胞及血清中 19 种酶的检测结果
测定的酶
英文 雌蟹 雌蟹 雄蟹 雄蟹 缩写 血细胞 血清 血细胞 血清Leabharlann 对照ＣＯＮＴＲ 0
0
0
0
碱性磷酸酶
ＡＫＰ
0
1
2
2
脂酶 (Ｃ4)
ＥＳＴ(Ｃ4) 5
5
5
5
类脂脂酶 (Ｃ8)
ＥＬＩＰ
2
1
2
2
类脂 (Ｃ14)
ＬＩＰ
5
5
5
5
亮氨酸芳胺
ＬＡＡ
1
3
5
3
缬氨酸芳胺酶
表 2 三疣梭子蟹血清中 6种免疫酶的活性 (平均值 ±标准差 )
测定的酶
活性
ＡＫＰ/Ｕ· (100 ｍｌ)-1 ＡＣＰ/Ｕ· (100 ｍｌ)-1 ＬＺＭ/μｇ· ｍｌ-1
ＰＯＤ/Ｕ· ｍｌ-1 ＰＯ/Ｕ ＳＯＤ/Ｕ· ｍｌ-1
0.97 ±0.10 0.86 ±0.20 11.19 ±1.96 29.69 ±4.57 2.60 ±0.37 90.98 ±1.34
试验用菌为溶藻弧菌 (Ｖｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ)(由 宁波大学生命学院微生物实验室提供 )。 将溶藻弧 菌划线接种于斜面培养基上 , 25 ℃培养 24 ｈ后 , 用 灭菌的 0.85 %生理盐水制成菌悬液 , 麦氏比浊管 比浊 , 确定菌悬液浓度约 104 ～ 105 ｃｆｕ/ｍｌ, 并作平 板菌落计数 。菌悬液 4 ℃保存备用 。 1.2.5 血淋巴抗菌活力的测定
《卵形鲳鲹两种抗菌肽基因功能及转录调控研究》
《卵形鲳鲹两种抗菌肽基因功能及转录调控研究》摘要：本文研究了卵形鲳鲹中两种抗菌肽基因的功能及其转录调控机制。
通过生物信息学分析、基因克隆、原核表达、细胞实验及分子生物学技术，我们深入探讨了这两种抗菌肽在卵形鲳鲹免疫系统中的作用，以及其转录调控的关键因子和路径。
一、引言卵形鲳鲹作为一种重要的水产经济动物，其免疫系统在抵抗病原菌入侵时发挥着重要作用。
抗菌肽作为免疫系统的重要组成成分，在抵御细菌感染中具有关键作用。
因此，研究卵形鲳鲹抗菌肽基因的功能及其转录调控机制，对于理解其免疫机制、提高养殖业的病害防控能力具有重要意义。
二、材料与方法1. 材料：选用健康的卵形鲳鲹作为实验材料，提取其相关组织进行基因克隆和表达分析。
2. 方法：（1）生物信息学分析：利用生物信息学软件对卵形鲳鲹抗菌肽基因进行序列分析，预测其结构和功能。
（2）基因克隆：通过PCR技术扩增抗菌肽基因，构建表达载体。
（3）原核表达：将表达载体转入大肠杆菌，进行抗菌肽的原核表达。
（4）细胞实验：利用细胞培养技术，研究抗菌肽对细胞的保护作用。
（5）分子生物学技术：通过荧光定量PCR、Western blot等技术，研究抗菌肽的转录调控机制。
三、结果与分析1. 基因功能分析：通过生物信息学分析和实验验证，我们发现两种抗菌肽基因在卵形鲳鲹中具有不同的表达模式和功能。
其中，抗菌肽基因A主要参与抵御革兰氏阳性菌的感染，而抗菌肽基因B则对革兰氏阴性菌具有更强的抑制作用。
2. 转录调控研究：我们发现两种抗菌肽基因的转录水平受到多种因素的影响，包括病原菌的感染、环境因素和机体内分泌水平等。
通过荧光定量PCR和Western blot等技术，我们确定了转录调控的关键因子和路径，并进一步探讨了这些因子如何影响抗菌肽的合成和分泌。
3. 原核表达与细胞实验：原核表达实验成功实现了两种抗菌肽的异源表达，并纯化了活性蛋白。
细胞实验表明，这两种抗菌肽对细胞具有保护作用，能够显著提高细胞的存活率，并抑制病原菌的增殖。
三疣梭子蟹“科甬1号”生长速率、形态特征和对溶藻弧菌的耐受性
三疣梭子蟹“科甬1号”生长速率、形态特征和对溶藻弧菌的耐受性陈晨;母昌考;宋微微;李荣华;王春琳【摘要】为探究三疣梭子蟹“科甬1号”新品种(简称“科甬1号”)和普通海捕野生三疣梭子蟹子1代(简称“普通蟹”)在生长速率、形态特征和对溶藻弧菌耐受性上的差异,通过对相同生长条件下“科甬1号”和普通蟹的30、60、90、120和150日龄5个时间点进行体质量和形态指标测量,并在60、90、120和150日龄4个时间点,用浓度为1.14×107 cfu/mL溶藻弧菌按10μL/g(体质量)剂量进行体腔注射攻毒并统计死亡率.对数据进行ANOVA检验表明,在全部5个测量时间点,“科甬1号”体质量均极显著大于普通蟹体质量;“科甬1号”和普通蟹各形态特征差异均不显著;在60和90日龄2个攻毒时间点,“科甬1号”溶藻弧菌耐受性均极显著强于普通蟹,在120和150日龄2个攻毒时间点,“科甬1号”溶藻弧菌耐受性均显著强于普通蟹.LSD检验分析表明,在60～ 150日龄期间“科甬1号”对溶藻弧菌的耐受性较稳定,不随生长时间不同而存在显著差异,此外也表明相同浓度溶藻弧菌对相同品种60 ～ 150日龄的三疣梭子蟹根据体质量按10 μL/g剂量进行体腔注射攻毒具有相对稳定的致死率.【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2015(039)006【总页数】6页(P818-823)【关键词】三疣梭子蟹;体质量;形态特征;溶藻弧菌耐受性【作者】陈晨;母昌考;宋微微;李荣华;王春琳【作者单位】宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波大学海洋学院,浙江宁波315211【正文语种】中文【中图分类】S968.2三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)隶属于节肢动物门(Arthropoda),软甲纲(Malacostraca),十足目(Decapoda),梭子蟹科(Portunidae),梭子蟹属(Portunus),是一种重要的大型海产经济蟹类,北起我国辽东半岛、山东半岛,南至广东、广西各海域均有分布,是我国重要的渔业捕捞及海水养殖对象。
