微生物实验指导
微生物学类实验指导书(下)蛋白酶产生菌活力测定及果酒酵母分离纯化
实验一产酶微生物的分离、纯化与选育酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。
由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒,环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。
目前,能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶,葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的.通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。
2。
蛋白酶产生菌的分离与纯化2。
1 实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化.2。
2 实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶,细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌.本实验将土壤样品（或其他样品)悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛.也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养,分离筛选其他蛋白酶产生菌。
2.3 实验仪器与材料土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液;显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。
2。
4 实验方法与步骤2。
4.1 分离1)采集土壤样品，用无菌水制备1:10土壤悬液；2）取1:10土壤悬液5ml,注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75—80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置,于30-32 ℃培养24-48 h；4)对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片,做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
2。
4。
2 筛选1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基,再点接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养24—48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径.2）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。
微生物学实验指导大全
微生物学实验指导黄文芳张松编著华南师范大学生命科学学院第一部分基础实验实验1 培养基的配制一、实验目的和内容目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。
内容：1．牛肉膏蛋白陈培养基的配制。
2．高氏1号培养基的配制。
3．马丁氏培养基的配制。
二、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。
试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。
三、操作步骤（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。
其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.61．称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。
牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。
蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2．加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。
若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。
3．调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。
若偏碱，则用lmol/L HCl进行调节。
pH的调节通常放在加琼脂之前。
应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4．过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。
但是供一般使用的培养基，这步可省略。
微生物菌种选育实验指导
《微生物菌种选育实验》是一门涉及食品理化分析、微生物学实验且由学生自行设计实验方案的综合性、设计性实验课程，集中三周时间开课。
一、实验目的通过本环节训练，加深对发酵工程上游技术中菌种筛选的认识；学会常规选种方法；掌握微生物诱变育种的方法；掌握常规工业微生物菌种保藏法；树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。
二、实验内容实验一工业微生物菌种分离根据一定的生产目的如产酶、产酸、产酯等，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如曲药、酸乳、土壤中筛选出高产适宜的菌株。
1、分离培养基的配制2、无菌器材的准备3、菌悬液的制备4、接种5、培养6、初步鉴定(1) 菌落形态(2) 个体形态7、斜面接种培养实验二工业微生物菌种复筛通过摇瓶培养对实验一所得的菌株的生产性能进行精确的定量测定。
1、发酵培养基的配制；2、目的菌株的摇瓶培养；3、发酵液的生理活性测定。
实验三微生物的诱变育种用紫外线对实验一所得的高产菌株进行诱变，并测定诱变后的菌株的生产能力。
1、单细胞(或单孢子) 悬液的制备；2、致死曲线的测定；3、诱变处理；4、初筛；5、复筛；6、菌种保藏。
三、实验要求1．学生自行设计具体实验方案，在教师指导下由学生自主完成实验。
2．实验结束后，要求学生完成一篇微型小论文。
论文的撰写应本着实事求是的原则，对所做实验过程和数据进行认真、严格的记录和处理，并进行独立分析，不得抄袭他人的数据。
四、考核办法1、考核内容：实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等。
2、考核办法：按照实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等内容综合考核学生，得到学生该门实验课程的成绩。
成绩考核采用优秀、良好、中等、及格、不及格五级记分制。
3、考核标准：以实际操作技能和分析解决问题的技能为主，实验考核内容各单项所占分数比例为实验方案20%、实验态度10%、操作技能40%、实验报告30%。
微生物菌种选育概述微生物的菌种对进行微生物工作来讲是非常重要的。
没有“种”无法进行微生物的科学研究；没有良种，不能进行发酵工业的生产。
食品微生物学实验指导
2.显微镜的分辨率 是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用
公式表示为：
D=λ/2n·sin(α/2 )
式中 D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。λ：可见光的波长（平均 0.55μm)n:
物镜和被检标本间介质的折射率。α：镜口角（即入射角）。
普通光学显微镜油镜使用的原理:油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻
显微镜的使用
1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。
2.调节光亮度
3.低倍镜观察：粗调、细调 4.依次再进行中倍、高倍观察 5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香 柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦 镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部 复原。 显微镜保养和使用中的注意事项： 1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时， 特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能 够在左眼观察时，右眼注视绘图。 5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。
五、实验报告
绘出你观察的细菌运动位移轨迹示意图。
六、思考题
1.显微镜下观察细菌运动时，为何应减弱光线？
2.细菌的运动布郎运动有何区别？
实验三 显微镜的使用和细菌形态的观察
(完整版)微生物实验注意事项
微生物实验注意事项1.实验过程中要及时详细标清除产物和日期，实验做完以后要对以前的过度产品做个清理，以免东西积累过多。
2.实验后的DNA和RNA要及时放回冰箱，以免时间长降解，特别是用水溶解的时候。
3.要及时甘油保存你鉴定出的细菌,每个细菌保存两份，存放在—80度冰箱里。
4.实验用的酶类虽然在室温下放一段时间也没什么问题,但还是要及时放回冰箱，以免活性降低。
5.要及时清理实验台面，保持干净,整洁，有序。
6.无菌操作台用后及时清理干净，操作真菌和细菌等最好不要交叉使用。
7.培养基使用的时候要注意无菌操作，移液器不要插入培养基中，之准许无菌枪头进入瓶子腔体，如培养基较少，可以倾斜瓶子,移液器取液体最好不要用到最大量程,以免吸液过猛导致与移液器接触。
8.灭好的培养基标签一定要写好，包括名称，日期，是否加抗生素，是否加抗生素非常重要，特别是在共用培养基的实验室。
9.实验用过的试剂盖子一定要盖好,以免挥发。
特别是有毒的物品，如氯仿，苯酚等，用完后的瓶子及时拿出实验室。
10.带手套接触有毒物品后，要及时处理掉手套。
不管是否接触过有毒物品，,不要戴着手套乱接触其他东西，如开窗等。