拟穴青蟹抗菌肽CrusSp基因克隆表达及抑菌活性分析
拟穴青蟹抗菌肽CrusSp基因克隆表达及抑菌活性分析徐栋梁;李洁颖;彭永鹤;夏立新;刘志刚【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(000)001【摘要】从拟穴青蟹血淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增编码CrusSp成熟肽的cDNA序列,克隆至pET-32a(+)表达载体中,转化至王coli OrigamiTM(DE3)中表达CrusSp蛋白,通过Ni2+亲和层析柱纯化获得CrusSp蛋白,表达出的CrusSp 蛋白相对分子量约10.27 ku,等电点为8.54,滤纸片扩散法结果显示CrusSp蛋白抑制绿色木霉.%Hemolyph was collected from Scylla paramamosain.The total RNA extracted from the hemocyte sample was used to amplify the sequence encoding an open reading frame of a mature peptide of CrusSp by RT - PCR.The sequence was cloned into pMD18 -T vector and subjected to DNA sequence analysis.The DNA of CrusSp was isolated from pMD18 -T/CrusSp and was cloned into pET -32a( + ) expression vector to allow expression of CrusSp as a fusion protein in E.coli OrigamiTM ( DE3 ).The fusion protein could be purified effectively by His - Band resin chelating chromatography.The antimicrobial activities of CrusSp were studied by agar diffusion test.Analysis by 15％ SDS - PAGE revealed that the molecular mass of CrusSp is 10.27 ku.The antimicrobial activity revealed that CrusSp exhibited antifungal activity towards Trichoderma viride.【总页数】5页(P93-97)【作者】徐栋梁;李洁颖;彭永鹤;夏立新;刘志刚【作者单位】深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所,广东深圳,518060;深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所,广东深圳,518060;深圳市圣西马生物技术有限公司,广东深圳,518057;深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所,广东深圳,518060;深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所,广东深圳,518060【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.拟穴青蟹抗菌肽SCY2在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性 [J], 彭会;刘杰;陈慧芸2.拟穴青蟹抗菌肽scygonadin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性 [J], 许婉芳;谢嘉华;陈慧芸3.鲢抗菌肽 Hepcidin 的基因克隆和表达及抑菌活性分析 [J], 周卫军;刘振兴;柯浩;马艳平;郝乐;徐明芳;4.鲢抗菌肽 Hepcidin 的基因克隆和表达及抑菌活性分析 [J], 周卫军;刘振兴;柯浩;马艳平;郝乐;徐明芳5.拟穴青蟹抗菌肽SCY2在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性 [J], 彭会;刘杰;陈慧芸;;;;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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第41卷 第2期 海 洋 与 湖 沼 Vol.41, No.2 2010年3月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Mar., 2010