11.做实验过程中不要接电话,说话，考虑其他事情。
特别是PCR和配溶液的时候。
做PCR和配溶液的时候要把所用的试剂找全，一字排开,加完一种东西就把这种东西放到一边，可防止自己少加错东西。
12.同时作几个实验的时候一定要有定时器，防止自己忘记,特别是在煮东西，加热溶化溶液等危险操作的时候，切忌。
13.饭前，有活动前不要做实验，这时候匆匆忙忙非常容易出错，特别是作有危险的实验，更要注意。
14.作好试验记录，不管有没有结果,一定要坚持。
还有点用图片，测序结果等，如果不清楚记录东西多了,就乱了，混了。
这个一定要认真做好。
15.要随时写下自己的想法，因为有些想法稍纵即逝。
微生物实验注意事项一、无菌操作要求1。
接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。
2。
兽医微生物实验指导
兽医微⽣物实验指导兽医微⽣物实验教案实验⼀显微镜油浸系的使⽤及细菌基本形态构造的观察【⽬的要求】1.掌握正确使⽤及护理显微镜的⽅法，特别是油浸系的使⽤及护理。
2.正确认识细菌的基本形态和构造。
【油浸系的原理】油浸系是在油浸镜与标本之间加1滴⾹柏油，调整光源检查细菌标本的⽅法。
油浸镜是⼀种⾼倍放⼤的物镜，⼀般都刻有放⼤倍数，如95×、100×等。
其镜头标记国产镜多⽤“油”字表⽰，国外产品则⽤“Oil”(Oil Immersion)或HI(homogenmus Immersion)表⽰。
⽽且油镜的镜⾝较⾼倍镜和低倍镜为长，镜⽚最⼩，这也是识别的另⼀种标志。
其使⽤原理是由于⾹柏油与玻璃的折光率相似(⾹柏油为1.515，玻璃为1.52)。
镜检时，滴加⾹柏油的作⽤是使光源尽可能多的进⼊物镜中，避免光线通过折光率低的空⽓(折光率为1.O)⽽散失，因⽽能提⾼物镜的分辨率，使物像明亮清晰。
【器材及试剂】1.菌种：⼤肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌、细菌的三型等标本⽚；2.仪器：普通光学显微镜；3.材料：⾹柏油，⼆甲苯，擦镜纸等。
【操作步骤】(⼀)细菌基本形态构造的观察1.准备安置显微镜→调节光源→调节双筒⽬镜间距→调节聚光器数值孔径值。
将光圈完全开放，升⾼聚光镜与载物台同⾼，置标本⽚于载物台上，在低倍镜下对光，⽤于转动反光镜以调节之，⾄视野最亮时为⽌。
若⽤天然光源宜⽤反光镜平⾯，较弱光源⽤凹⾯。
检查未染⾊标本，光不宜太强，染⾊标本需强光。
光线强弱可通过放⼤或缩⼩光圈、升降聚光镜、旋转反光镜调节之。
2.观察将⾹柏油⼀滴滴于标本⽚有颜⾊的观察区，并置于载物台上，⽤⽚夹固定好，⽤推进器将观察区置于物镜正下⽅，依次⽤⾼倍镜→油镜观察。
⽤油浸镜检查，使油镜头浸⼊油滴中，⼏乎与标本⾯接触为度。
然后由接⽬镜注视镜内，同时慢慢转动粗调节螺旋提起镜筒(绝对不能下降镜筒)⾄能模糊看到物像时，再转动细螺旋(细螺旋转动⼀般不超过1周)，直⾄物像清晰为⽌。
微生物探究实验归类解法指导
③ 分 离得 到 纯 度 较 高的 圆褐 固 氮 菌和 酵 母 茵 ④ 圆
褐 固 氮 菌无 成 形 的 细 胞 核
，
可 分 离 纯 化 酵 母 菌 霉 菌 ；在 基 本 培 养 基 中加 入 高 浓
、
⑤ 圆褐 固 氮 茵 为 原 核 生
，
度 的食 盐 可 分 离 纯 化 金 黄 色 葡 萄球 菌
” F
’
，
微 生 物 的 数 量 可 以 根 据 菌 落 的 大 小 或 亚 甲基 蓝
分 离 得 到 纯 度 较 高 的 圆褐 固 氮 茵 和 酵 母 茵 ( 1 ) 实验 原 理
：
。
溶 液 褪 色快 慢 来 判 断
，
，
圆 褐 固 氮 茵 是 自生 固 氮 茵 能
而
甲基 蓝 溶液 褪 色 越 快 细 菌越 多 ；反 之 越 少
含 茵量 最低
(4 ) 好 氧性
10 5
电
—
劈 乎
染； 禽流感病毒是Ｒ Ｎ Ａ 病毒 ， 易变异 ， 而抗 体和记 ・
四 、影 响 细菌 生 长 繁殖 因素 的探 究实 验
三、 微 生 物 遗传 物 质 的 探 究 实验
微生物的遗传物质是Ｄ Ｎ Ａ 或Ｒ Ｎ Ａ，对于有细胞 细胞具有特异性 ， 可能被 感染
。
物 其 细 胞 壁 主 要 为 糖 类 和 蛋 白 质 而 酵母 茵则 不 同
二
、
、
_
、
打 例
。
1
某 同 学在 做 微 生 物 实 验 时 不 小 心 把 圆 褐
，
一
测 量 微 生 物 含量 的 实 验 在 相 同时 间 内 菌落 越 大 或 亚
。
细菌糖发酵试验实验指导标准操作
细菌糖发酵试验实验指导标准操作细菌的糖发酵试验是微生物学中常用的一种实验，用于检测细菌是否能够利用特定的碳源（通常是糖）进行代谢和发酵。
以下是一般的实验指导，以进行细菌的糖发酵试验。
一、材料和设备：1. 细菌培养物（已经培养并纯化的细菌）。
2. 不同类型的糖（如葡萄糖、乳糖、蔗糖等）。
3. 非糖碳源（对照组）。
4. 硝酸盐试剂（如Nessler试剂）。
5. 培养皿或试管。
6. 水浴或恒温箱。
7. 培养基和培养条件所需的实验室设备。
二、步骤：1. 从培养物中选取所需的细菌，并进行亚培养至对数生长期，以获得相对均匀的细菌悬浮液。
2. 在培养皿或试管中添加所需的糖溶液（通常浓度为1%或0.1M）。
同时，制备一个对照组，用不含糖的培养基或非糖碳源代替。
3. 向每个培养皿或试管中加入适量的细菌悬浮液，以确保初始菌落计数相似。
4. 密封培养皿或试管，以防止氧气进入。
5. 将所有培养皿或试管放置在水浴或恒温箱中，维持适当的温度（通常在35-37摄氏度），并培养一段时间（通常是24小时）。
6. 检查培养皿或试管的颜色变化。
如果发生发酵，细菌代谢产生的酸会改变培养基的pH，导致指示剂颜色的变化。
7. 如果培养物变为黄色或其他颜色变化，表示细菌进行了糖的发酵。
如果对照组未发生颜色变化，说明颜色变化是由于糖的代谢而不是其他因素引起的。
8. 记录实验结果，包括发酵阳性的细菌和发酵阴性的细菌，以及使用的糖类型。
请注意，糖发酵试验的具体步骤和条件可能会因细菌的种类和实验目的而有所不同。
因此，在进行实验之前，请仔细查阅相关文献或咨询实验室导师，以确保按照适当的方法进行。
此外，必须在合适的实验室安全条件下进行，遵循相关生物安全操作规程。
食品微生物实验技术指导书
实验一普通显微镜的使用和细菌形态观察1 目的(1)学习并掌握油镜的工作原理和使用方法。
(2)复习光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
2 原理微生物的最显著特点是个体微小，必须借助显微镜才能观察到它们的个体形态和细胞结构。
熟悉显微镜和掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。
实验将介绍目前微生物学研究中最常用的普通光学显微镜的结构和样品制作。
的在于使同学们通过实验，对光学显微镜有比较全面的了解，并重点掌握明视野通光学显微镜中油镜的使用。
3 材料3.1 菌种金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)染色玻片标本。
链霉菌(Streptomyces sp .)及青霉菌(Penicillium sp.)的水封片。
3.2 溶液或试剂香柏油、二甲苯。
3.3 仪器及其他用品显微镜、擦镜纸等。
4 流程安置一＞调光源一＞调目镜一＞调聚光器一＞镜检(低倍镜一＞高倍镜一＞油镜)一＞擦镜一＞复原5 步骤5.1 观察前的准备5.1.1 显微镜的安置置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约l0cm。
镜检时姿势要端正。
5.1.2 光源调节安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，若使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。
5.1.3 双筒显微镜的目镜调节根据使用者的个入情况，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有屈光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。
5.1.4 聚光器数值孔径值的调节正确使用聚光镜才能提高镜检的效果。
聚光镜的主要参数是数值孔径，它有一定的可变范围，一般聚光镜边框上的数字是代表它的最大数值孔径，通过调节聚光镜下面可变光阑的开放程度，可以得到各种不同的数值孔径，以适应不同物镜的需要。
5.2 显微观察在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。
微生物计数实验指导书
一、引言微生物计数是实验工作中不可或缺的一环，其准确性直接影响到实验的可靠性和重复性。
为确保微生物计数的结果准确可靠，本实验指导书详细规定了从样品采集与处理到结果分析与报告的整个实验流程。
通过遵循这些步骤，我们将能够优化微生物计数的操作，提高实验的精确性和可重复性。
二、样品采集与处理●(1) 采集样品为了获取具有代表性的微生物样品，我们需要采取科学的方法进行采样。
在采样过程中，我们必须特别注意避免污染和交叉污染，因为这将会对后续的实验结果产生严重的影响。
为了实现这一目标，我们建议使用无菌技术进行操作，并详细记录样品的来源、采集日期和时间等信息。
●(2) 样品处理在样品采集后，我们需要对其进行适当的处理，以便进行后续的微生物计数。
处理过程包括样品稀释、均质化和过滤或离心等步骤。
样品稀释的目的是使微生物分布均匀，便于计数；样品均质化的目的是确保微生物在样品中的分布是随机的；而样品过滤或离心的目的是去除杂质，提高计数的准确性。
三、计数方法选择●(1) 直接计数法显微镜计数、菌落计数和流式细胞仪计数是直接计数法的三种主要方法。
显微镜计数是通过显微镜直接观察并计数微生物；菌落计数是通过培养微生物并在培养基上形成菌落来计数；流式细胞仪计数则是利用流式细胞仪对微生物进行快速、准确的计数。
●(2) 间接计数法间接计数法包括ATP生物发光法、酶联免疫吸附法、实时荧光定量PCR等。
ATP生物发光法是通过测量微生物体内ATP的含量来间接计数；酶联免疫吸附法是利用特异性抗体与微生物抗原结合来计数；实时荧光定量PCR则是通过PCR扩增特定基因片段来计数微生物。
四、培养基选择与制备●(1) 培养基选择为了确保目标微生物能够在培养基上良好地生长和繁殖，我们需要根据微生物的种类和生长需求选择合适的培养基。
在选择培养基时，我们还需要考虑培养基的营养成分和pH值，以确保培养基能够满足目标微生物的生长需求。
此外，我们还应选择具有选择性和抑制性的培养基，以减少非目标微生物的干扰。