* 国家科技支撑计划项目, 2007BAD43B08号; 浙江省重大科技专项重大项目, 2007C02001号; 浙江省面上项目, 2009C32019号; 浙江省教育厅项目, 20061141号。申 望, 讲师, E-mail：shenwangzs@163.com ① 通讯作者: 王日昕, 教授, E-mail：wangrixin1123@126.com 收稿日期: 2009-06-19, 收修改稿日期: 2009-08-25
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) Pthyastatin抗菌肽基因的克隆与表达分析*
申 望 叶 茂 石 戈 王日昕① (海洋生物资源及分子工程实验室 浙江海洋学院海洋科学学院 舟山 316004)
提要 采用构建三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库的方法克隆了一个新型抗菌肽基因Pthyastatin, 并用荧光定量RT-PCR方法, 进行Pthyastatin的表达研究。结果表明, Pthyastatin前体由16个氨基酸残基的信号肽和成熟肽两部分组成, 其中Pthyastatin成熟肽有两个结构域：N端的富含Pro/Arg结构域和C端的包含6个保守Cys残基与对虾抗菌肽penaeidins同源的结构域, 表明Pthyastatin属于对虾抗菌肽penaeidins家族; 荧光定量RT-PCR分析结果表明Pthyastatin在血细胞中高水平组成型表达; 致病菌副溶血弧菌诱导后Pthyastatin在血细胞中表达先下调、后上调, 在诱导后24h表达量又基本恢复到诱导前水平, 支持Pthyastatin在血细胞中高水平组成型表达的观点, 但致病菌诱导后表达变化机制不明。 关键词 三疣梭子蟹, 血细胞, 抗菌肽, Pthyastatin, mRNA表达 中图分类号 Q956
无脊椎动物体液中没有免疫球蛋白, 因此缺乏抗体介导的特异性免疫系统, 依赖先天性非特异免疫系统识别和清除入侵的微生物, 维持机体健康(Begum et al, 2000)。甲壳动物是无脊椎动物中一个重要类群, 同时虾、蟹是大宗养殖品种, 有巨大经济价值, 研究甲壳动物非特异免疫机理可为甲壳动物养殖疾病防治提供理论依据和新的思路, 因此该领域一直是无脊椎动物免疫系统的研究热点。已报道的甲壳动物体液免疫相关因子主要有抗菌肽、溶菌酶、酚氧化还原酶、凝集素、脂多糖/β1, 3-葡聚糖结合蛋白、细胞粘着蛋白、蛋白酶抑制剂等(Iwanaga et al, 2005)。其中甲壳动物抗菌肽由于具有广谱抗细菌、抗真菌活性以及独特的作用机理, 在医学和农业上具有潜在的应用价值, 极有可能成为抗菌、抗病毒及抗肿瘤药物的新来源而备受关注(李义等, 2006)。 甲壳动物抗菌肽根据结构和来源可大致归为三个家族(Lee et al, 2003; Vazquez et al, 2009)：(1) 对虾抗菌肽Penaeidins 家族：N端富含脯氨酸, C端含有6个Cys, 形成3个分子内二硫键, 两个结构域的功能互补, 富含脯氨酸的N 端结构域在锚定微生物的细胞膜中起重要作用, 而富含Cys的C端结构域则起抗菌作用; (2) Crustins家族抗菌肽：Crustins家族抗菌肽以其C端的WAP(whey acidic protein)结构域为标志, 与甲壳类中发现的其它富含Cys的抗菌肽区分开来(如同样富含Cys但不含WAP结构域的Penaeidins), WAP结构域是由8个保守的Cys位点形成四个二硫键构成的一个紧密结构, 因此又被称作4-DSC核(four-disulphide core); (3) 血蓝蛋白水解产生的抗菌肽：该类型抗菌肽可能来源于蛋白水解酶对血蓝蛋白的加工, 与血蓝蛋白C端部分区段高度同源或完全相同, 如细角滨对虾(Penaeus stylirostris)抗菌肽PsHct1、PsHct2, 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗菌肽PvHct, 淡水螯虾(Pacifastacus leniusculus)抗菌肽astacidin 1等。 2期 申 望等: 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) Pthyastatin抗菌肽基因的克隆与表达分析 247 抗菌肽Hyastatin是Sperstad等(2009b)从蛛形互爱蟹(Hyas araneus)血细胞中纯化鉴定的一种对G+/G-菌、真菌均有抑制活性的新型抗菌肽, 其C端结构域与对虾抗菌肽Penaeidins同源, 也有6个保守的Cys残基, 形成3对分子内二硫键, 因此Hyastatin属于Penaeidins家族抗菌肽。本研究通过对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)血细胞全长cDNA文库克隆进行测序, 克隆到与蛛形互爱蟹Hyastatin同源, 但结构存在显著差异的新型Hyastatin(命名为Pthyastatin)抗菌肽全长cDNA序列, 并对不同组织中Pthyastatin表达量差异及感染致病菌副溶血弧菌(Vibrio para-haemolyticus)后血细胞中Pthyastatin表达量变化进行分析, 为研究Pthyastatin在三疣梭子蟹免疫防御反应过程的地位和作用机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库的构建及Pthyastatin基因克隆 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)采自浙江舟山海域。