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. . 实验一 微生物培养基的配制和灭菌 培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件：(1)适当组分和比例的营养物质；(2)适宜的pH值；(3)合适的渗透压；(4)保持无菌状态。所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料。培养基的配制是微生物工作者的主要技术操作之一。
一、实验目的与耍求： 1．了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。 2．了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 3．熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。
二、实验原理与材料： (一) 培养基的种类 根据培养基的组成成分，可将培养基分为三类：合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 半合成培养基：由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。 天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成的。 从培养基的物理状态来分： 液体培养基：不加凝固剂。 固体培养基：在液体培养基中加2％左右的凝固剂。 半固体培养基：在液体培养基中加入0.2％一0.5％凝固剂。 微生物最常用的凝固剂为琼脂(其次为明胶)，又叫洋菜、冻粉。它不是一种营养物质，只能被极少数种类的细菌分解利用。琼脂是从海藻中(主要是石花菜)提取而制成的。是一种多糖类化合物，主要成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐，琼脂是一种可逆性胶体，在常规浓度下加热到96℃以上即成溶胶状态，融化的琼脂，当温度下降到42℃以下，又凝固为固体。
表3-1 琼脂与明胶特性比较 比较项目 琼 脂 明 胶 比较项目 琼 脂 明 胶
熔点(℃) 凝固点(℃) 酸碱度 灰 分(％) 氧化钙(％) 氯化镁(％) 氮(％) 96 40 微酸 16.0 1.15 O.77 O.40 25 20 酸性 14.0—15.0 0.0 0.0 18.3 微生物可利用性 耐热性 来 源 化学本质 常用浓度（％) 绝大多数微生物不能水解利用 强 植物 多糖 1.5—2 部分微生物能水解利用
弱 动物 蛋白质 5一12
（二）实验材料 1．药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂；马铃薯，蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、 KN03，MgS04·7H20、FeSO4·7H20、等。 2．高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌。 3．其它：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。 . . 三、实验方法与步骤： (一)、培养基的配置 1．培养基的配制常用方法和步骤： (1)称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于搪瓷杯中。 (2)溶化：在搪瓷杯中加入所需水量(根据实验需要加入蒸馏水或自来水)，用玻棒搅匀，加热溶解。 (3)调pH值(调pH也可以在加琼脂后再调)，用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。 (4)加琼脂熔化，在琼脂熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全熔化后，补足所失水分，一般数量少，时间短不必补水。 (5)分装：在漏斗架上分装。根据不同的需要进行分装，一般制斜面的装量为管高的五分之一。 特别注意不要使培养基粘污在管(瓶)口上以免浸湿棉塞，引起污染。 (6)包扎成捆、挂上标签。培养基分装好后，塞上棉塞，用防水纸包扎成捆，挂上所配培养基名称的标签。 (7)灭菌备用。灭菌后如需制成斜面的，应在下磅后取出，摆成斜面，(见图3一1)。培养基经灭菌后，必须放在37℃恒温培养箱中培养24小时，如确无菌生长，方可使用。
2．三种培养基的配方及配制 （1）.牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(用于分离和培养细菌，是一种天然培养基)。 配方： 牛肉膏 3克 蛋白胨 5克 氯化钠 3克 琼脂 20克 自来水 1000毫升 pH 7．2～7．4 灭菌 15磅／英寸2，30分钟。 本实验将原配方配成各种浓缩液。各种浓度如下：30％牛肉膏、50％蛋白胨，30％氯化钠。以配制200毫升培养基为例： 吸取30％牛肉膏2毫升，50％蛋白胨2毫升，30％氯化钠2毫升，加入有刻度的搪瓷烧杯中，然后用自来水补足到200毫升。用玻捧搅匀，在电炉上稍加热，调pH至7.4，加琼脂4克，加热熔化，用玻棒不断搅拌，至琼脂完全溶解为止，趁热在漏斗架上装试管，(见图3—2)。装带有棉塞的无菌试管，装置五分之一的试管高度共12支，作斜面培养基。用铝壳试管帽的各装10毫升，约试管高度的二分之一以上，用作分离时倒平板用。 分装完毕，以12支为一捆，用防水纸包扎成捆，(图3—3)挂上标签，灭菌备用。 .
. （2）．马铃薯(或豆芽汁)蔗糖(或葡萄糖)琼脂培养基。(用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基)。 配方：去皮马铃薯(或鲜豆芽) 200克 蔗糖(或葡萄糖) 20克 自来水 1000毫升 琼脂 20克 pH 自然 灭菌：(含蔗糖)15磅／英寸2 30分钟。 (含葡萄糖)10磅／英寸220分钟。 制备方法：配制200毫升培养基。 取去皮马铃薯40克，切成小块，放入无刻度的搪瓷杯中，加水200毫升，置电炉上加热，煮沸十分钟，用四层纱布过滤至具刻度的搪瓷杯中，滤液加水补足至200毫升，然后加蔗糖4克，加琼脂4克，加热熔化，并用玻棒不断搅拌，直至琼脂完全熔化，分装试管，下面一系例步骤同配细菌培养基相同。 （3） 淀粉琼脂培养基(高氏一号Gause’S1)，用于分离和培养放线菌之用，是一种合成培养基。 配方：可溶性淀粉 20.O克 KN03 1.0克 K2HP04 O.5克 . . MgS04·7H20 O.5克 NaCl O.5克 FeS04·7H20， O.01克 琼脂 20克 自来水 1000毫升 灭菌：15磅／英寸2，30分钟。 制备方法：配制200毫升培养基 吸取配方液：1％ KN03 20毫升；l％ K2HP04 lO毫升；l％ MgSO4·7H2O lO毫升；l％NaCl 10毫升；1％FeSO4·7H2O O.2毫升，加水补足至200毫升，置电炉上加热。用另一只搪瓷杯称取可溶性淀粉4克，从200毫升中取出少量加入淀粉中，用玻棒调成糊状，待液体沸腾后，将淀粉糊洗入培养液中，搅匀，取下调pH至7.4，加琼脂4克，加热至琼脂完全熔化为止，趁热分装试管，下面一系例步骤同于配制细菌培养基的操作方法。 （4）．无菌水的制备： 无菌水，为下一次微生物分离实验中所需用的材料。 100毫升三角瓶(装有玻璃珠)，装自来水45毫升，试管中装9毫升自来水，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。三角瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。
(二)分离培养微生物常用器皿的准备 1．清洗一些玻璃仪器：如三角瓶，试管，培养皿、吸管等。 2．棉塞的制作：装培养基和分离培养需用的部分玻璃器皿，需加棉花塞。棉塞的作用为过滤空气，使试管内外空气可以流通，但外界空气中杂菌不能进入，避免污染。试管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口约l～2毫米处，用解剖针塞入少许棉花，(约1—1.5厘米长)，以防止细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得松紧适宜。吹时以能通气但不使棉花滑下为准。 教师示范做试管棉塞，同学每人做5支试管棉塞。棉塞要求不紧不松，两头光滑，试管棉塞的长度约3厘米左右。塞入试管内部分约占2／3，头部稍大约占l/3左右，见图3—4。
1 2 3 4 5 . 图3-4 棉塞的要求条件 1.正确的式样 2.管内部太短，管外太松 3.管外太小 4.整个棉塞过松 5. 管内部太紧，管外太松
3．包装培养皿和吸管等。为了使培养皿、吸管，三角玻棒等洗净，干热灭菌后，不让表面暴露，以保证无菌状态，为此干热灭菌前先用旧报纸包装妥当(见示范)，每组同学包培养皿6只(一包)。 吸管的包装，将塞好棉花的吸管尖端，放在4～5厘米宽的长纸条的一端，约成45º角，折叠纸条，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。见图3—5。 . . (三)培养基和玻璃器材的灭菌方法 灭菌的方法，通常可以分为四大类：(1)加热灭菌：包括直接灼烧灭菌、干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮沸消毒；(2)过滤去菌；（3）射线灭菌和消毒；(4)化学药剂灭菌和消毒。在本实验中，以介绍与培养基和玻璃器材灭菌有关的部份灭菌方法。 1．干热灭菌法(即热空气灭菌法)： 干热灭菌—般是利用电热烘箱作为干热灭菌器。前面所包装好的玻璃器皿，如带棉塞的三角瓶，试管、包装好的吸管、培养皿等 ，放入电热烘箱中。 打开烘箱顶部的通气孔，接上电源加热，使箱内空气的温度达到160℃一170℃，关闭通气孔，使箱内的温度保持在160℃左右，并维持1.5—2小时。时间一到，切断电源。待温度下降至60一70℃以下，方可打开箱门取灭菌物品，否则骤冷后易使箱内玻璃仪器破损。 2．加压蒸汽灭菌法 利用高压灭菌器，使水的沸点在密闭的灭菌器内随压力升高而增高(见表3—2)，来提高蒸汽的温度和灭菌的效率。
蛋白质含水量(%) 凝固温度(℃) 50 25 18 6 O 56 74—80 80—90 145 160一170