成年雄性蟹采集后饲养于恒温水族箱(25℃), 饲养24h后, 以内含抗凝剂(0.45mol/L NaCl, 0.1mol/L葡萄糖, 26mmol/L柠檬酸, 30mmol/L柠檬酸钠, 10mmol/L EDTA, pH 4.6; Söderhäll et al, 1983)的注射器从蟹肢体未硬化部位抽取血淋巴, 立即离心(4℃, 2000g, 5min)收集血细胞, 采用TRIZOL法提取血细胞总RNA, mRNA的分离按Invitrogen公司FastTrack 2.0Kit试剂盒操作手册进行, 通过poly(T)纤维素柱亲和层析, 从血细胞总RNA中得poly A+ mRNA。全长
cDNA文库的构建按Clontech公司SMART cDNA全长文库构建试剂盒说明书进行, 连接载体使用pGEM-T easy T载体, 转化菌株为E. coli (DH10B)。文库随机测序使用引物M13F (5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′), 当由于poly(A)的出现使测序效果差时改用引物M13R (5′- CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3′)反向测序。测得的ESTs序列通过BLASTX检索Genbank nr蛋白数据库寻找同源基因。 1.2 三疣梭子蟹抗菌肽Pthyastatin的分析 1.2.1 三疣梭子蟹抗菌肽Pthyastatin序列分析 DNSP 4.10分析Pthyastatin单倍型多态位点、核苷酸多样性、单倍型频率、单倍型多样性(Rozas et al, 2003); SignalP 3.0在线分析信号肽序列(Emanuelsson et al, 2007); 核苷酸及氨基酸序列比对使用Clustal W (Thompson et al, 1994); 等电点预测使用ExPASy服
务器的 Compute pI/Mw tool (http://us.expasy.org/ tools/ pi_tool.html) (Bjellqvist et al, 1994)。 1.2.2 系统发生分析 三疣梭子蟹抗菌肽Pthyastatin氨基酸序列和以下抗菌肽进行序列比对(Sperstad et al, 2009b)：蛛形互爱蟹抗菌肽Hyastatin (ACQ76432), 凡纳滨对虾抗菌肽penaeidin-2 (CAA75142), penaeidin-3a1 (AAK73084), penaeidin- 3d(AAK77533), PEN4-1 (ABA55000)和penaeidin-1 (P81056), 白滨对虾(L. setiferus)抗菌肽penaeidin-2d (AAK83453), penaeidin- 3l (AAK83454)和penaeidin- 4d (AAK83455), 斑节对虾(Penaeus monodo)抗菌肽penaeidin (AAQ05769), 南方滨对虾(L. schmitti)抗菌肽PEN4-1(AAX58699)和PEN2-1 (AAX58697), 中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)抗菌肽penaeidin-5-1 (AAZ79334) 和penaeidin-3-1 (AAP33450), 细角滨对虾抗菌肽penaeidin-2 (AAQ62565)和penaeidin-3 (AAQ62566), 长毛明对虾(F. penicillatus)抗菌肽pen3-p (ABY56821), 保罗美对虾(Farfantepenaeus paulensis)抗菌肽PEN2-1 (AAX58695), 巴西美对虾(F. brasiliensis)抗菌肽penaeidin (ABO93324), 小褐美对虾(F. subtilis)抗菌肽penaeidin (ABO93321)。切除所有抗菌肽C端Cys富集区第一个Cys残基前的N端序列, MEGA 4.1软件包(Kumar et al, 2008)中邻接法(nerghbor-joining method, NJ)构建系统树, 参数设置为默认的泊松校正算法, 不考虑插入/缺失位点, 同时应用自举检验(bootstrap test)重抽样500次估计系统树中节点的自引导值(bootstrap value)。 1.3 Pthyastatin基因表达的荧光定量RT-PCR分析 1.3.1 Pthyastatin基因在三疣梭子蟹不同组织中的差异表达分析 从5只雄性三疣梭子蟹分别采集等量的血细胞、肌肉、肝胰脏、眼组织, 按组织差别将5个体来源的组织合并后提取总RNA。血细胞总RNA提取按1.1方法进行; 其它组织采集后先液氮研磨, 再用TRIZOL法提取总RNA。分别以4个组织的总RNA为模板, oligo(dT)18为引物, 按全式金EasyScript